組蛋白去乙?；敢种苿π》雌c獸疫病毒復(fù)制的影響

潘春容，鄧瑞雪，胡林杰，朱學(xué)亮，孫躍峰，王桂榮，蒙學(xué)蓮*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，在我國被列為一類病原微生物。PPRV感染山羊、綿羊等引起的小反芻獸疫(PPR)具有較高的發(fā)病率和死亡率，在非洲、中東和亞洲等地區(qū)流行并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，被OIE列為法定上報的動物傳染病，在我國屬于一類動物疫病。2007年,我國西藏首次暴發(fā)PPR，2013―2014年,該病迅速傳播、流行于22個省區(qū)，2018年，在我國甘肅西北部造成少量綿羊死亡。鑒于該病對養(yǎng)殖業(yè)尤其是養(yǎng)羊業(yè)的影響，OIE和FAO制定了為期15年(2015―2030年)的全球小反芻獸疫根除計劃。目前，PPR尚無有效的治療方法，防控的主要措施是疫苗免疫，但是傳統(tǒng)的減毒活疫苗存在無法區(qū)分自然感染動物和免疫動物、熱穩(wěn)定性低等缺陷，限制了其使用范圍，重組標(biāo)記疫苗的開發(fā)雖大有成效，但要普遍應(yīng)用還為時尚早，因而探索影響PPRV復(fù)制的因素對于獸醫(yī)學(xué)研究以及經(jīng)濟(jì)意義至關(guān)重要。

組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)是一類蛋白酶，通過調(diào)控組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態(tài)調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生命活動過程，其中，包括炎癥反應(yīng)和抗病毒免疫反應(yīng)。組蛋白去乙酰化酶有18個家族成員，分為4類：Ⅰ類包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；II類可以細(xì)分為IIa類(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)和IIb類(HDAC6和HDAC10)；III類為Sirtuins家族，屬于NAD依賴性的Sir2超蛋白家族，含有SIRT1～SIRT7七個成員；IV類僅有HDAC11。

HDACs 抑制劑是一類小分子化合物，通過抑制HDACs活性調(diào)控蛋白質(zhì)的乙?；?，已被廣泛應(yīng)用以揭示HDACs的作用機(jī)制。HDACs 抑制劑能夠調(diào)控病毒復(fù)制，如SAHA、PCI-34051能夠抑制丙肝病毒(HCV)復(fù)制，Tubastatin A能夠抑制日本腦炎病毒(JEV) 復(fù)制。然而，HDACs抑制劑在PPRV感染過程中的作用尚未見報道。因此,本研究選用不同作用譜的HDACs抑制劑Nicotinamide(NIC，SIRT家族的抑制劑)、Vorinostat(SAHA，廣譜HDAC家族抑制劑)、Trichostatin A(TSA，廣譜HDAC家族抑制劑)、Mocetinostat(MGCD0103，Ⅰ類HDACs抑制劑，主要作用于HDAC1/2/3/11)、TMP269(Ⅱa類HDACs抑制劑，作用于HDAC4/5/7/9)、Tubastatin A(HDAC6抑制劑)和 PCI-34051(HDAC8抑制劑)，分析其對PPRV復(fù)制的影響，為進(jìn)一步研究HDACs調(diào)控PPRV感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero細(xì)胞和PPRV Nigeria75/1毒株由本實驗室保存；Mocetinostat(MGCD0103)、TrichostatinA(TSA)、Vorinostat(SAHA)、TMP269、PCI-34051、Tubastatin A、NIC購自SELLECK公司；CCK-8試劑盒購自APExBIO公司；Anti-N Antibody由本實驗室提供；鼠源抗β-Actin Antibody購自Proteintech公司；Rabbit Anti-Mouse Antibody購自Bioss ANTIBODIES公司；PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、TB GreenPremix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)、One Step TB GreenPrimeScriptRT-PCR Kit (Perfect Real Time)、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0購自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM購自甘肅健順生物科技有限公司；胎牛血清、青鏈霉素購自Biological industries公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染 Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含有胎牛血清(100 mL·L)、青鏈霉素(10 mL·L)的DMEM培養(yǎng)基中，在50 mL·LCO、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時接種PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后,更換新鮮的含10 mL·L胎牛血清、10 mL·L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于50 mL·LCO、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試驗 100 μL Vero細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)2×10～3×10)接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后加入10 μL不同濃度HDACs抑制劑NIC、SAHA、TSA、MGCD0103、TMP269、Tubastatin A、PCI-34051(溶劑為DMSO)，以DMSO為對照，孵育48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度值。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 RNA提取和RT-qPCR 按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書提取RNA，按照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)TB GreenPremix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，測定s基因相對水平。反應(yīng)體系：Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，cDNA 2 μL， 上、下游引物(20 μmol·L)各0.2 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，ddHO 7.2 μL，共20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性3 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)。利用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取病毒RNA，根據(jù)One Step TB GreenPrimeScriptRT-PCR Kit (Perfect Real Time)說明書設(shè)置反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，測定PPRV基因相對水平。反應(yīng)體系：2× One Step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U·μL)0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，RNA 2 μL，上、下游引物(20 μmol·L) 各0.2 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，ddHO 6.4 μL，共20 μL。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃5 min，95 ℃10 s。PCR：95 ℃預(yù)變性5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)。根據(jù)NCBI中PPRV基因序列和綠猴()1～11以及-基因序列設(shè)計引物，引物序列見表1。每個樣本設(shè)置2個重復(fù)孔，采用2-ΔΔ法計算相對基因水平，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇GraphPad Prism8.2.1軟件test或Multipletests方法進(jìn)行差異性分析。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 The primers for RT-qPCR

1.2.4 Western blot檢測 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入預(yù)冷的RIPA裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g·L脫脂奶粉室溫封閉2 h， PPRV N蛋白抗體(1∶1 000)、β-Actin抗體(1∶5 000)4 ℃ 孵育過夜，HRP標(biāo)記的Rabbit Anti-Mouse Antibody(1∶5 000)室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色后，在超靈敏多功能成像儀(GE Amersham Imager 600)中曝光成像。

1.2.5 TCID試驗 用無血清DMEM培養(yǎng)基將病毒原液進(jìn)行倍比稀釋，10～10，稀釋好的病毒液依次加入到96孔板中，每孔100 μL，每稀釋度重復(fù)接種8孔，無血清DMEM培養(yǎng)基作為對照；向每孔加入細(xì)胞懸液100 μL(細(xì)胞數(shù)2×10～3×10)。 37 ℃培養(yǎng)5～7 d，逐日觀察細(xì)胞病變情況，并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，按照Reed-Muench兩氏法計算TCID。

2 結(jié) 果

2.1 PPRV感染對HDACs轉(zhuǎn)錄的影響

為了驗證是否參與PPRV感染過程，Vero細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時接種PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)RNA，通過RT-qPCR方法檢測不同mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，PPRV感染顯著增加了2的轉(zhuǎn)錄，但對其余家族成員的轉(zhuǎn)錄量沒有明顯作用(圖1)。

*.P<0.05圖1 PPRV感染后HDACs mRNA表達(dá)的變化Fig.1 The mRNA expression of HDACs after PPRV infection

2.2 HDACs抑制劑對Vero細(xì)胞毒性作用檢測

為了確定HDACs抑制劑的最適使用濃度，使用CCK-8試劑盒對NIC、SAHA、TSA、MGCD0103、TMP269、TubastatinA、PCI-34051的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，終濃度為0.625～20.000 μmol·L的PCI-34051基本無細(xì)胞毒性，TMP269有輕微細(xì)胞毒性；終濃度為0.625～10.000 μmol·L的NIC和TubastatinA沒表現(xiàn)出細(xì)胞毒性；SAHA、TSA和MGCD0103的細(xì)胞毒性較強(qiáng)(圖2)。據(jù)此結(jié)果，確定了HDACs抑制劑的使用濃度，PCI-34051和TMP269為20 μmol·L；NIC和Tubastatin A為10 μmol·L；SAHA為1 μmol·L；TSA和MGCD0103為0.5 μmol·L。

A.PCI-34051; B.SAHA; C.TMP269;D.Tubastatin A; E.MGCD0103; F.NIC; G.TSA圖2 不同的HDACs抑制劑對Vero細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of different HDACs inhibitors on Vero cell viability

2.3 篩選影響PPRV復(fù)制的HDACs抑制劑

Vero細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時接種PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，并加入HDACs抑制劑處理，MGCD0103終濃度為0.25和0.5 μmol·L，其余抑制劑終濃度見“2.2”，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測。與對照組(DMSO處理組)相比，TMP269和SAHA能明顯抑制PPRV N蛋白的表達(dá)；0.5 μmol·LMGCD0103對PPRV N蛋白的下調(diào)作用較0.25 μmol·L的明顯(圖3)。

A.Western blot; B.灰度值分析。*.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.001,下圖同A.Western blot; B.Gray value analysis. *.P<0.05, **.P<0.01,***.P<0.001, the same as below圖3 不同HDACs抑制劑對PPRV復(fù)制的影響Fig.3 Effect of different HDACs inhibitors on PPRV replication

2.4 SAHA、TMP269、MGCD0103對PPRV復(fù)制的抑制作用

2.4.1 RT-qPCR分析 分別用SAHA、TMP269、MGCD0103處理感染PPRV的Vero細(xì)胞(處理方法同“2.3”，終濃度見“2.2”)，培養(yǎng)120 h后收集樣品，提取病毒RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示，SAHA、TMP269、MGCD0103能顯著(<0.05,<0.05,<0.01)降低PPRVRNA水平(圖4)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖4 SAHA、TMP269、MGCD0103處理PPRV感染的Vero細(xì)胞后，PPRV N RNA相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of PPRV N RNA in PPRV-infected Vero cells treated with SAHA, TMP269, MGCD0103

2.4.2 Western blot分析 SAHA、TMP269、MGCD0103處理感染PPRV的Vero細(xì)胞(同“2.4.1”)，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144 h后收集樣品，Western blot檢測。結(jié)果顯示，SAHA、TMP269、MGCD0103對PPRV N蛋白的表達(dá)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用，其中,TMP269和MGCD0103的抑制作用較SAHA的更強(qiáng)(圖5)。

A、B.SAHA; C、D.TMP269; E、F.MGCD0103; A、C、E.Western blot; B、D、F.灰度值分析A， B.SAHA; C,D. TMP269; E,F.MGCD0103; A,C,E.Western blot; B,D,F.Gray value analysis圖5 SAHA、TMP269、MGCD0103處理不同時間對PPRV N蛋白表達(dá)的抑制Fig.5 Inhibition of PPRV N protein expression by SAHA, TMP269 and MGCD0103 at the different time of PPRV infection

為了進(jìn)一步分析SAHA、TMP269、MGCD0103對PPRV復(fù)制的抑制作用，以不同濃度抑制劑處理PPRV感染細(xì)胞(處理方法同“2.4.1”)，培養(yǎng)48 h后,Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAHA、TMP269、MGCD0103對PPRV N蛋白表達(dá)的影響具有明顯的劑量負(fù)相關(guān)性(圖6)。

A、D.SAHA; B、E.TMP269;C、F.MGCD0103; A～C. Western blot; D～F.灰度值分析A,D.SAHA; B,E.TMP269;C、F.MGCD0103; A-C. Western blot; D-F. Gray value analysis圖6 不同濃度的SAHA、TMP269、MGCD0103對PPRV N蛋白表達(dá)的抑制Fig.6 Inhibition of different concentrations of SAHA,TMP269 and MGCD0103 on PPRV N protein expression

2.4.3 TCID檢測 SAHA、TMP269、MGCD0103處理感染PPRV的Vero細(xì)胞(同“2.4.1”)，培養(yǎng)120 h 收樣，TCID法檢測病毒滴度。結(jié)果顯示，SAHA、TMP269、MGCD0103均可顯著降低病毒TCID(圖7)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖7 SAHA、TMP269、MGCD0103處理PPRV感染的Vero細(xì)胞后，PPRV病毒滴度的變化Fig.7 Changes of PPRV virus titers in PPRV-infected Vero cells treated with SAHA, TMP269, MGCD0103

3 討 論

組蛋白乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制，主要由組蛋白乙?；?histoneacetylases，HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases，HDACs)共同催化完成。HDACs在多種病毒感染中調(diào)控病毒復(fù)制和機(jī)體發(fā)病，比如皰疹病毒(herpesviruses)、流感病毒(influenzavirus)、柯薩奇病毒(coxsackievirus)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)等。本試驗發(fā)現(xiàn)PPRV感染能夠誘導(dǎo)2 mRNA的表達(dá)，表明HDAC2可能參與調(diào)控PPRV的復(fù)制過程。HDAC2表達(dá)水平的升高可影響Ⅰ型IFN受體和IRF9、STAT2的乙酰化水平，抑制ISGs的表達(dá)，從而抑制Ⅰ型IFN的抗病毒作用，促進(jìn)病毒復(fù)制。這與本試驗中Ⅰ類HDACs抑制劑MGCD0103 抑制PPRV RNA水平、蛋白水平的表達(dá)，降低病毒滴度的結(jié)果相吻合，推測PPRV誘導(dǎo)表達(dá)HDAC2以抑制Ⅰ型IFN信號通路可能是PPRV逃避宿主抗病毒反應(yīng)的機(jī)制之一。與PPRV同屬于副黏病毒科的RSV感染也能夠上調(diào)HDAC2的表達(dá)，降低組蛋白H3的乙?；剑瑧?yīng)用HDACs抑制劑SAHA和TSA處理后，組蛋白乙?；缴?，RIG-I、IFN-β1表達(dá)顯著增加，不但抑制RSV的感染，還能減輕感染導(dǎo)致的氣道炎癥。這是病毒逃避宿主先天抗病毒反應(yīng)的另一種機(jī)制，即下調(diào)模式識別受體(RIG-I、TLR、MDA5等)或減少病原相關(guān)模式分子以避免被宿主識別，或者抑制IFN產(chǎn)生。HDAC1和HDAC2也能通過調(diào)控細(xì)胞周期影響病毒復(fù)制，其特異性抑制劑FK228處理HBV感染的HepAD38細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后，抑制細(xì)胞周期正調(diào)節(jié)因子(cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、p-Rb、p-CDK2)的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而促進(jìn)HBV的復(fù)制。此外，PPRV感染后Vero細(xì)胞中其余HDAC家族成員的表達(dá)也有一定變化，HDAC1和HDAC5的表達(dá)有增加趨勢，只是不顯著，這可能與這些家族成員的表達(dá)量有關(guān)，尤其是HDAC8和HDAC9，在Vero細(xì)胞中幾乎檢測不到。因為HDACs表達(dá)具有組織特異性，人基因轉(zhuǎn)錄組中HDACs的組織分布顯示，正常腎組織中僅有HDAC2表達(dá)量最高，HDAC1、HDAC3次之，約為HDAC2的四分之一，Ⅱa類HDACs表達(dá)量無數(shù)據(jù)或檢測不到。本試驗中Ⅱa類HDACs抑制劑TMP269能夠顯著下調(diào)PPRV RNA和蛋白表達(dá)，顯著降低PPRV TCID，說明Ⅱa類HDACs(HDAC4-5、HDAC7、HDAC9)可能也參與調(diào)控PPRV感染，促進(jìn)病毒復(fù)制。HDAC4能夠抑制TBK1和IKKε對IRF3的磷酸化，進(jìn)而阻止IRF3轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，降低IRF3介導(dǎo)的IFN-β表達(dá)。HDAC4也能夠促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的JAK-STAT信號通路和ISGs的表達(dá)，是痘苗病毒(VACV)復(fù)制的限制因子，被C6蛋白降解。HDAC5與HDAC4同源性最高，也能限制VACV復(fù)制，被C6蛋白降解。后續(xù)試驗中，作者將通過構(gòu)建Ⅰ類和Ⅱa類HDACs敲除細(xì)胞系，進(jìn)一步探究HDACs調(diào)控PPRV復(fù)制的機(jī)制。

目前，對PPR的防控、根除仍是以養(yǎng)羊業(yè)為主要經(jīng)濟(jì)來源地區(qū)和國家的一大難題，今年以來，我國新疆、青海部分地區(qū)仍有散發(fā)疫情。抗病毒藥物可以作為疫苗防疫的補(bǔ)充措施，降低PPR引起的經(jīng)濟(jì)損失，有助于全球小反芻獸疫根除計劃。現(xiàn)已證實，合歡屬植物提取物和一些合成的化合物、銀納米顆粒等具有抑制PPRV作用?？共《舅幬锏陌悬c主要是病毒相關(guān)分子和宿主相關(guān)分子，病毒對作用于宿主分子的抗病毒藥物更難產(chǎn)生抗性。Favipiravir是病毒RdRp的抑制劑，能夠抑制PPRV吸附、侵入、復(fù)制和子代病毒顆粒的釋放。而brequinar、leflunomide、6-azauracil、ribavirin、mycophenolic acid是細(xì)胞內(nèi)嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成所需酶的抑制劑，通過阻礙核苷酸合成進(jìn)而抑制病毒DNA/RNA合成。作用于宿主細(xì)胞HDACs的抑制劑已表現(xiàn)出清除病毒感染的作用。隨著對HDACs與病毒感染研究的不斷深入，HDACs抑制劑為治療病毒感染及相關(guān)疾病提供了一種新的選擇。本試驗中，Ⅱa類HDACs抑制劑TMP269的細(xì)胞毒性低，且對PPRV病毒復(fù)制的抑制作用顯著，在后續(xù)試驗中進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，或許可以為抗PPRV感染提供新的思路。

4 結(jié) 論

PPRV感染能夠誘導(dǎo)HDAC2的表達(dá)，HDACs抑制劑SAHA、TMP269、MGCD0103在PPRV RNA、蛋白水平和病毒滴度方面均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明Ⅰ類HDACs和Ⅱa類HDACs在PPRV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。