抑制USP7活性對雞抗沙門菌感染的影響

張 娜，王 菲，葛錫民，趙桂蘋，文 杰，李慶賀*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

沙門菌是革蘭陰性菌，可引起人畜共患疾病，并在食用動物宿主中獲得耐藥性，然后通過食物鏈傳播給人類。食用受污染家禽產品而引起的沙門菌病常導致嚴重的公共衛(wèi)生問題，盡管已經采取了包括抗生素、疫苗和衛(wèi)生消毒等方法來控制家禽沙門菌的感染，但是沙門菌病病例仍在持續(xù)增加。此外，抗生素的使用導致細菌耐藥性增加，許多抗生素的有效性降低，周而復始，形成惡性循環(huán)。

先天免疫是宿主抵御病原體感染的第一道防線，病原微生物入侵后,首先引起宿主對病原微生物的識別，這是先天免疫應答的前提和基礎，模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)就是宿主細胞識別病原的特殊分子，其中,Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)不僅是目前研究最廣泛的一類TLRs，也是進化上保守的一類模式識別受體，在人、小鼠和雞等大多數物種中均有該受體，其中，TLR4是在家禽中研究比較多的一類模式識別受體，TLR4-MyD88依賴通路活性與沙門菌感染密切相關，雛雞對沙門菌感染的反應受4基因表達水平的調節(jié)，當雛雞受到革蘭陰性菌細胞壁主要成分——脂多糖(LPS)刺激后，4及其下游的分子88、-、-、-1β等基因表達均顯著上調。

USP7作為研究比較廣泛的去泛素化酶，可以通過去除靶蛋白上的泛素鏈，防止靶蛋白被蛋白酶體降解來穩(wěn)定靶蛋白的表達，在維持基因組穩(wěn)定性及其與癌癥的發(fā)生方面都發(fā)揮重要作用。USP7可以通過去泛素化穩(wěn)定NF-κB的亞基從而促進下游炎癥因子的表達。P5091是USP7的選擇性抑制劑，以濃度依賴的方式抑制USP7的活性，當用P5091處理后，USP7的底物HDM2、PLK1、P53以及CCDC6的蛋白表達均降低，而它通過抑制USP7活性影響機體對沙門菌抗性的研究尚未有報道，因此，作者用鼠傷寒沙門菌感染了腹腔注射P5091的雛雞，分析抑制USP7活性后雛雞抵抗沙門菌感染的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 3日齡白來航雞 雛雞來源于北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平基地，飼喂于中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所隔離倉中，自由采食與飲水。

1.1.2 P5091及溶液配制 選擇性USP7抑制劑P5091購于上海Selleck，其分子式為CHClNOS， 化學結構見圖1。配制方法為4%DMSO+30%PEG400+dd HO從左到右依次將純溶液加入到P5091中，室溫溶解，現用現配。

圖1 P5091化學結構Fig.1 Chemical structure of P5091

1.1.3 試驗菌株 鼠傷寒沙門菌菌株(ST，21484)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(北京)。菌株按照1∶1 000的比例加入到滅菌的LB肉湯培養(yǎng)基(奧博星，北京)中，置于搖床，37 ℃，180 r·min過夜培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 雛雞感染與樣本采集 40只3日齡的雛雞分為試驗組與對照組，每組20只，試驗組以10 mg·kg濃度腹腔注射USP7抑制劑P5091，隔天注射，共注射5次，對照組以相同方法注射P5091溶劑PEG400和DMSO。各組雞每天空腹稱重。沙門菌在LB肉湯培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至第3代，每代培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)第3代后將菌液離心濃縮、梯度稀釋，用平板計數的方法確定最終菌落形成單位(CFU)。待最后一次注射P5091后第4天對雛雞人工口服感染7×10CFU沙門菌，感染24 h后，放血處死雛雞，并收集血樣、肝和脾。每組隨機選取5只雛雞新鮮肝用于測量細菌載菌量，將脾、肝置于液氮中以備后續(xù)RNA提取，用于細胞因子基因相對表達量的測定。

1.2.2 肝載菌量的測定 采集雛雞相同部位的肝樣品(均采集雛雞右側肝)，稱取相同質量(約0.1 g)新鮮肝樣品，置于已經加入鋼珠和1 mL PBS溶液的離心管中，在組織研磨儀中研磨，用PBS梯度稀釋后均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂(奧博星，北京)上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，計算菌落數以確定肝細菌載菌量。

1.2.3 RNA提取與實時定量PCR反應 根據使用說明書，使用TRIzol 試劑(賽默飛，美國)從肝中提取總RNA。使用逆轉錄酶試劑盒(天根，北京)進行逆轉錄。使用熒光定量檢測試劑盒(天根，北京)進行實時定量PCR反應(RT-qPCR)。每個樣品3個生物學重復。反應體系：cDNA 3 μL, mix 5 μL， 上、下游引物各0.5 μL，ddHO 1 μL，共10 μL。 RT-qPCR 參數：95 ℃ 3 min;40 個循環(huán)，95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s。RT-qPCR的引物序詳見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers for quantitative real-time polymerase chain reaction

1.3 數據統(tǒng)計與分析

在本研究中，使用2-ΔΔ方法計算基因相對表達量，使用檢驗分析差異顯著性，<0.05表示具有統(tǒng)計學意義，結果以“平均值±標準差”表示。使用GraphPad Prism 7.0將所有數據圖示化。

2 結 果

2.1 USP7活性對雛雞載菌量以及組織炎癥反應的影響

監(jiān)測并記錄注射P5091前后雛雞健康狀況以及體重變化，注射前后兩組雛雞健康狀況良好，兩組體重與體增重均無顯著差異(圖2a、b)，說明注射P5091并不會影響雛雞體重變化。對感染沙門菌的兩組雛雞進行了24 h的監(jiān)測，雛雞活動正常，沒有死亡發(fā)生。雛雞肝載菌量統(tǒng)計結果發(fā)現，與對照組相比，注射P5091的雛雞肝組織中載菌量顯著低于對照組雛雞(圖2c)，HE染色結果顯示，對照組與注射P5091組均出現炎癥，具體表現為肺間質充血水腫、肺間隔增寬、血管充血，肝基本結構消失，肝板排列紊亂，并且在肝細胞間可見紅細胞和巨噬細胞聚集，但是相較于對照組，注射P5091的雛雞肝與肺炎癥反應更嚴重(圖2d)。

a.P5091注射前后雛雞體重；b.注射P5091組與對照組的體增重(n=20)；c.注射P5091組與對照組的載菌量(n=5)；d.雛雞肝與肺病理切片。ns.沒有顯著差異，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，下同a. The weight of chicks before and after P5091 injection; b. Body weight gain of injection P5091 group and control group (n=20); c. The bacterial load of the P5091 injection group and the control group (n=5); d. Pathological sections of liver and lungs of chicks. ns.No significant difference, *.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001, the same as below圖2 注射P5091后雛雞載菌量降低、組織炎癥反應加劇Fig.2 The bacterial load decreased and the tissue inflammatory response increased after injection of P5091

2.2 抑制USP7活性后雛雞體內免疫因子以及轉錄因子NF-κB的表達

動物的免疫反應與炎癥因子的產生密切相關，機體通過釋放免疫因子對外界刺激作出免疫應答，為此作者分別檢測了試驗動物-1β、-8以及-的mRNA表達水平，RT-qPCR結果表明，與對照組相比，注射了P5091組炎癥因子-1β、-8以及-在mRNA水平的表達均顯著降低(圖3a～c)，說明抑制USP7活性會降低雛雞感染后免疫因子的產生。

NF-κB是一種轉錄因子，它可以調節(jié)參與免疫反應和炎癥的各種基因的表達，NF-κB通路的激活是產生包括IL-1β、TNF-α等細胞因子的經典途徑，與細胞因子mRNA表達一致，注射P5091的雛雞-的mRNA表達水平顯著降低(圖3d)，說明USP7正調控轉錄因子-的mRNA表達水平，提示USP7可能通過影響轉錄因子NF-κB的表達進而調控下游免疫因子。

a～c.RT-qPCR法檢測鼠傷寒沙門菌感染24 h后，P5091組和對照組雛雞肝中IL-1β、IFN-α和IL-8的mRNA水平(n=18)；d. 抑制USP7活性降低轉錄因子NF-κB mRNA表達水平(n=16)a-c. RT-qPCR for IL-1β, IL-8 and IFN-α in the liver from P5091 and control chicks challenged with Salmonella for 24 h (n=18); d. Inhibition of USP7 activity reduced NF-κB mRNA expression (n=16)圖3 注射P5091后肝中免疫因子表達量降低Fig.3 Cytokines in the liver decreased after injection of P5091

3 討 論

模式識別受體(PRR)通過識別微生物中存在的保守病原體相關分子模式(PAMP)誘導先天免疫反應，它可以用于檢測沙門菌觸發(fā)的機體免疫反應，還可促使炎性細胞因子的釋放，限制病毒的復制。TLR4是在家禽中研究比較多的一種模式識別受體，革蘭陰性菌LPS可以激活TRL4誘導的核因子NF-κB和轉錄因子家族的幾個成員的激活，誘導宿主的免疫應答。在此過程中，接頭蛋白MyD88扮演著重要的作用，它承接TRL4與下游蛋白之間信號傳導，當TRL4識別病原體后，MyD88將信號傳遞給IL-1β受體相關激酶(IRAK)，信號向下游傳遞激活NF-κB，促使其向核內轉移調節(jié)包括編碼促炎細胞因子在內的靶基因，發(fā)生一系列的炎癥反應。然而，炎癥反應對機體清除病原體固然重要，但是過度免疫或者免疫缺陷都會對機體健康造成不良影響，如過度的炎癥反應會引起細胞因子風暴導致內毒素休克或膿毒癥的發(fā)生，免疫應答不足會造成免疫缺陷癥，如過敏、惡性腫瘤和自身免疫性疾病等。而NF-κB信號通路是這些炎癥反應發(fā)生的經典通路，包括細胞因子、趨化因子和黏附分子在內的許多促炎基因都是基于NF-κB發(fā)揮作用。NF-κB作為炎癥發(fā)生和維持免疫穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)因子，它的激活和抑制在炎癥反應過程中至關重要，在炎癥發(fā)生期間NF-κB的活化可以促進炎癥因子的表達，發(fā)揮促炎作用，但在炎癥消退過程中，抑制NF-κB可以調節(jié)炎癥消退，發(fā)揮抗炎作用。

USP7作為研究最廣泛的一類去泛素化酶，目前對其研究最多的是其在腫瘤發(fā)生中的作用，比如USP7可以調控腫瘤因子p53、PTEN和FoxO的穩(wěn)定性、定位以及活性。此外，USP7還在DNA復制、細胞凋亡中發(fā)揮作用，USP7可以通過去泛素化穩(wěn)定NF-κB的P65亞基，從而促進下游炎癥因子的表達，但是，它在機體對抗沙門菌感染的免疫反應中的作用仍不確定。P5091是特異性針對USP7的小分子抑制劑，它可以通過抑制USP7的活性發(fā)揮作用，當用P5091處理后，USP7的底物HDM2、PLK1、P53以及CCDC6的蛋白表達均降低。USP7與MyD88結合并穩(wěn)定其蛋白表達，而USP7是否通過MyD88影響下游免疫因子的表達還未可知。在本研究中，用P5091抑制USP7的活性后，下游轉錄因子-的mRNA表達下調，說明USP7可能在NF-κB信號通路的上游發(fā)揮作用。而導致NF-κB的激活的信號主要是MyD88，USP7活性減弱可能影響了MyD88的穩(wěn)定性，導致轉錄因子的表達降低。之前有研究報道，微量LPS可以通過TLR4激活先天免疫系統(tǒng)，導致TNF-α、IL-1β、IL-8等大量促炎因子的產生，本研究結果表明，當抑制USP7的活性之后，雛雞中-1β和-8的表達水平降低，這與先前的研究結果一致。本研究還發(fā)現，與對照組相比，注射P5091的雛雞感染后肝載菌量更低，推測可能是由于抑制USP7活性后雛雞對沙門菌的感染更加敏感，少量的菌液即可以使機體發(fā)生免疫反應。綜合以上分析可以推測，USP7可能通過調控TLRs-MyD88-NF-κB信號通路的活性，從而影響動物抗病力，本研究為家禽抗病育種提供了基因素材。然而，USP7是否通過特異性調控MyD88來調節(jié)雞肉對沙門菌的抵抗力，以及USP7是否影響雞對其他病原體的抵抗力，還有待于進一步研究。

4 結 論

USP7活性被抑制的雛雞感染沙門菌后-mRNA表達水平下降，說明USP7在TLRs-MyD88-NF-κB信號通路的上游發(fā)揮作用，導致NF-κB信號通路受阻，下游免疫因子-1β、-8以及-mRNA表達顯著降低；除了在沙門菌感染后炎癥通路激活和細胞因子的產生受損外，沙門菌感染后發(fā)現注射P5091的雛雞肝載菌量更低，炎癥加劇。本研究結果提示，USP7可能在沙門菌感染雛雞模型中具有重要的免疫作用，為今后研究USP7影響機體先天免疫應答的分子機制提供了理論依據，為動物的抗病育種提供理論依據。