基于多波長高效液相色譜指紋圖譜和多成分定量分析的益肝明目口服液質(zhì)量標準研究

謝百波，里艷茹，尋園，臧新鈺，李映，蘇加樂，程林友，周驊*（. 北京慧寶源生物技術(shù)股份有限公司，北京 02206；2. 廣西慧寶源醫(yī)藥科技有限公司，廣西 欽州 535008；3. 抗腫瘤藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣西 欽州 535008）

中藥口服液是目前廣受歡迎的中成藥劑型，其藥效的發(fā)揮是多成分共同作用的結(jié)果，藥效成分的含量和比例對療效有重要影響。因此，在評價其質(zhì)量時，需采用能更全面反映其內(nèi)在品質(zhì)的方法，比如指紋圖譜[1-7]，結(jié)合多指標成分的含量測定[8-10]。益肝明目口服液是在古方“固根湯”[11]的基礎(chǔ)上加味所得，主要由玉竹、當歸、白芍、熟地和麥冬等12 味中藥組成，具有補益肝腎的作用，適用于肝腎不足癥見腰膝酸軟、頭暈?zāi)亢⒂洃浟p退、體倦乏力等[12]。研究表明，益肝明目口服液對異煙肼聯(lián)合利福平誘導的大鼠藥物性肝損傷[13]和大鼠急性酒精性肝損傷[14]均有較好的保護作用。益肝明目口服液現(xiàn)有標準的含量測定項僅對芍藥苷的含量進行了相應(yīng)規(guī)定，只能反映藥品中藥材白芍的情況，比較片面[15]。為了更加全面地評價該藥品的質(zhì)量，完善其質(zhì)量標準，本研究建立了該產(chǎn)品的多波長HPLC 指紋圖譜，并對其中6 個成分（芍藥苷、綠原酸、木犀草苷、阿魏酸、川陳皮素、橙皮苷）進行含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（包含Labsolution 工作站，SIL-20A 自動進樣器，SPD-M20A 二極管陣列檢測器，日本島津公司，型號：20A）；MS105DU電子天平（Mettler Toledo）；KQ-500DE 超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

益肝明目口服液（廣西慧寶源醫(yī)藥科技有限公司）；乙腈（Honeywell，HPLC 級）；甲醇、磷酸、正丁醇（北京化工廠，分析級）。阿魏酸（批號：12112204）、綠原酸（批號：13031401）、木犀草苷（批號：13060908）、川陳皮素（批號：13122311）、橙皮苷（批號：14010315）和芍藥苷（批號：13113009）（對照品，成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Inertsil ODS-SP 色譜柱（250 mm×46 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～25 min，5%～15%A；25 ～35 min，15% ～20%A；35 ～55 min，20% ～30%A；55 ～70 min，30% ～70%A；70 ～90 min，70% ～100%A）； 體積流量 0.8 mL·min-1， 檢測波長190 ～600 nm， 柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備

精密量取益肝明目口服液1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，稱定重量，超聲處理10 min（功率100 W，頻率40 kHz，溫度20℃），靜置至室溫后，稱定重量，甲醇補足損失的重量，即得供試品溶液（在制備后24 h 內(nèi)檢測）。

2.3 對照品溶液制備

取阿魏酸、綠原酸、川陳皮素、橙皮苷、芍藥苷、木犀草苷對照品各適量，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得阿魏酸415 μg·mL-1、綠原酸222 μg·mL-1、川陳皮素192 μg·mL-1、橙皮苷966 μg·mL-1、芍藥苷494 μg·mL-1和木犀草苷19.0 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取批號為130829 的益肝明目口服液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，使用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）計算相似度，相似度RSD為0.64%，說明方法精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取批號為130829 的益肝明目口服液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行操作6 份，進樣測定，計算相似度RSD為0.17%，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取批號為130829 的益肝明目口服液，按照“2.2” 項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算相似度RSD為0.08%，說明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立及共有峰的指認

分別取12 批益肝明目口服液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，將12批樣品的圖譜以AIA 格式依次導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）進行分析，采用中位數(shù)法對相關(guān)參數(shù)進行自動匹配，標定出共有峰，根據(jù)色譜峰共有模式生成對照指紋圖譜R，并生成12 批益肝明目口服液的指紋圖譜，見圖1。通過譜圖對比，選擇特征明顯的色譜峰進行標定，在230、284、325、348 nm 波長下分別標定了22、20、31、32 個共有峰（見圖1）。

圖1 12批益肝明目口服液在不同波長下的指紋圖譜Fig 1 Fingerprint of 12 batches of Yigan Mingmu oral liquid at different wavelength

2.6 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 版）分析軟件，以130102 批樣品的HPLC圖譜為對照，進行整體相似度評價。結(jié)果顯示，4個波長下12 批益肝明目口服液相似度均大于0.91，表明樣品批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)果見表1。

表1 12批益肝明目口服指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab 1 Similarity of 12 batches of Yigan Mingmu oral liquid

2.7 聚類分析

以12 批益肝明目口服液在4 個波長下共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 22.0 軟件，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進行聚類分析。結(jié)果顯示，12 批益肝明目口服液可聚為一大類。

2.8 含量測定方法學考察

2.8.1 專屬性試驗 精密吸取混合對照品、供試品、陰性樣品（甲醇）溶液各10 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖2。樣品在與對照品阿魏酸、綠原酸、川陳皮素、橙皮苷、芍藥苷和木犀草苷相應(yīng)的位置上，均有相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品（空白溶劑）無對應(yīng)色譜峰（圖譜未再給出），說明該色譜條件不干擾測定。

圖2 對照品（A）和供試品（B）HPLC 圖譜Fig 2 HPLC chromatogram of blank solvent，mixed reference （A）and samples（B）

2.8.2 線性關(guān)系考察 根據(jù)樣品中不同成分的含量，將對照品分別稀釋成適宜的濃度，并配制系列標準曲線工作液，濾過，分別進樣10 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立標準曲線，進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 6種指標成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Linearity and ranges of 6 chemical markers

2.8.3 精密度試驗 取混合對照品溶液連續(xù)進樣6 次，測定其峰面積，結(jié)果阿魏酸、綠原酸、川陳皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍藥苷的RSD分別為1.1%、0.72%、0.30%、1.0%、0.84%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.8.4 重復性試驗 取批號為130420 的益肝明目口服液，按照“2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，進樣測定，結(jié)果阿魏酸、綠原酸、川陳皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍藥苷的RSD分別為1.7%、2.9%、1.5%、1.0%、2.8%、1.7%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.8.5 穩(wěn)定性試驗 取批號為130420 的益肝明目口服液，按照“2.2” 項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，結(jié)果阿魏酸、綠原酸、川陳皮素、木犀草苷、橙皮苷、芍藥苷的RSD分別為0.46%、2.4%、1.9%、1.2%、0.7%、1.8%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.6 回收試驗 取已知含量的130420 批次的益肝明目口服液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，加入與樣品含量約1∶1 的對照品溶液，平行操作6 份，進樣測定，計算回收率。結(jié)果阿魏酸、川陳皮素、綠原酸、木犀草苷、橙皮苷、芍藥苷的平均回收率分別為99.26%、102.95%、102.68%、101.66%、101.75%、97.03%，RSD分別為2.4%、2.7%、2.0%、2.1%、0.31%、0.41%，表明方法準確度良好。

2.9 含量測定結(jié)果

取12 批益肝明目口服液，按照“2.2” 項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 12批樣品中6 個成分的含量測定結(jié)果(n ＝3，μg·mL-1)Tab 3 Contents of 6 markers in 12 batches of samples(n ＝3，μg·mL-1)

3 討論

本研究比較了水飽和正丁醇萃取法和甲醇提取法制備供試品溶液。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，水飽和正丁醇萃取法中芍藥苷的含量高于甲醇提取法，而其他5 種成分的含量均低于甲醇提取法，故選擇甲醇超聲處理供試品溶液。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%醋酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.05%甲酸水溶液5 種流動相系統(tǒng)，綜合考慮峰形、分離度、出峰數(shù)等因素選擇乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動相。

本研究通過二極管陣列檢測器（DAD）在190 ～600 nm 波長下對樣品進行全波長掃描，并對各波長下的色譜行為進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸、阿魏酸和川陳皮素在4 個波長（230、284、325、348 nm）處均有較強吸收峰，結(jié)合供試品圖譜出峰情況，從譜圖信息最大化考慮選擇325 nm作為這3 個成分含量測定的共同檢測波長；芍藥苷在230 nm 處、橙皮苷在284 nm 處、木犀草苷在348 nm 處有較強吸收峰，在其他波長下吸收峰較弱，阿魏酸在4 個波長下都有紫外吸收，在325 nm 和348 nm 波長下吸光度較強，在230 和348 nm 波長下吸收峰面積較弱，因此選擇不同波長作為相應(yīng)成分含量測定的檢測波長。

益肝明目口服液組方包括12 味藥材，成分復雜，采用單一波長檢測會出現(xiàn)色譜峰組成單一，特征峰信息的丟失或殘缺，且難以涵蓋全方所有藥味。本試驗采用了230、284、325、348 nm 為檢測波長，建立了多波長指紋圖譜和多成分含量測定方法，使各個色譜峰得到較好的分離，特征峰明顯且峰形較好，盡可能多地獲取色譜峰組成信息以更好地了解益肝明目口服液的化學組成。同時，方法學考察結(jié)果表明，本研究建立的指紋圖譜和含量測定方法，重復性好，方法可靠，可以為完善該藥品質(zhì)量標準提供依據(jù)。

對于建立復雜中成藥樣品的HPLC 指紋圖譜，可采取多種策略，如多波長融合指紋圖譜、不同極性部位的指紋圖譜等[16-18]。在條件允許的情況下，將HPLC-MSn研究和活性測定結(jié)合起來，對復雜中成藥的質(zhì)量控制更有意義[19-20]。希望將來能更加深入地研究益肝明目口服液的譜效關(guān)系，進一步完善該產(chǎn)品的質(zhì)量標準。