基于網(wǎng)絡藥理學的山豆根保肝作用藥效物質篩選及實驗驗證

秦妍，包永睿，2，王帥，2，李天嬌，2，張秀君，孟憲生，2*（. 遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)創(chuàng)新技術中心，遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600；. 丹東藥業(yè)集團有限公司，遼寧 丹東 80）

肝病一直以來都是全球面臨的公共問題和社會問題，包括脂肪性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等[1]。目前，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明[2]，全球約有2.4億慢性乙肝病毒攜帶者和1.5 億慢性丙肝病毒感染者。其中，慢性乙型肝炎患者中有10%～20%進展為肝硬化；2020年，全球肝癌發(fā)病人數(shù)高達90.5677 萬人，因肝癌死亡人數(shù)為83.0180 萬人。肝病發(fā)病原因眾多，氧化應激毒性、膽汁酸異常代謝、噬肝性病毒、miRNA 調控可能是造成肝臟疾病主要危險因素[3]。除此之外，酒精、肥胖、遺傳因素、飲食狀況等也與肝病的發(fā)生發(fā)展有關。目前，臨床上治療肝病的抗病毒藥物層出不窮，其機制主要為抑制病毒的復制。但對于肝硬化、原發(fā)性肝癌患者，更多的治療手段也難以控制疾病的進程，因此迫切需要尋找毒副作用低、安全有效的治療藥物。

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，始載于《開寶本草》，《植物名實圖考》中記載，山豆根解毒功熱甚效，與臨床消熱解毒的效用一致[4]。山豆根具有多種不同生物活性成分，包括生物堿類、黃酮類、多糖類、酶、核苷酸和微生物等。山豆根具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗氧化、免疫調節(jié)、抗炎、改善心血管系統(tǒng)等[5-9]。體內外試驗研究表明，山豆根及其主要活性成分在治療肝癌、抑制新生血管生成、保護肝損傷方面發(fā)揮著重要作用。本實驗采用微流控芯片技術始終保持給藥持續(xù)性，更加接近人體真實環(huán)境。靜態(tài)培養(yǎng)易出現(xiàn)藥物蓄積等情況，而微流控芯片采用低剪切力灌注不會因藥物蓄積而影響藥物釋放，因而也避免了因侵襲作用結果不準確的問題。酶聯(lián)免疫吸附法將抗原抗體親和反應的高度特異性與酶催化反應的放大作用相結合，在本實驗中通過顏色反應來進行定量分析，操作簡單方便、靈敏度高、檢測結果相對可靠。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，從山豆根中提取的山豆根生物堿能不同程度地減少肝組織中VEGF、PI3K mRNA 的表達，增加PTEN mRNA 的表達，其作用機制與環(huán)磷酰胺相似[10]。然而由于山豆根活性成分的多樣和結構復雜，難以獲得山豆根保肝作用的藥效物質基礎。因此本研究首先通過中藥網(wǎng)絡藥理學，預測山豆根抗肝炎、肝硬化、肝癌的潛在藥效物質。進一步采用微流控芯片技術進行驗證，以期為山豆根保肝作用的相關靶點及機制闡述提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

槲皮素（批號：100081-201509，中國食品藥品檢定研究院）；山柰酚（批號：JOT-10193）、異鼠李素（批號：JOT-10450）（成都普菲德生物技術有限公司）；脂多糖（批號：HY-D1056，Sigma公司）。0.1%結晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司）；冰醋酸（批號：20181123，分析純，天津科密歐有限公司）；Corning Matrigel 基質膠（批號：6235004，美國Gibco 有限公司）；胎牛血清（批號：S0901A，美侖生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA試劑盒（批號：KE00068，Proteintech 公司）；白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA 試劑盒（批號：E-EL-R0015c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.2 細胞株

人正常肝細胞（L-02）、小鼠肝星形細胞（HSC-T6）、人肝癌細胞（HepG-2）[賽百慷（上海）生物技術股份有限公司]。

1.3 儀器

SUNRISE 酶標儀（瑞士TECAN 公司）；NIKON ECLIPSE TI 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；JKG-2A 型光刻機（上海學澤光學機械有限公司）；HPDC32G2 型等離子清洗機（美國Harrick Plasma 公司）；KW-4A 型勻膠機（昆山力電精密機械有限公司）；LSP04-1A 精密注射泵（保定蘭格公司）。

2 方法

2.1 藥理學研究

2.1.1 山豆根有效化學成分與靶點的收集 在TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索山豆根的有效化學成分及成分對應的靶點，篩選條件為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18，根據(jù)篩選所得的山豆根活性成分獲取所對應的靶標，利用UniProt（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，收集山豆根活性成分對應靶點的基因名。

2.1.2 疾病靶點的收集 利用GeneCards（https：//www.genecards.org）數(shù)據(jù)庫（相關性評分≥1.0）、DrugBank（https：//www.drugbank.com） 數(shù)據(jù)庫、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd） 數(shù) 據(jù) 庫、OMIM（https：//omim.org）數(shù)據(jù)庫、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org）數(shù)據(jù)庫，以“cirrhosis”“chronic hepatitis” “l(fā)iver cancer”作為檢索詞分別檢索。合并去除重復基因后，收集相關的靶點。

2.1.3 山豆根“化學成分-靶點”網(wǎng)絡的構建 將山豆根化學成分與靶點信息導入Cytoscape 3.8.2軟件中，利用R 語言獲取山豆根和肝病的共同靶點，同時構建“山豆根-成分-靶點”網(wǎng)絡。

2.2 實驗驗證

2.2.1 基于細胞侵襲特征的微流控芯片構建 采用CorelDraw X7 矢量制圖軟件進行芯片設計，結合高分辨率打印機以膠印的方式輸出至透明菲林片上制成掩膜。

2.2.2 脂多糖誘導L-02 細胞損傷模型的制備 將細胞隨機分為0（空白對照組）、5、10、15、20、25 mg·L-1的脂多糖組，每孔5 個復孔。待細胞基本完全貼壁后，加入不同質量濃度的脂多糖，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、9、12、24、48 h，用CCK-8法檢測各組細胞的存活情況，確定肝損傷模型。

2.2.3 體外侵襲藥效學評價 根據(jù)實驗設計，將基質膠與無血清的DMEM 混勻后緩慢注入芯片上層通道內，待基質膠固化后將脂多糖處理的L-02 肝損傷模型[11]、HSC-T6、HepG-2 分別接種于上層通道內，并在芯片下層通入含有2%FBS的DMEM 培養(yǎng)液，待細胞穩(wěn)定生長后，借助蠕動注射泵以0.1 μL·min-1的速度對上層通道通入含藥培養(yǎng)液，以1 μL·h-1的速度對下層通入含有10%FBS 的細胞培養(yǎng)液。

給藥干預24 h 后，分離兩層通道層，取出微孔濾膜放置12 孔板中，使用0.1%的結晶紫染色液對微孔濾膜進行浸泡染色15 min；使用生理鹽水洗掉多余染料后，置于培養(yǎng)箱內烘干；烘干后在各個孔內加入1.5 mL 33%的醋酸，置于搖床上進行脫色處理，10 min 后收集洗脫液，借助酶標儀在570 nm 下讀取OD值，以空白組的OD值為參照，計算相對侵襲率。相對侵襲率（%）＝（OD給藥/OD空白）×100%。

2.2.4 ELISA 法檢測上清中TNF-α及IL-6 水平

將處于對數(shù)生長期的L-02、HSC-T6、HepG-2細胞，以5×105個/孔接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%時，加入終濃度為0、150、200、250 μmol·L-1的槲皮素、山柰酚、異鼠李素培養(yǎng)24 h 后，收集各組細胞培養(yǎng)上清，嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測TNF-α和IL-6 水平。

2.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 山豆根藥理學研究結果

3.1.1 山豆根活性成分收集結果 共得到山豆根的活性成分21 個。去除無靶點的成分共得到山豆根活性成分10 個，主要包括黃酮類化合物（如槲皮素、山柰酚）、生物堿類（如槐果堿、槐醇）、異黃酮類（如芒柄花素），以及酮類（如異鼠李素）。這些主要的活性有效成分均有不同程度的抗炎、抗腫瘤作用。

3.1.2 肝病潛在靶點的收集 GeneCard 數(shù)據(jù)庫中檢索到與肝炎、肝硬化、肝腫瘤關聯(lián)基因12 450個，DrugBank 數(shù)據(jù)庫中檢索到105 個，TTD 數(shù)據(jù)庫中檢索到130 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索到167個關聯(lián)基因以及 PharmGkb 數(shù)據(jù)庫中檢索到320個相關基因，刪除共有的基因，共得到12 648 個疾病關聯(lián)基因。

3.1.3 山豆根-活性成分網(wǎng)絡構建 將收集的174 個山豆根潛在靶點與肝癌的12 646 個潛在靶點相匹配，得到山豆根和肝病的共同靶點（170個），將山豆根藥材與其所含有效活性成分及靶點相互對應，并運用 Cytoscape 3.8.2 軟件構建相互關系，見圖1，其中槲皮素富集的靶點最多。

圖1 山豆根-活性成分網(wǎng)絡構建Fig 1 Network construction of active components in Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma

3.2 細胞侵襲實驗驗證

3.2.1 構建細胞侵襲特征的微流控芯片 本實驗所用芯片設計為四層，呈現(xiàn)中心對稱結構，設計圖及實物圖見圖2。該芯片從下至上依次是玻璃基底層、流體通道層B、三層微孔濾膜層以及流體通道層A，三層微孔濾膜結構單元通過靜電吸附作用鍵合在一起，PDMS 層通過熱鍵合處理，實現(xiàn)可逆封接，以便后續(xù)去除固定，并且每層都有獨立的藥液入口及廢液口。

圖2 細胞侵襲特征微流控芯片設計圖及實物圖Fig 2 Design drawing and physical drawing of microfluidic chip with cell invasion characteristics

3.2.2 脂多糖處理的L-02 肝損傷模型的建立 由圖3可知，脂多糖對肝細胞活力的影響具有劑量依賴性；脂多糖作用24 h，其存活率接近線性變化；但時間超過24 h，各組細胞增殖活力均下降。15、20、25 mg·L-1脂多糖作用12、24、48 h條件下，除15 mg·mL-1作用12 h 細胞存活率降低不明顯，各組均可明顯降低肝細胞活力。質量濃度為20 mg·L-1，作用24 h 時，其存活率為50.66%，從存活曲線來看，選擇接近線性變化的中間劑量20 mg·L-1脂多糖，作用24 h 作為致肝損傷造模劑量[12]。

圖3 不同質量濃度脂多糖對各組肝細胞存活率的影響Fig 3 Effect of different concentrations of lipopolysaccharide on the survival rate of hepatocytes in each group

3.2.3 細胞侵襲實驗結果 不同質量濃度藥效單體干預下的細胞侵襲活性結果見圖4。與空白對照組相比，3 種藥效單體均能顯著抑制細胞侵襲，呈劑量依賴性，特別是槲皮素（6 μg·mL-1）和異鼠李素（6 μg·mL-1）抑制HepG-2 細胞侵襲作用明顯。

圖4 槲皮素（A）、山柰酚（B）、異鼠李素（C）對L-02 肝損傷模型及HSC-T6、HepG-2 細胞的相對侵襲率Fig 4 Relative invasion rate of quercetin（A），kaempferol（B）and isorhamnetin（C）on L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cells

3.2.4 ELISA 實驗結果 與空白對照組比較，細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6 水平有所降低，中、高濃度組最為明顯，僅有槲皮素中濃度組對HSC-T6 的IL-6 的影響無統(tǒng)計學意義，另外槲皮素、山柰酚、異鼠李素（200、250 μmol·L-1）組細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表1。

表1 L-02 肝損傷模型及HSC-T6、HepG-2 細胞ELISA 實驗結果Tab 1 ELISA of L-02 liver injury model，HSC-T6 and HepG-2 cell invasion

4 討論

肝臟疾病的治療與預防一直以來都是公共衛(wèi)生領域的熱點問題，肝臟不僅參與代謝、消化，在維持機體平衡方面也具有至關重要的作用。“慢性肝炎-肝硬化-肝癌”是公認的肝臟疾病三部曲，抑制疾病的發(fā)展進程將可能避免肝癌的發(fā)生。

本研究利用“有效成分-靶點”網(wǎng)絡分析了山豆根藥效物質，進一步明確化學成分與靶點之間的相互作用關系。其中，藥理網(wǎng)絡中排名前三位的化學成分依次為槲皮素、山柰酚、異鼠李素，均為黃酮類。槲皮素具有抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗細胞凋亡等多種藥理作用[13]。Lu 等[14]研究顯示，槲皮素可通過調控PI3K/Akt 信號通路，下調MMP-2 和MMP-9D 的表達，進而抑制重組質粒轉染組HC-CLM3 細胞的遷移和侵襲。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著降低血清轉氨酶和總膽汁酸水平，減少促炎因子及IL-6 的釋放，通過降低氧化應激、減輕炎癥，發(fā)揮對肝臟潛在的保護作用。山柰酚是多種植物性食品中一類主要膳食黃酮，日常食用富含山柰酚的食物能夠降低肝癌、動脈粥樣硬化的發(fā)病風險，通過抑制細胞凋亡、下調上皮-間質相關信號，調節(jié)PI3K-PKB 信號通路而發(fā)揮作用[16]。異鼠李素可以顯著阻止四氯化碳（CCl4）或膽管結扎誘導的肝纖維化，降低磷酸化Smad 蛋白（Smad3）、減少細胞外基質（ECM）的形成及自噬、抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路的傳導，從而預防肝纖維化[17]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學揭示了山豆根的藥效物質，其可通過調節(jié)多個靶點共同作用實現(xiàn)保肝護肝作用。結合微流控芯片技術及體外ELISA 實驗，驗證了網(wǎng)絡藥理學的預測結果，對于下一步分子機制研究具有重要的意義。