離子色譜法測定鹽酸二甲雙胍藥物中二甲胺的含量

儲韞婧，邵方嫻，陳民輝*，馮芳（. 中國藥科大學藥物分析教研室，南京 98；. 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 009）

鹽酸二甲雙胍是治療二型糖尿病的首選藥[1]，能有效降低患者血糖，改善胰島素抵抗，并對糖尿病并發癥糖尿病視網膜病變有效[2-3]，對糖尿病相關的腎臟并發癥也有改善作用[4-5]。鹽酸二甲雙胍由鹽酸二甲胺和雙氰胺通過加熱縮合反應合成[6]，二甲胺具有毒性，對皮膚及眼睛有刺激損傷作用[6]，易與亞硝酸鹽生成基因毒性雜質N-亞硝基二甲胺（N-nitroso dimethylamine，NDMA）[7]。控制鹽酸二甲雙胍藥物中二甲胺的含量，有利于降低患者的用藥風險。目前國內外藥典均有鹽酸二甲雙胍及其制劑的收載，其中美國藥典43 版[8]、日本藥局方18 版[9]和《中國藥典》2020年版[10]均未對二甲胺雜質進行限度控制，僅歐洲藥典10.1 版[11]和英國藥典2021 版[12]中收載了鹽酸二甲雙胍中二甲胺（雜質F）的檢測方法及限度，限度均規定為0.05%。二甲胺沒有紫外吸收，且極性強[13]，在反相色譜柱上沒有保留，采用柱前衍生化使二甲胺形成具有紫外吸收的衍生化產物，同時改善二甲胺在反相色譜柱上的色譜行為，從而滿足高效液相色譜法[6，14]的檢測要求。歐洲藥典和英國藥典以2，4-二硝基氟苯為柱前衍生化試劑，采用高效液相色譜法對二甲胺進行測定。柱前衍生化法前處理過程復雜，衍生化試劑具有毒性。氣相色譜檢測法[15]和氣相質譜聯用法[16]可以實現二甲胺的直接檢測，但藥物中二甲胺常以鹽酸二甲胺形式存在，樣品制備時需要使用強堿性溶液將鹽酸二甲胺轉化成二甲胺[7]，操作煩瑣且易損傷色譜柱，定量限只能達到微克級別[7，17]。液相質譜聯用法[17]適用于二甲胺的檢測，操作簡便，靈敏度高，但需要使用特殊的HILIC 親水色譜柱以改善二甲胺的保留行為，過低質量數的分子離子峰易受干擾。近年來，離子色譜也廣泛應用于二級胺和三級胺的檢測[18]，離子色譜法[19-21]測定藥物中二甲胺，不需要進行衍生化，且靈敏度高，但離子色譜法用于鹽酸二甲雙胍片劑及緩釋制劑中鹽酸二甲胺檢測尚未見報道。本研究旨在建立一種簡便、準確且靈敏度高的分析方法用于檢測鹽酸二甲雙胍及其制劑中鹽酸二甲胺的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICS-6000 離子色譜儀（配有CDRS-600 4 mm 陽離子抑制器、ICS-6000 DC-6 電導檢測器、ST16R 型冷凍離心機，美國賽默飛世爾公司）；XA205 型號電子天平（梅特勒·托利多公司）；Mili-Q 純水儀（美國Millipore 公司）；IKA MS3 digital 渦旋振蕩器（德國IKA 公司）、CPX8800H-C型超聲波清洗器（必能信超聲有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸二甲胺對照品（批號：183726M-YX-01，純度：100%，STD）；乙腈（色譜純，美國Honeywell 公司）；超純水（電阻率為18.2 MΩ，美國Millipore 公司）；鉀元素標準溶液（GSB1304-1733-2004，1000 μg·mL-1）、鈉元素標準溶液（GSB1304-1738-2004，1000 μg·mL-1）、鈣元素標準溶液（GSB1304-1720-2004，1000 μg·mL-1），（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；氯化銨（批號20190516，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸二甲雙胍原料藥、膠囊、鹽酸二甲雙胍片與緩釋片均為市售樣品。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸二甲胺對照品90.4 mg（約相當于二甲胺50 mg）置20 mL 量瓶中，用10%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，即得對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量，用10%乙腈溶液稀釋成含二甲胺5 μg·mL-1的原料、膠囊及片劑的對照品溶液；用50%乙腈溶液稀釋成含二甲胺2.5 μg·mL-1的緩釋片對照品溶液。

2.1.2 系統適用性溶液 分別以10%乙腈溶液和50%乙腈溶液作為溶劑，配制含K+、Na+、Ca2+、DMA、NH4+各1 μg·mL-1的混合溶液。

2.1.3 原料、膠囊及片劑系列標準曲線溶液 精密移取對照品儲備液適量，用10%乙腈溶液稀釋成含二甲胺分別為0.050、0.10、1.0、5.0、10 和50 μg·mL-1的原料、膠囊及片劑的系列標準曲線溶液。

2.1.4 緩釋片系列標準曲線溶液 精密移取對照品儲備液適量，用50%乙腈溶液稀釋成含二甲胺分別為0.025、0.050、0.50、1.0、2.5 和5.0μg·mL-1的緩釋片的系列標準曲線溶液。

2.1.5 原料及膠囊供試品溶液 取原料藥或膠囊內容物適量（約相當于鹽酸二甲雙胍200 mg），精密稱定，置15 mL 離心管中，加入1.0%乙腈溶液2 mL，超聲10 min，渦旋1 min，10 000 r·min-1離心5 min，精密量取上清液1 mL 置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，作為鹽酸二甲雙胍原料和膠囊的供試品溶液。

2.1.6 片劑供試品溶液 取本品粉末適量（約相當于鹽酸二甲雙胍200 mg），精密稱定，置15 mL 離心管中，加入10%乙腈溶液2 mL，超聲20 min，渦旋10 min，10 000 r·min-1離心8 min，精密量取上清液1 mL 置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，濾過，取續濾液作為鹽酸二甲雙胍片的供試品溶液。

2.1.7 緩釋片供試品溶液 取本品粉末適量（約相當于鹽酸二甲雙胍200 mg），精密稱定，置50 mL 離心管中，加入5.0%乙腈溶液20 mL，渦旋30 min，10 000 r·min-1離心8 min，精密量取上清液5 mL 置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，濾過，取續濾液作為鹽酸二甲雙胍緩釋片的供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性

采用陽離子交換柱Dionex IonPac CG12A（4 mm×50 mm）為保護柱、Dionex IonPac CS12A（4 mm×250 mm）為分析柱，甲磺酸溶液為淋洗液，梯度洗脫：0 ～10 min（10 mmol·L-1），10 ～11 min（10 →30 mmol·L-1），11 ～28 min（30 mmol·L-1），28 ～29 min（30 →10 mmol·L-1），29 ～35 min（10 mmol·L-1），流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，抑制電導檢測，抑制電流88 mA，檢測器溫度35℃，抑制器溫度20℃，進樣體積25μL。理論塔板數按二甲胺峰計大于5000，各峰之間的分離度均大于1.5（見圖1）。出峰順序為Na+→NH4+→二甲胺→K+→Ca2+。

圖1 二甲胺測定的系統適用性色譜圖Fig 1 System suitability for the determination of DMA

2.3 專屬性

將空白溶液、對照品溶液及不同劑型的供試品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖（見圖2）。二甲胺峰與相鄰色譜峰分離度較好，分離度均大于1.5，且空白不干擾DMA 檢測，方法專屬性良好。

圖2 二甲胺測定的專屬性色譜圖Fig 2 Specificity for the determination of DMA

2.4 檢測限、定量限和線性關系

分別取原料、膠囊及片劑的系列標準曲線溶液和緩釋片的系列標準溶液，照“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行回歸，繪制標準曲線。將原料、膠囊及片劑的系列標準曲線溶液和緩釋片的系列標準溶液分別逐級稀釋，以信噪比為3（S/N＝3）和信噪比為10（S/N＝10）計算二甲胺的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。結果見表1。

表1 二甲胺定量限、檢測限和線性范圍Tab 1 LOD，LOQ and linearity of DMA

2.5 進樣精密度試驗

分別取原料、膠囊及片劑的對照品溶液和緩釋片的對照品溶液，照“2.2”項下色譜條件注入離子色譜儀并記錄色譜圖，連續進樣6 次，峰面積的RSD分別為0.20%和0.20%，表明該方法的進樣精密度良好。

2.6 重復性試驗

制備原料藥、膠囊、片劑及緩釋片供試品溶液，平行配制6 份，按標準曲線法計算二甲胺的含量和RSD值。原料藥、膠囊及緩釋片中二甲胺的含量均低于0.01%，RSD均小于4.0%。片劑中的二甲胺含量小于0.04%，RSD小于2.0%，表明該方法重復性良好。

2.7 回收試驗

向不同劑型的供試品中分別加入50、100 和150 μg 的二甲胺溶液，制備供試品溶液，得到不同劑型低、中和高濃度的加標樣品，每個濃度平行配制3 份，進樣分析，計算回收率，結果表明該方法的準確度良好（見表2）。

表2 鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中二甲胺的回收率(n ＝3)Tab 2 Recovery of dimethylamine in metformin hydrochloride and its preparations (n ＝3)

2.8 穩定性試驗

取各供試品溶液和對照品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 測定。結果各供試品溶液和對照品溶液二甲胺的峰面積RSD均小于2.0%，說明溶液穩定性良好。

2.9 樣品測定結果

對6 批原料藥、3 批膠囊、9 批片劑及3 批緩釋片進行加速試驗考察，結果原料藥、膠囊、片劑及緩釋片中二甲胺的含量均不超過0.05%。其中原料藥及膠囊中二甲胺的含量不超過0.002%，片劑中二甲胺的含量在0.006%～0.045%，緩釋片中二甲胺的含量在0.002%～0.005%。加速6個月內，原料和各劑型中二甲胺含量增加均不超過0.01%。

3 討論

3.1 樣品處理方法的優化

楊芹等[20]將鹽酸二甲雙胍用水稀釋后直接進樣測定，二甲胺能夠有效提取，但鹽酸二甲雙胍在水中易溶，樣品中高濃度的鹽酸二甲雙胍會降低柱效。同時鹽酸二甲雙胍緩釋片在水中發生溶脹，難以獲得澄清的供試品溶液。文獻報道的鹽酸二甲胺的定量限為0.0328 μg·mL-1，為進一步提高檢測靈敏度，考慮使用一種溶劑降低供試品溶液中的鹽酸二甲雙胍含量，而不影響二甲胺的提取[20]。鹽酸二甲雙胍在乙腈中幾乎不溶或不溶，而鹽酸二甲胺在乙腈中略溶，能滿足試驗要求，因此考慮用含少量水的乙腈溶液作提取溶劑。比較了不同含水量的乙腈溶液，結果表明1%乙腈溶液作為原料及膠囊的提取溶劑，10%乙腈溶液作為片劑的提取溶劑，5%乙腈溶液作為緩釋片的提取溶劑，能完全提取樣品中的鹽酸二甲胺。但鹽酸二甲胺在乙腈中的穩定性差，室溫下1.5 h內穩定，試驗發現增加溶劑中的含水量能夠提高鹽酸二甲胺的穩定性，鹽酸二甲胺在50%乙腈溶液和10%乙腈溶液中室溫放置，24 h 內穩定。考慮實際試驗中操作的便利，將樣品用提取溶劑處理后再用水稀釋，增加供試品的穩定性。

3.2 色譜條件的優化

Dionex IonPac CS12A 是高容量陽離子交換色譜柱，該色譜柱的離子交換基團除了羧基還添加了膦酸基，增加了離子的選擇性[22]，適用于快速分離一價和二價陽離子以及銨，并且對0 ～100%乙腈水溶液作溶劑的樣品耐受，能夠滿足本試驗的要求。為了達到最優的分離條件，用含二甲胺及環境中易存在的陽離子K+、Na+、Ca2+、NH4+的混合溶液，考察不同的淋洗液濃度（10、15、20 mmol·L-1）、流速（0.8、1、1.2 mL·min-1）及柱溫（25、30、35℃）條件下二甲胺與相鄰離子的分離情況，結果表明在各淋洗液濃度、流速和柱溫條件下二甲胺與相鄰離子NH4+和K+分離度均能滿足要求（分離度大于1.5）。選擇最優條件，淋洗液濃度為10 mmol·L-1，流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃。

3.3 鹽酸二甲胺限度的制訂

加速試驗研究過程中同時考察了各樣品中NDMA 的檢出情況，結果發現二甲胺在加速試驗6 個月內隨時間的延長而含量升高，但均不超過0.05%，除了緩釋片中的NDMA 隨二甲胺的增大而增大，其他樣品中均未檢出NDMA，表明二甲胺并不是NDMA 產生的單一影響因素，建議參考歐洲藥典10.1 版中鹽酸二甲胺的限度規定，將鹽酸二甲雙胍中鹽酸二甲胺的限度擬訂為0.05%。

4 結論

本文建立了檢測鹽酸二甲雙胍原料藥及其制劑中二甲胺含量的方法，并進行了考察，結果表明該方法操作簡便，靈敏度高，可以準確檢測鹽酸二甲雙胍原料藥及其制劑中二甲胺的含量，可用于鹽酸二甲雙胍原料藥及其制劑的質量控制。