黃精對原發性痛經大鼠藥效作用初步研究

聊曉玉，方靜，方媛，桂文琪，孫紀，韓燕全，韓嵐*，吳存林，龍子江，孫松（1. 安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230000；2. 中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230000；3. 安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，合肥 230000；4. 安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 230012；5. 國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，合肥 230093；. 合肥仟金草生物科技有限公司，合肥 230093；. 安徽仟金草黃精規劃院，合肥 230093；8. 合肥遠志醫藥科技開發有限公司，合肥 230093）

痛經發生在月經前后期或月經期間，痛經發生時小腹有疼痛、墜脹感，同時還伴有腰酸或其他疼痛。在臨床上，主要將痛經分為兩種，一種是原發性痛經，另外一種是繼發性痛經，在這兩者中原發性痛經占90%以上。對廣大女性朋友來說，痛經不僅僅傷害了她們的身心健康，還給她們的工作及學習帶來了嚴重的困擾，因而預防和治療原發性痛經已經成為醫學界迫切需要解決的問題。大多數研究者認為原發性痛經的產生與前列腺素E2（PGE2）、前列腺素F2α（PGF2α）、β-內啡肽（β-EP）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）及其他因素有關[1-7]。PGF2α含量升高可引起子宮平滑肌過強收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、乏氧而出現痛經；PGE2則能抑制子宮平滑肌的自發活動，降低PGF2α/PGE2比值可在一定程度上緩解疼痛。β-EP 水平降低可使子宮功能失常，成為疼痛的原因之一。前列腺環素（PGI2）有擴張血管和抑制血小板聚集的作用，而6-keto-PGF1α作為PGI2 的代謝產物，性質穩定，可以反映PGI2 的含量。因此，本文選擇上述代表性生化指標、組織病理指標以及子宮肌張力對黃精藥效學進行初步評價。

黃精是我國常用傳統中藥之一，用藥歷史悠久，同時也是一種藥食同源的中藥材。具有補肝益腎、延年益壽等功效，被尊崇為養生之圣藥。黃精的記載始于梁朝陶弘景《名醫別錄》，并列于草部的首位。研究表明其具有抗炎[8-10]、鎮痛[11]、抗腫瘤[12-13]、調節血糖血脂[14-19]和抗衰老[20]等藥理作用。《本經逢原》：“黃精，寬中益氣，使五藏調和，肌肉充盛，骨髓強堅，皆是補陰之功。”一種具有益腎調經功能的組合物及其應用的專利表明，該組合物可以用于治療因腎氣虛弱、血虧血滯導致的卵巢功能早衰、月經不調以及原發性痛經，其中黃精的補氣養陰、健脾潤肺益腎作用起到了很大的作用[21-25]。

基于黃精的“補陰之功”，從原發性痛經的發病機制出發，為了能更好的挖掘黃精的藥用范圍，本文通過建立原發性痛經大鼠模型，初步探究黃精對原發性痛經的治療作用。

1 材料

1.1 試藥

黃精（采自安徽省池州市青陽縣酉華鎮，經安徽中醫藥大學藥學院俞年軍教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua. 的干燥根莖）；戊酸雌二醇片（拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：492A）；縮宮素注射液（寧波第二激素廠，批號：201212）；婦科千金片（株洲千金藥業股份有限公司，批號：20191011）；樂氏液（上海源葉生物科技有限公司，批號：R20265）；大鼠PGF2α酶聯免疫試劑盒（批號：JL13273）、大鼠PGE2酶聯免疫試劑盒（批號：JL12636）、大鼠6-keto-PGF1α酶聯免疫試劑盒（批號：JL11068）、大鼠β-EP 酶聯免疫試劑盒（批號：JL20852）（上海江萊實業股份有限公司）。

1.2 實驗動物

健康SD 大鼠，雌性，體質量（220±20）g，購于安徽醫科大學動物實驗中心 [許可證號SCXK（皖）2017-001；本實驗使用所有動物均通過安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準，動物倫理編號：AHUCM-rats-2021024]。將購買的大鼠在實驗室動物房適應性飼養一周。飼養期間，正常喂飼料、喂水，房間溫度為25℃，房間濕度為60%～65%。

1.3 儀器

恒溫平滑肌實驗系統（成都泰盟軟件有限公司，HW200S）；BL-420N 信號采集與分析系統、FT-102 生物張力傳感器（成都泰盟軟件有限公司）；離心機（德國Eppendorf 公司，Centrifuge5417R）；多功能酶標儀（美國MD 公司）；微量移液器（德國Eppendorf）；艾科浦超純水系統（中國重慶頤洋企業發展有限公司，AD3L）；電子天平（上海菁海儀器有限公司，FA2004N）；BHWY-100BC 恒溫振蕩培養箱（常州杰博森儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 黃精水提液的制備

根據《中國藥典》（2020年版）黃精臨床指導用藥用量9 ～15 g[26]，參考陳奇主編的《中藥藥理研究方法學》，查表可得人和大鼠間體表面積的折算系數為6.3[27]。按臨床指導每年平均用藥量9 g、12 g、15 g 換算成大鼠的用藥量，即大鼠用藥低、中、高劑量分別為0.945、1.26、1.575 g·kg-1。取適量黃精，加入10 倍總生藥量的水，加熱提取兩次，每次2 h，合并濃縮水提物至0.945、1.26、1.575 g·kg-1，滅菌備用。

2.2 模型復制

實驗采用雌激素與縮宮素聯合使用的方法制備大鼠原發性痛經模型，除了正常組以外，其余各組的每只大鼠均每日1 次灌胃給予戊酸雌二醇片，使各組大鼠子宮處于共情期，提高大鼠子宮的敏感程度。給藥周期為10 d，其中第1日和第10日每只大鼠給藥0.2 mg，第2日至第9日每只大鼠給藥0.1 mg，末次給藥1 h 后，各組大鼠腹腔注射縮宮素2 U/只[21]，觀察30 min 內大鼠的疼痛反應。將扭體反應作為子宮強烈收縮即痛經的指標，同時扭體反應也可以直觀地反映原發性痛經模型建立成功。

2.3 分組與給藥

采用體質量隨機區組的方法將大鼠分為正常組，陽性對照組（婦科千金片），模型組，黃精水提物低、中、高劑量組，每組10 只。從給予戊酸雌二醇片第5日開始，按照各組給藥劑量灌胃給藥，其中陽性對照組給藥劑量為0.08 g·kg-1，黃精水提物低、中、高劑量組分別給予0.945、1.26、1.575 g·kg-1黃精水提物，正常組和模型組均灌胃給予等量大豆油，連續7 d。

2.4 行為學測試

扭體表現為大鼠腹部向內凹陷、軀干和后肢伸展、臀部和一側的肢體內旋[21-23]，有時還有抱頭舔腹的行為。最后一次灌胃給予戊酸雌二醇片1 h 后，觀察注射完縮宮素后10 ～30 min 內大鼠的扭體反應情況，記錄扭體潛伏時間和扭體次數。結果與正常組相比，模型組大鼠扭體潛伏時間顯著縮短（P＜0.05），扭體次數顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，黃精低、高劑量組及陽性對照組均可延長扭體潛伏時間，降低扭體次數（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 黃精對原發性痛經大鼠扭體反應的影響Fig 1 Effect of Polygonatum on writhing responses in rats with primary dysmenorrhe

2.5 大鼠血清中6-keto-PGF1α 和β-EP 含量以及大鼠子宮組織中PGF2α 和PGE2 含量的測定

末次給藥后，對各組大鼠進行腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL·kg-1）麻醉，將大鼠仰臥置于解剖臺上，進行腹主動脈取血，全血室溫靜置10 ～20 min 至血液凝固后離心，3000 r·min-1離心15 min 后留取血清。嚴格按照ELISA 試劑盒說明書，測定大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP的含量。

取大鼠子宮組織，按1∶9 比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS），勻漿后離心，取上清液，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書，測定大鼠子宮組織中PGF2α和 PGE2的含量。

與正常組相比，模型組大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃精高劑量組、中劑量組、低劑量組均可顯著提升大鼠血清中6-keto-PGF1α和β-EP 的含量（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖2A、2B。

與正常組相比，模型組大鼠子宮組織中PGF2α水平顯著升高（P＜0.05），PGE2含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，黃精中劑量組可降低大鼠子宮組織中PGF2α的含量，提升PGE2的含量（P＜0.001），從而使PGF2α/PGE2的比值降低，緩解痛經。結果見圖2C、2D。

圖2 黃精對原發性痛經大鼠生化指標的影響Fig 2 Effect of Polygonatum on biochemical indexes in rats with primary dysmenorrhea

2.6 組織病理學檢測

分離子宮組織，浸泡于4%多聚甲醛緩沖液中，固定。石蠟包埋后，進行常規的HE 染色，觀察子宮病理變化情況。

由圖3可見，正常組大鼠子宮組織形態正常，組織平滑形態清晰，而模型組大鼠子宮組織內膜變薄，上皮細胞空泡樣變，子宮肌層有充血現象。陽性對照組大鼠子宮內膜細胞少量空泡樣病變。黃精高劑量組大鼠子宮上皮細胞空泡病變基本消失，充血現象明顯改善。黃精中劑量組大鼠子宮內膜相對平整，空泡樣病變基本消失。黃精低劑量組大鼠子宮上皮細胞空泡變化有所改善。

圖3 黃精對原發性痛經大鼠子宮組織病理變化的影響（HE，×200）Fig 3 Effect of Polygonatum on histopathological changes of uterus of rats with primary dysmenorrhea（HE，×200）

2.7 縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮程度的測定

將大鼠麻醉后解剖，完全暴露子宮，快速剪取一側子宮，立即放置在盛有樂氏液的玻璃平皿中充分清洗干凈，仔細清除子宮上殘留的結締組織和脂肪，用樂氏液沖洗子宮，將子宮內容物充分洗凈，在整個過程中注意不要過分拉伸子宮。然后剪取中間段子宮平滑肌約2 cm，注意必須現取現用，避免時間過長子宮平滑肌失去活性。平滑肌兩端分別系上縫合線，將HW200S 恒溫平滑肌實驗系統的溫度調整至37℃，管內加入足量樂氏液，將系上縫合線的子宮平滑肌置于該系統內，使陰道端固定于小鉤上并固定在管內，另一端連接在張力傳感器上。實驗過程中持續向樂氏液內通入氧氣，速度為每1 ～2 s 一個氣泡，使子宮平滑肌正常自主收縮。通過BL-420N 信號采集與分析系統記錄大鼠離體子宮平滑肌的收縮曲線，先穩定半小時至子宮收縮穩定后，先記錄一段子宮正常收縮曲線6 min，然后向管內加入縮宮素50 μL，記錄曲線1 min，隨后依次向管中加入各種藥液，分別記錄曲線6 min。最后對曲線進行分析，得出張力值和頻率，并計算活動度（活動度＝平均張力值×頻率）。

與模型組大鼠相比，黃精組與陽性對照組的子宮組織張力，收縮頻率及活動度均有明顯變化；黃精高劑量組和陽性對照組大鼠的子宮組織平滑肌平均張力具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。黃精高劑量組、黃精中劑量組和陽性對照組大鼠的子宮組織收縮頻率均有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。黃精中、高劑量組和陽性對照組大鼠的子宮組織平滑肌活動度也具有統計學差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。其中黃精高劑量組較黃精組其他兩組效果較優。結果見表1。

表1 黃精對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響(n ＝6，x±s)Tab 1 Effect of Polygonatum on oxytocin induced contraction of isolated rat uterine smooth muscles (n ＝6，x±s)

2.8 統計學處理

實驗所有檢查結果經SPSS 25.0 軟件進行數據統計分析，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD 分析，方差不齊時用Dunnett’s方法分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 討論

痛經是婦科臨床的常見病，癥狀嚴重的患者甚至會昏厥，給廣大女性帶來諸多困擾。研究原發性痛經，需要選擇合適的動物模型，目前公認的關于原發性痛經動物模型是用雌激素與縮宮素聯合使用建立[14]。因此，本研究采取這種方法復制原發性痛經動物模型，研究黃精對原發性痛經的藥效作用。

原發性痛經發病機制復雜，然而大多數研究者認為原發性痛經的產生與前列腺素、縮宮素、前列環素及其他一些因素有關。其中PGE2和PGF2α發揮主要作用。研究表明痛經患者的子宮內膜和經血中PGF2α濃度會遠遠高于正常女性，痛經越嚴重，患者體內的PGF2α/PGE2的比值越高[2]。本實驗結果表明，黃精能夠降低原發性痛經大鼠子宮組織中PGF2α的含量，提升PGE2的含量，降低PGF2α/PGE2的比值，抑制子宮收縮。

研究發現，當子宮中β-內啡肽含量上升時，其內源性鎮痛作用會使子宮疼痛減輕，子宮慢慢恢復正常，而當子宮中β-內啡肽含量過低時，會導致子宮收縮異常，進而導致痛經的產生[24]。除此之外，PGI2 含量降低則會造成子宮收縮異常、肌張力增高、收縮頻率增加，從而導致子宮血流量降低，子宮缺血，痙攣等從而引發痛經。6-keto-PGF1α是PGI2 的代謝產物，其性質穩定，所以可以測量其代謝產物6-keto-PGF1α的含量，以此間接反應PGI2 的水平[7]。實驗結果顯示，黃精可顯著提升大鼠血清中β-EP 和6-keto-PGF1α的含量。

以上實驗結果提示，痛經大鼠子宮過度收縮，造成子宮組織損傷，導致炎癥反應的發生。黃精組大鼠子宮內壁空泡變化有所改善、充血現象明顯改善、子宮內膜相對光滑平整。同時，黃精組能顯著降低痛經大鼠子宮收縮頻率和收縮張力，達到緩解痛經的效果。

綜上，本實驗首次在黃精原有的藥理作用上，以黃精的抗炎、鎮痛、補陰益腎作用為基礎，進而探究黃精對原發性痛經大鼠模型的藥效作用。本研究結果提示黃精可能對原發性痛經具有藥效作用，為黃精的臨床應用提供了實驗依據。