心肌缺血再灌注損傷及其潛在治療靶點LCN2的研究進展

朱香梅，石雨荷，李晴，朱玨，劉湘丹，3，王智，3，童巧珍，3*（1.湖南中醫藥大學藥學院，長沙 410208；2. 湘產大宗道地藥材種質資源及規范化種植重點研究室，長沙 410208；3. 湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 410208）

冠心病（coronary heart disease，CHD），又稱為缺血性心臟病，是最常見的心血管疾病，由于心肌供血中斷而導致冠狀動脈阻塞的一種心肌病變[1]。目前，在我國心血管病中心發布的《國家心血管病報告2018》中，心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患病人數已接近3 億，同時死亡率高居首位，遠超腫瘤及其他疾病[2]。冠心病最直接的后果是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），對于減少心肌梗死面積最有效的治療是及時進行再灌注。臨床上常采用再灌注治療來改善梗死區的血液循環，但往往會導致心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。MIRI 與多種病理生理特征有關，包括鈣超載、氧自由基生成、內皮功能障礙、免疫反應、線粒體功能障礙、心肌細胞凋亡和自噬以及血小板聚集[4]。通過對基因表達綜合數據庫的分析，研究者發現脂質運載蛋白-2（lipocalin-2，LCN2）是MIRI 的潛在治療靶點[5]。LCN2 也稱為嗜中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）或24p3，是一種25 kDa的分泌蛋白，它可以被許多細胞分泌，如巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞、心肌細胞、肝細胞和脂肪細胞[6]。LCN2 可調節缺血再灌注的心臟功能，作為顯性心臟病的診斷和預后標志物[7]，并且LCN2 在其他疾病中的作用也十分廣泛。本文綜述了近幾年MIRI 的發生機制、相關通路及其潛在治療靶點LCN2 相關的研究進展。

1 MIRI 發生機制

當器官的血液供應中斷（缺血）然后重新建立（再灌注）時，就會發生缺血再灌注損傷，導致線粒體中活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的“爆發”。MIRI 是引發心肌細胞壞死和凋亡的一種病理過程，尤其是當冠狀動脈灌注恢復時。血流的重建通過ROS 的積累、細胞離子穩態的干擾和細胞死亡的炎癥反應觸發缺血組織的進一步損傷，而ROS 能夠刺激組織炎癥并誘導NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥體激活，從而引發無菌性炎癥疾病[8]。心肌缺血再灌注時，氧化能力極強的氧自由基通過攻擊膜成分中的不飽和脂肪酸，生成脂質過氧化物，引起細胞膜功能單位結構和功能的障礙[9]。有研究發現在心肌缺血后，心肌組織中便能觀察到少量氧自由基的產生，而再灌注后數秒鐘至一分鐘后以后氧自由基快速增長到35%[10]。此外，心肌缺血時心肌膜結構損傷，Na+/Ca2+離子通道異常，細胞外鈣離子呈濃度梯度進入細胞內，引起心肌鈣超載，并且在心肌再灌注時加重，鈣超載引發線粒體膜通透性轉換孔（mito-chondria permeability transition pore，mPTP）開放、線粒體膜電位異常、促凋亡因子釋放等，最終導致心肌細胞死亡[11]。黃艷平等[12]研究發現內嗎啡肽-1（EM-1）可能通過抑制mPTP 的開放，保持線粒體結構和功能的完整性，減少線粒體中細胞色素C（Cyt-C）的釋放，下調相關凋亡蛋白caspase-3 的表達，減少心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用。MIRI 的發生一般由炎性反應、氧化應激、線粒體功能障礙、細胞內鈣超載等多種因素導致。由于MIRI 的發生較復雜，還需要對其病理機制進一步深入研究。

2 MIRI 的相關信號通路

2.1 促損傷作用相關的信號通路

核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一種能調節基因表達的核轉錄因子，在包括缺血性病理學在內的許多疾病中的細胞凋亡和炎癥信號傳導非常重要。不活躍的NF-κB 位于細胞質中，當NF-κB 被激活時，IκB-α被IκB 激酶（IKKβ）磷酸化，然后降解，導致NF-κB 亞基從細胞質轉移到細胞核。早期研究證明NF-κB 通路在MIRI 中是誘導心肌細胞氧化應激啟動和炎癥反應發生的一個重要途徑，而槲皮素、赤芍總苷、絞股藍皂苷、紅景天苷和三七皂苷R1可以通過抑制NF-κB 信號通路保護缺血心肌[13]。Kim等[14]研究發現三白草酮通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 和Jun 激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）信號通路的磷酸化從而保護局部MIRI。缺血再灌注過程中，先天免疫的激活是急性炎癥反應的重要組成部分。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是種系編碼的跨膜蛋白，來源于Toll 基因家族，在檢測許多微生物模式和激活先天免疫系統中起著至關重要的作用。TLRs 家族成員主要有13 個（TLR1 ～13），它們在心臟細胞中都會表達，其中TLR4 在心肌細胞中表達最高[15]。缺血再灌注損傷時的炎癥反應與TLRs 密切相關，TLR4 缺陷小鼠心肌缺血再灌注時，炎癥和組織損傷也明顯減輕，并且吳茱萸次堿可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護缺血心肌[16]。此外，Wnt 信號在心臟中是靜止的，但受到損傷后會被激活，而在MIRI 過程中，激活Rho/Rho 激酶信號通路調節細胞凋亡途徑可促進心肌進一步損傷[11，17]，目前這條通路在MIRI 的機制研究中報道較少。

2.2 保護作用相關信號通路

磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）通過影響下游絲氨酸/蘇氨酸激酶（PKB 或稱為Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶3β（GSK3β）等蛋白通路，抑制心肌細胞凋亡，減輕氧化應激造成的細胞損傷，同時有效減少了心肌中的炎癥反應，最終在MIRI 過程對心肌起到保護作用。Liao 等[18]研究發現胰島素樣生長因子-1（IGF-1）可通過抑制心肌細胞凋亡來保護缺血再灌注損傷的心臟，且IGF-1 的抗凋亡作用是通過激活PI3K/Akt 通路介導的。GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制其磷酸化可激活核因子E2 相關因子2（Nrf-2）相關通路，發揮氧化應激作用，進而改善MIRI[19]。Sulaiman 等[20]發現對氧磷酶2（PON2）可通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，減少心肌細胞線粒體功能障礙和氧化應激，保護心肌免受急性缺血再灌注損傷。內皮細胞雖然對缺血不太敏感，但與心肌細胞相比，它們對心臟缺血再灌注非常敏感，缺血再灌注通過破壞內皮屏障功能增加內皮通透性，進而加劇缺血再灌注后心肌的炎癥。Kong 等[21]研究結果表明熱休克蛋白A12B（HSPA12B）過度表達可通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號來改善內皮完整性減輕急性MIRI，而靶向HSPA12B 表達可能是治療MIRI 的另一種治療方法。

3 LCN2 的概述

3.1 LCN2 的結構

LCN2 是由198 個氨基酸殘基組成的分泌型糖蛋白，LCN2 老鼠同系物用Lcn2 或Ngal 表示[22]。與大多數其他蛋白質家族不同，lipocalin成員是根據其氨基酸序列的相似性來鑒定的，共享更少的序列同一性。LCN2 作為脂質運載蛋白，主要功能是運輸親脂性小分子，與脂質運載蛋白家族成員共享一個二級和三級結構特征——脂質運載蛋白折疊，這是它們作為各種配體的轉運或載體蛋白的基本功能[23]。與lipocalin 家族的其他成員一樣，LCN2 具有3D 桶狀結構，它的結合位點具有極性，并且它的寬度足以與某些蛋白質結合[24]。LCN2 的極性結合位點結合的是硫酸鹽離子或不定共純化脂肪酸[25]。Coles 等[26]通過核磁共振闡明了人類LCN2 的三維結構，結果顯示LCN2 包含1 個氮端310螺旋，然后是8 個反平行的β鏈，1 個α螺旋和1 個碳端β鏈，β鏈形成1 個桶狀結構，其壁由2 個β片組成，第一個由β2 ～β4 鏈組成，第二個由β6 ～β8 鏈組成，另外還觀察到3 個β凸起，其中1 個在第1β鏈和2個在第6β鏈。正是這種空腔和結構的多樣性導致了LCN2 各種不同的結合模式，每種模式都能夠適應不同大小、形狀和化學特性的配體。

3.2 LCN2 的受體

LCN2 蛋白屬于lipocalin 蛋白家族的一員，被歸類為轉運蛋白，其結構和功能均具有多樣性[27]。LCN2 受體有3 種：黑素皮質素受體4（MC4R）、LCN2R、脂蛋白受體相關蛋白2（LRP2）。MC4R 主要在下丘腦室旁核中表達，在能量平衡中起著核心作用。LCN2R 是一種內吞受體，進入細胞參與鐵穩態的控制，LRP2 是一種多配體內吞受體，在多種細胞中表達，已有研究證實了LCN2R 在內髓集合管（IMCD）細胞中的頂端表達[28]，LCN2 與LRP2 之間的相關性具有最高的預測置信度，早期研究認為LRP2 可能作為LCN2 的細胞受體，協助其細胞攝取[29]。LRP2 在許多類固醇反應組織中表達，如男性和女性生殖器官；在非哺乳脊椎動物中，LRP2 在其生長和發育過程中起著重要作用[30]。Plieschnig等[31]研究發現LCN2-LRP2 復合物對人類先天免疫反應的結構有較大影響。此外，成骨細胞衍生的LCN2 還可以穿過血腦屏障，與下丘腦室旁核和腹內側神經元中的MC4R 結合，并激活MC4R依賴的厭食（食欲抑制）途徑，表明LCN2 是一種具有代謝調節作用的骨源性激素，以MC4R 依賴的方式抑制食欲[32]。

4 LCN2 的表達

LCN2 具有多種作用，包括鐵轉運、趨化作用和抑菌作用。LCN2 作為一種生長因子，可以促進細胞分化和增殖[33]。有研究發現糖皮質激素暴露顯著增加絕經前女性皮下和網膜脂肪組織中Lcn2基因的表達，但絕經后女性中Lcn2基因的表達沒有增加[34]。另外，脂多糖（LPS）、IL-6、IL-17、IFN-γ等促炎細胞因子可誘導LCN2的表達，表明LCN2 在促炎反應中起重要作用[35]。LCN2 在包括血漿、血清、尿液和心包液在內的樣品中以多種變體形式存在。LCN2 可以以130 kDa LCN2-基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）復合物的形式存在，或者以25 kDa 單體或56 kDa 同型二聚體存在于健康個體中[36]，臨床研究表明，LCN2 表達增加與異位疾病（心血管疾病、腸道炎癥、神經炎癥）以及其他代謝疾病（2 型糖尿病和肥胖）密切相關[37]。因此，LCN2 被認為是許多病理狀況的可靠生物標志物。

4.1 心臟組織

心臟是一個新陳代謝高度活躍的器官，其鐵平衡尤為重要。越來越多的證據表明，LCN2 是一種促炎癥因子，與肥胖相關的心血管并發癥緊密相連，被認為是急性心力衰竭患者心腎綜合征早期檢測的生物標志物[38]，可通過升高細胞內鐵水平誘導心肌細胞凋亡，介導對心臟功能的有害影響[39]。LCN2 水平升高與心肌肥厚密切相關，體外研究證明了LCN2 在心肌細胞肥大和心肌細胞增殖減少的源頭中發揮直接作用[40]。Xiong 等[41]研究發現LCN2 是miR-138 的直接靶點，miR-138 過度表達通過下調LCN2 的表達抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。LCN2 在缺血再灌注后心臟病變的發展過程也占有重要地位。在心臟移植后的缺血再灌注小鼠模型中，使用抗LCN2 抗體可減少巨噬細胞和中性粒細胞向缺血區的浸潤，抑制巨噬細胞的M1 極化，從而減輕MIRI[42]。Yang 等[7]研究結果表明抑制LCN2 表達可改善缺血再灌注小鼠離體心臟的功能，與線粒體功能恢復和磷脂重塑有關。另外，LCN2 可通過與含鐵細菌鐵載體結合，從而限制細菌生長，在細菌感染的先天免疫反應中發揮關鍵作用[43]。鐵參與調節各種細胞機制，包括氧化應激、線粒體功能障礙、內質網應激和自噬，所有這些都可能在受到干擾時導致心臟功能障礙，而LCN2 與鐵超載及缺鐵性心肌病的關系還在研究中[44]。臨床研究證實了心肌梗死患者血漿中的LCN2 水平較正常人明顯升高，且敏感性強，推測其可與心肌酶譜CK-MB、肌鈣蛋白I（cTnI）一起作為心肌梗死早期預測和診斷的指標[45]。

4.2 肝臟組織

肝臟是脂肪和碳水化合物代謝的重要器官，肝臟的功能損害直接影響整個生物體。Xu 等[46]研究發現肝細胞是導致細菌感染或肝部分切除術（PHx）后血清LCN2 蛋白水平升高的主要細胞類型。LCN2 過表達可阻止新生脂肪生成、脂質過氧化和細胞凋亡，從而預防脂肪性肝炎，而促炎性TNF-α、IL6 和抵抗素治療可上調HepG2 細胞中的LCN2，因此，LCN2 被認為是肝臟對炎癥的保護成分[47]。LCN2 是肝臟脂質穩態的關鍵調節劑，通過調節脂滴包被蛋白5（PLIN5）的表達來控制細胞內脂滴的形成，用于治療與脂肪堆積和脂肪變性相關的肝病[48]。此外，Alwahsh 等[49]的研究證實了果糖飲食上調肝臟LCN2 的表達，這與氧化應激和線粒體功能障礙指標的增加有關，LCN2 可能參與肝臟保護。在多種肝發病機制模型中LCN2 表達水平有明顯變化，如急/慢性肝損傷、非酒精性脂肪性肝病、急/慢性肝衰竭等病中LCN2 表達水平升高[50]，因此，LCN2 是一種值得信賴的肝損傷生物標志物。

4.3 其他

LCN2 開始在胚胎階段表達，在腎臟、肺、骨骼、大腦等器官組織中被激活。Karoui 等[51]研究發現白蛋白通過鈣依賴性內質網應激激活導致LCN2 過度表達，進而觸發腎小管細胞凋亡和腎損害。LCN2 在脂多糖誘導的急性肺損傷中具有診斷作用，小鼠肺和血液中LCN2 的表達均顯著上調[52]。Costa 等[53]研究發現骨骼中的LCN2 過度表達通過調節關鍵分泌因子和細胞因子的表達來改變骨髓微環境，從而調節造血干細胞生態位行為，同時增強幼鼠的造血干細胞定位和老年小鼠的紅細胞產生。當然，LCN2 的不平衡表達也與一些器官組織中腫瘤的形成和發展有關。有研究報道LCN2 的表達與子宮內膜癌侵襲性腫瘤特征、遠處轉移擴散和生存率降低有關[54]，臨床研究表明，MMP-9/LCN2 復合物水平的升高與胃癌患者生存率的降低相關[55]。Villodre 等[56]首次證明了LCN2在乳腺癌患者中的表達水平顯著升高，并且LCN2 促進了乳腺癌異種移植小鼠模型中的腫瘤生長、皮膚浸潤和轉移。LCN2 在多種癌癥中過度表達，通過促進腫瘤細胞生存、生長和轉移加快腫瘤的發展，提示LCN2 可作為腫瘤化療敏感性的潛在靶點。

5 LCN2 與MIRI 相關信號通路的研究

隨著MIRI 在分子生物學領域研究的不斷深入，越來越多的細胞信號轉導通路被證實在MIRI 過程中通過影響各種損傷機制發揮著關鍵的調控作用，而LCN2 是許多疾病相關信號通路的介質。Huang 等[57]研究發現維生素D 促進LCN2 啟動子甲基化以抑制LCN2 蛋白表達，減少LCN2-核糖體蛋白S3（RPS3）結合、RPS3-NF-κB 結合，從而增加了腫瘤對順鉑的化療敏感性。Song 等[58]發現了LCN2 在心功能不全發展中的新機制，LCN2 通過釋放危險相關分子模式（DAMP）高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和隨后的TLR4 依賴性信號，誘導NLRP3 炎癥體激活，而NLRP3 炎癥小體激活會影響糖尿病和心血管疾病。此外，有研究表明LCN2 可以通過PI3K/AKT/MTOR 信號通路抑制炎癥，揭示了LCN2 在肝臟保護中的作用機制、通過激活ERK/GSK3β/β-連環蛋白信號通路促進卵巢癌細胞增殖和遷移[59-60]。LCN2 是Wnt/β-catenin 信號轉導的下游靶點，可能作為一種適應性措施被激活，以應對高滲壓引起的應激[28]。LCN2/JAK2-STAT3 通路參與了脊髓損傷后神經毒性小膠質細胞和星形膠質細胞的激活，已被證實是一種有希望的治療策略[61]。目前，LCN2 在MIRI 促進損傷、產生保護作用信號通路的研究較少，尤其是LCN2 如何調控各信號通路影響MIRI 的進展尚不清楚，需要進一步的實驗證明。

6 結論及展望

MIRI 的損傷機制主要包括氧化應激、鈣超載、炎癥反應、線粒體代謝障礙、血管內皮功能障礙和細胞自噬。不同細胞信號通路通過調控不同的MIRI 機制產生不同的作用，促損傷效應NF-κB、TLRs、Wnt 信號通路病理生理機制是氧化應激和細胞凋亡、炎癥反應、細胞壞死和細胞凋亡、鈣超載、細胞纖維化和炎癥反應。PI3K 的下游Akt、mTOR、GSK-3β等蛋白通路病理生理機制主要是氧化應激、炎癥反應和鈣超載。有研究證明LCN2 敲除小鼠在心肌梗死后心臟纖維化和炎癥減輕，心臟功能良好[62]。MIRI 病理機制研究的不斷完善，有助于挖掘更多與其相關的潛在治療靶點，為缺血性心臟病相關疾病或其并發癥的治療提供參考。

LCN2 作為心臟缺血再灌注損傷期間炎癥的潛在調節因子，在多種組織中表達上調，如心臟、肝臟、多種黏膜組織、肺和上皮組織，在這些組織中，LCN2 表現為急性期蛋白。在首次將LCN2 作為保證免疫平衡的重要因素后，LCN2的功能進一步擴展到許多生物過程，包括炎癥、中毒、免疫防御、癌癥等。在心肌缺血再灌注的早期階段，對心肌細胞自噬的減弱增加了對應激誘導的細胞死亡的敏感性，而缺乏LCN2 卻能夠在缺血后引發更高的自噬反應，并免受細胞死亡和心臟功能障礙的影響。LCN2 是否可以作為心臟相關疾病生物標志物或者作為一個可靠的治療靶點，還需要大量研究進一步證明。