微囊化沙門菌SP4噬菌體的制備及其緩釋特性分析

張 博，張永英，郝 賀，張逸博，呂興幫，朱守創，朱 陣，石玉祥,2*

(1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056000； 2. 河北省禽病工程技術研究中心，邯鄲 056000)

噬菌體是一類細菌性病毒，在自然界中廣泛存在，其能感染或裂解細菌，并能快速復制增殖，最終達到抗菌的效果，目前，用噬菌體抗菌的方法已經得到了廣泛的應用。噬菌體有著特異性強、安全無毒、自我復制還有廣泛存在等諸多優勢，有望替代抗生素用于防治細菌性感染。噬菌體在治療動物細菌性疾病方面有著非常顯著的成效，但噬菌體的穩定性較差，當噬菌體進入動物胃時，噬菌體的活性易被胃酸、消化酶等損壞，因而失活。所以，口服噬菌體治療過程中保存活性的問題便成為亟待解決的重要問題。

微囊化技術雖然問世時間不長，但有著非常廣闊的前景，主要是利用一些特殊的方法，使某種特殊物質達到預想的密度，并被另一種或幾種物質所包裹，從而形成特殊的狀態，滿足用藥的特殊需求，該技術目前已廣泛應用于生物制劑的控制釋放領域。微囊化技術在國內外均有大量研究，但關于沙門菌噬菌體微囊化包被方面的報道較少，此項技術還有很大發展空間。微囊化技術雖然有著很多的優點，但需要選擇出合適的包被材料來進行微囊化包被，不合理的材料只會使包封率很低，其在腸道中不能很好地釋放，所產生的治療效果甚至不如直接口服噬菌體，所以選擇合適的微囊化材料是至關重要的。微囊化材料的選擇要求無毒、耐酸、且具有較好的生物相容性，常用的包被材料以天然材料為主，如明膠、乳清蛋白、海藻酸鈉、殼聚糖、殼寡糖、果膠、黃原膠、變性淀粉等。本研究采用陽離子醚化淀粉(CES)/海藻酸鈉(SA)/黃原膠(XG)/納米TiO/殼寡糖(COS)對沙門菌SP4噬菌體進行微囊化包被，以期獲得一種理想的提高噬菌體抗菌效果的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禽源腸炎沙門菌SDH株、SP4噬菌體由河北工程大學生命科學與食品工程學院獸醫實驗室分離鑒定；木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；LB固體、LB半固體、LB液體培養基、模擬胃液、模擬腸液、微球破解液等由本實驗室配制。

1.2 沙門菌SP4噬菌體的分離與純化

將20 μL SP4噬菌體原液與500 μL對數生長期腸炎沙門菌SDH株懸液混勻，加入5 mL冷卻至50 ℃的含7 g·L瓊脂的LB培養基，置于預先凝固的LB平板上制成雙層平板，37 ℃倒置培養過夜。挑取單個噬菌斑，接種于菌液，37 ℃、170 r·min振蕩培養12 h，取樣制成雙層平板進行純化，反復純化2～3次。

1.3 陽離子醚化淀粉/海藻酸鈉/黃原膠/納米TiO2/殼聚糖微囊化微球的制備

將CES溶于去離子水，60 ℃備用(A液)，純化后的SP4噬菌體懸液劑量與CES相同，濃度約為10CUF·mL(B液)，A液和B液混合均勻備用(C液)。將SA溶于Tris-HCl溶液(50 mmol·L)備用(D液)，XG溶于去離子水，混合均勻備用(E液)，納米TiO置于去離子水中制成母液，超聲處理1 h后，適當稀釋后，再超聲處理15 min，備用(F液)，將C、D、E、F 4液置于同一燒杯，混合均勻，去除氣泡，備用(G液)。使用無菌注射器，向2 g·dL的CaCl溶液(H液)中以10 mL·min滴速距溶液5 cm 高度處滴入G液，形成ALG-Ca，室溫靜置30 min， 等待微球固定，收集噬菌體微球，置于COS溶液(I液)中覆膜30 min，過濾收集噬菌體微球，置于4 ℃密封保存，或置于電熱鼓風干燥箱中30 ℃干燥24 h后，4 ℃密封保存。

1.4 微囊化SP4噬菌體微球效價和包封率的測定

取1 g SP4噬菌體微球，置于微球破解液中，待完全溶解后，用0.22 μm濾膜過濾除菌，以LB培養液對噬菌體液進行10倍連續稀釋，各取10 μL稀釋液與10 μL宿主菌懸液混合，靜置3 min，迅速制成雙層平板，37 ℃倒置培養過夜，噬菌斑數在30～300的平板計數，計算噬菌體效價。噬菌體效價(PFU·mL)=噬菌斑數×稀釋倍數×100。同時計算微囊化SP4噬菌體的包封率。計算公式為包封率(%)=噬菌體微球中含藥量/初始投入的噬菌體量×100%。

1.5 微囊化沙門菌SP4噬菌體微球的形態表征

1.5.1 形態觀察 采用1 200萬像素數碼相機觀測樣品宏觀形貌。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀測樣品微觀形貌，取適量微囊化沙門菌SP4噬菌體微球用導電膠粘到樣品臺上，對樣品噴金處理，進行電鏡掃描。工作條件：加速電壓5.0 kV，工作距離8.9 mm，觀察并記錄樣品圖像，通過宏觀和微觀對微囊化沙門菌SP4噬菌體微球進行形態表征。

1.6 單因素試驗

通過改變CES、SA、XG、COS的濃度，設計分析試驗，選擇出最合適的SP4噬菌體微球的各因素值。

1.6.1 CES濃度優化 固定SA濃度為1.0 g·dL，XG濃度為1.0 g·dL，COS濃度為1.0 g·dL，分別以2.0、2.2、2.4、2.6 g·dL的CES濃度按照“1.3”方法制備SP4噬菌體微球，優化CES的濃度。

1.6.2 SA濃度優化 固定CES濃度為2.4 g·dL，XG濃度為1.0 g·dL，COS濃度為1.0 g·dL，分別以1.0、2.0、3.0、4.0 g·dL的SA濃度按照“1.3”方法制備SP4噬菌體微球，優化SA的濃度。

1.6.3 XG濃度優化 固定CES濃度為2.4 g·dL， SA濃度為2.0 g·dL，COS濃度為1.0 g·dL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0 g·dL的XG濃度按照“1.3”方法制備SP4噬菌體微球，優化XG的濃度。

1.6.4 COS濃度優化 固定CES濃度為2 .4 g·dL，SA濃度為2.0 g·dL，XG濃度為1.0 g·dL，分別以0.4、0.6、0.8、1.0 g·dL的COS濃度按照“1.3”方法制備SP4噬菌體微球，優化COS濃度。

1.7 微囊化沙門菌SP4噬菌體微球的穩定性及釋放行為

1.7.1 微囊化SP4噬菌體pH穩定性的測定 將SM緩沖液調整至不同的pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，向已經調節好的SM緩沖液中分別加入1 g微囊化SP4噬菌體微球，孵育30 min 后，加入微球裂解液中，待其完全裂解后，經0.22 μm濾膜過濾，按“1.4”方法測定效價。

1.7.2 微囊化SP4噬菌體熱穩定性的測定 稱取等量微囊化SP4噬菌體微球7份，分別置于溫度為10、20、30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中，孵育1 h后，加入微球裂解液，待其完全裂解后，經0.22 μm濾膜過濾，按“1.4”方法測定效價。

1.7.3 微囊化SP4噬菌體模擬胃液穩定性的測定 將pH2.0和pH3.0的模擬胃液置于7個試管中，向其中分別加入200 mg的微囊化SP4噬菌體微球，在37 ℃搖床120 r·min振蕩培養30、60、90、120、150、180 min時取出，加入微球裂解液，待其完全裂解后，經0.22 μm濾膜過濾，按“1.4”方法測定效價。以SM緩沖液作為對照。

1.7.4 微囊化SP4噬菌體模擬腸液釋放行為的測定 取模擬腸液(pH7.5)置于試管中，加入200 mg 的微囊化SP4噬菌體微球，分別在37 ℃搖床120 r·min振蕩培養2、4、6、8 h時，取100 μL反應后的溶液，經0.22 μm濾膜過濾，按“1.4”方法測定效價。

1.7.5 微囊化SP4噬菌體保存穩定性的測定 濕態和干燥微囊化SP4噬菌體微球于4和25 ℃分別保存，每隔7 d，抽取少量的微球按“1.4”方法測定其效價。

1.8 數據處理與統計

應用SPSS19.0軟件，釆用單因素方差分析和Turkey檢驗進行統計分析，<0.05為差異有統計學意義，最后采用Graph Pad Prism軟件作圖。

2 結 果

2.1 微囊化沙門菌SP4噬菌體微球的形態表征

2.1.1 形態觀察結果 宏觀圖像如圖1A所示，微囊化SP4噬菌體微球干燥前形貌良好，呈規整球狀，分散均勻。通過SEM得到微囊化SP4噬菌體微球的微觀表面形貌如圖1B所示，微球干燥后失水收縮，呈球狀或類球狀，表面粗糙，存在一定凹陷，沒有黏連聚集現象。

A. 宏觀圖像；B. 微觀圖像A. Macro image; B. Microscopic image圖1 宏觀和微觀形態表征Fig.1 Macroscopic and microscopic morphological characterization

2.1.2 粒徑測定 由圖2可知，微囊化SP4噬菌體微球的平均粒徑為(950±20) μm，變異系數小于4%。表明試驗得到的微囊化SP4噬菌體微球顆粒均勻，球形規整，該工藝能有效、均勻地完成對噬菌體的包被。

圖2 微囊化SP4噬菌體微球粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of microencapsulated SP4 phage microspheres

2.2 單因素試驗

2.2.1 CES濃度優化結果 微囊化SP4噬菌體微球的包封率與CES濃度相關，且隨著CES濃度的增大呈現先上升再下降的趨勢。其中，當CES濃度為2.4 g·dL時，包封率最高，為88.9%。表明，CES溶液的最佳濃度為2.4 g·dL(圖3A)。

A. GES最佳濃度測定結果；B. SA最佳濃度測定結果；C. XG最佳濃度測定結果；D. COS最佳濃度測定結果A. Determination results of the optimum concentration of GES; B. Determination results of the optimum concentration of SA; C. Determination results of the optimum concentration of XG; D. Determination results of optimal concentration of COS圖3 微囊化SP4噬菌體微球中GES、SA、XG、COS濃度優化的測定結果Fig.3 Optimization of GES, SA, XG and COS concentrations in microencapsulated SP4 phage microspheres

2.2.2 SA濃度優化 在SA選用濃度范圍里，微囊化SP4噬菌體微球的包封率隨SA濃度的增大呈現先上升再下降的趨勢，當SA溶液濃度為2 g·dL時，包封率達到峰值為94.2%。表明，SA溶液的最佳濃度為2 g·dL(圖3B)。

2.2.3 XG濃度優化結果 隨著XG濃度的升高，微囊化SP4噬菌體微球的包封率達到峰值后逐漸下降，包封率最高為94.2%，此時XG溶液濃度為1 g·dL。表明，XG溶液最佳濃度為1 g·dL(圖3C)。

2.2.4 COS濃度優化結果 在COS選用濃度范圍，微囊化SP4噬菌體微球的包封率隨COS濃度的增大呈現先上升再下降的趨勢，當COS溶液濃度為0.6 g·dL時，包封率達到峰值為,97.5%。表明，COS溶液最佳濃度為0.6 g·dL(圖3D)。

2.3 微囊化SP4噬菌體微球的pH穩定性

微囊化包被的SP4噬菌體經不同pH(2.0～10.0)SM液處理后，均存在活性。SM液pH為5.0～8.0 時，活性無明顯變化。當pH低于5.0或高于8.0時，有降低趨勢。在pH為2.0時，SP4噬菌體活性仍能達到10PFU·mL以上。結果表明，SP4噬菌體經微囊化包被后能有效提高酸堿耐受性(圖4)。

圖4 微囊化SP4噬菌體pH穩定性Fig.4 pH stability of microencapsulated SP4 phage

2.4 微囊化SP4噬菌體微球在不同溫度中的穩定性

微囊化包被的SP4噬菌體在不同溫度孵育后測效價，在10、20和30 ℃，微囊化包被的SP4噬菌體活性基本不變，而隨著溫度的升高，活性逐漸雖表現出下降趨勢，但在70 ℃高溫下作用1 h后，SP4噬菌體活性仍能達到10PFU·mL以上，表明SP4噬菌體經微囊化包被后在高溫環境下仍能保持較高活性(圖5)。

圖5 微囊化SP4噬菌體熱穩定性Fig.5 Thermal stability of microencapsulated SP4 phage

2.5 微囊化SP4噬菌體微球在模擬胃液中的穩定性

結果顯示，在不同pH模擬胃液中，SP4噬菌體的活性均隨著時間的增加而降低，直至完全失去活性。當pH2.0時，SP4噬菌體的總活性和比活性呈現0～30 min SP4噬菌體活性緩慢下降(<0.05)，30～60 min SP4噬菌體活性急速下降(<0.05)；當pH3.0時，SP4噬菌體的總活性和比活性呈現0～150 min SP4噬菌體活性緩慢下降(<0.05)，150～180 min SP4噬菌體活性急速下降(<0.05)。在SM緩沖液中SP4噬菌體的活性并未發生顯著變化(>0.05)。表明微囊化SP4噬菌體微球在模擬胃液中具有良好的耐受性(圖6)。

圖6 微囊化SP4噬菌體模擬胃液穩定性Fig.6 Stability of microencapsulated SP4 phage simulated gastric juice

2.6 微囊化SP4噬菌體微球在模擬腸液中的釋放行為

隨著時間的增加，模擬腸液中SP4噬菌體的效價逐漸升高，4 h之后，SP4噬菌體效價基本不變，表明微囊化SP4噬菌體微球中的SP4噬菌體全部釋放(圖7)。

圖7 微囊化SP4噬菌體模擬腸液釋放曲線Fig.7 Microencapsulated SP4 phage simulated intestinal fluid release curve

2.7 微囊化SP4噬菌體微球的保存穩定性研究

將濕態和干燥微囊化SP4噬菌體微球分別放置25和4 ℃中保存，每隔1周，測定微囊化SP4噬菌體微球效價，微球經干燥后效價略微降低。結果顯示，濕態的微囊化SP4噬菌體微球在4 ℃保存時，活性變化不顯著，干燥的微囊化SP4噬菌體微球在25和4 ℃中效價均降低，25 ℃時較為明顯，表明微囊化SP4噬菌體微球在4 ℃環境下保存具有較好的穩定性(圖8)。

圖8 微囊化SP4噬菌體保存穩定性Fig.8 Preservation stability of microencapsulated SP4 phage

3 討 論

噬菌體應用方式主要以口服為主，國內外大量研究表明，噬菌體通過口服進入，經過胃液作用后，活性降低甚至失活，因此，進入體內的噬菌體能更好發揮殺菌作用，就需要在經過胃液后仍能保持較高的活性，為了能夠提高噬菌體的活性，利用微囊化技術對其進行包被成為一種可行方法。

噬菌體直接進行包被其效果并不理想，本試驗發現，CES可有效改善這一現象，CES的正電荷和SP4噬菌體的負電荷相互結合，使SP4噬菌體的成分結合更加緊密，能夠提高SP4噬菌體微球的穩定性，既利于SP4噬菌體活性的保持，也使SP4噬菌體微球緩慢釋放噬菌體，延長SP4噬菌體在腸道殺菌時間。SA和CaCl的體系能夠實現對噬菌體的微囊化，主要是由于SA與Ca離子發生反應，形成海藻酸鈣聚合物，具有良好的生物降解性和生物相容性，有效地對SP4噬菌體進行微囊化。XG由于其具有較好的大分子特殊結構和膠體特性也常被用作微囊化材料，有文章研究證實，由SA和CaCl制備的微球易出現拖尾現象，形狀不規則，根據XG的膠體特性，加入XG與SA之間相互結合，可明顯改善此問題并提高包封率。納米TiO是一種新型納米材料，性質穩定，本身無毒，可被用于藥物的包被材料，韓雪等通過試驗證明，納米TiO可以顯著促進噬菌體對受體細菌的侵染效率，顯著增加噬菌體在細菌周圍的聚集，提高噬菌體的殺菌效果。COS通常是由殼聚糖加工生成，由于其具備較好的相容性、無毒、良好的成膜性，常被用作成膜材料，其效果比殼聚糖更佳，在SA和CaCl反應后，使用COS對微囊化SP4噬菌體微球進行覆膜，既可提高SP4噬菌體微球的穩定性，利于保藏，也不影響微球釋放SP4噬菌體。篩選出的這些包被材料價格低廉，簡單易得，在生產過程中不需要嚴苛的生產環境，可以降低生產成本，有利于大規模的工業生產。

在試驗期間發現，控制包被材料的濃度至關重要。當SA濃度過小時，混合液過于稀釋，不能形成微球，當SA濃度過大時，混合液過于黏稠，不易形成微球。可能是由于SA溶液與SP4噬菌體混合后體系穩定性下降的原因，所以需要用XG和SA進行混合，既能形成形狀規則的微球，也能提高微球的包封率。

生物制劑的微囊化包被技術在國內外已相對成熟，馬永生等研究表明，噬菌體經過微囊化包被后明顯提高了其在強酸中的存活時間，這與本試驗結果一致。本研究通過篩選多種不同特性的天然材料組合使用來彌補試驗過程中發現的SP4噬菌體包被產生的各項不足之處，進一步完善噬菌體的臨床抗菌效果。試驗表明，選用的多種天然材料間存在著較好的生物相容性，并對噬菌體包被的不足進行一一完善，效果明顯。雖然在pH為2.0和3.0的模擬胃液中長時間時也會失去活性，但有效地延長了SP4噬菌體存活的時間，與未包被的SP4噬菌體相比，SP4噬菌體保留了大量的活性，短時間內效價下降不顯著。有研究報道，噬菌體在高溫環境下容易失去活性，本研究顯示，微囊化SP4噬菌體微球在高溫環境下較未包被的噬菌體相比，有效地提高了SP4噬菌體的存活時間。經試驗，微囊化SP4噬菌體微球在去離子水中效價不變，證明其在去離子水中不釋放。海藻酸鈣凝膠具有pH響應特性，在酸性的胃部環境中，海藻酸鈣糖鏈上的羧基被質子化，糖鏈間發生氫鍵締合作用，微球表面形成不溶于水的海藻酸膠，即所謂的海藻酸外殼，凝膠結構不溶脹，可保護被包埋物質免受胃酸和消化酶的破壞；在pH中性的腸道環境中，海藻酸鈣凝膠發生溶脹，包埋物向外釋放。微囊化SP4噬菌體微球在腸液中釋放時，短時間內釋放較少，可能是因為僅微球表面少量SP4噬菌體脫離微球，隨著時間的增加，微球包被材料與腸液充分反應，微球破裂，SP4噬菌體快速釋放。噬菌體微囊化后在臨床抗菌應用時不僅要以較高的活性通過胃液進入到腸液中，還要能夠在腸液中將噬菌體釋放出來，從而達到抗菌的效果，本研究證實，篩選出的微囊化包被材料能夠實現這一點，這也是該微囊化噬菌體微球的優勢之一。

目前，抗生素的大量使用，導致細菌耐藥性愈發嚴重，噬菌體作為殺菌物質具有很大的優勢和應用潛力。本研究將SP4噬菌體進行微囊化包被，對其臨床抗菌應用過程中的問題進行研究，以期能在很大程度上彌補抗生素的缺陷，在雞源細菌防治中起重要的作用。

4 結 論

通過陽離子醚化淀粉/海藻酸鈉/黃原膠/納米TiO/殼寡糖體系的制備方法能夠有效地包封SP4噬菌體，包封率較高，包被后酸堿耐受性、熱穩定性、模擬胃液穩定性、保存穩定性及模擬腸液釋放行為良好。本試驗結果為進一步采用多因素試驗制備微囊化沙門菌SP4噬菌體奠定了基礎。