弓形蟲和新孢子蟲交叉反應抗原MIC7A對小鼠的免疫保護效力分析

陳慧嫻，陳雅婕，王先梅，王麗芳，劉 群,2，劉 晶,2*

(1. 中國農業大學動物醫學院，國家動物寄生原蟲實驗室，北京 100193；2. 中國農業大學動物醫學院,農業農村部動物流行病學重點實驗室，北京 100193)

弓形蟲和新孢子蟲是兩種親緣關系十分接近的胞內寄生的頂復亞門原蟲，均可造成孕畜的生殖障礙以及新生仔畜的運動、神經障礙，并給全球畜牧養殖業帶來巨大的經濟損失。由于二者在形態特征、生活史、宿主范圍、臨床癥狀等方面高度相似，直至1988年Dubey 等對新孢子蟲進行命名，才將其與弓形蟲分開。

生產中，弓形蟲和新孢子蟲共感染的現象非常常見。Lindsay等發現新孢子蟲Nc1株免疫的小鼠能對弓形蟲TS-4弱毒株感染產生抵抗力；弓形蟲Pru、VEG蟲株免疫小鼠，也對新孢子蟲Nc1株的再感染有一定抵抗作用，這說明弓形蟲和新孢子蟲之間存在一定程度的交叉免疫保護現象。弓形蟲和新孢子蟲存在很多相似的蛋白，二者之間存在多種交叉反應抗原，這些交叉反應抗原可以誘導宿主對弓形蟲或新孢子蟲的感染產生類似的免疫應答，這種交叉免疫保護作用很可能是基于交叉反應抗原產生的。找到具有交叉保護作用的抗原是防控這兩種寄生蟲病的關鍵環節。

凌慧芳分別將結合了抗弓形蟲蛋白IgG抗體、抗新孢子蟲蛋白IgG抗體的Protein A/G與弓形蟲蟲體蛋白共同孵育，對免疫沉淀富集物進行質譜分析，獲得弓形蟲和新孢子蟲的交叉反應蛋白662種，包括致密顆粒蛋白、微線蛋白、棒狀體蛋白和細胞骨架蛋白等。其中，弓形蟲的微線蛋白(MICs)參與蟲體的滑行運動和入侵宿主細胞，在毒力和致病性方面發揮重要的作用，也是近幾十年來弓形蟲疫苗的熱門候選抗原類型之一。TgMIC1和TgMIC4可以刺激小鼠產生Th1型免疫反應，誘導針對弓形蟲的保護性免疫；TgMIC6能夠誘導慢性弓形蟲感染小鼠的CD4T細胞和CD8T細胞產生IFN-γ，免疫小鼠后也能有效減輕弓形蟲感染帶來的危害；此外，TgMIC3以及TgAMA1等微線蛋白均具有較好的免疫原性，是弓形蟲疫苗研究的候選抗原。

結合蛋白質組學和生物信息學分析結果，作者從662種交叉反應蛋白集合中篩選出弓形蟲微線蛋白17A(TgMIC17A)。TgMIC17A是一種微線蛋白，具有信號肽結構，無跨膜區，具有分泌蛋白的基本特征。抗原表位預測分析顯示，MIC17A有5個抗原表位，提示該蛋白可能具備較好的免疫原性。同時，MIC17A在弓形蟲不同蟲株中的轉錄水平都較高，在子孢子、速殖子、緩殖子3個階段均可以穩定地高水平轉錄。以上數據提示，MIC17A是很有潛力的疫苗候選因子。本研究對TgMIC17A進行克隆、表達、鑒定，并通過小鼠免疫保護試驗，評估重組抗原對弓形蟲和新孢子蟲感染的交叉保護效力。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a原核表達質粒、鼠源弓形蟲陽性血清、鼠源新孢子蟲陽性血清、弓形蟲Pru株、Vero細胞由國家動物寄生原蟲實驗室保存；新孢子蟲Nc1株，經Dubey授權，由日本帶廣畜產大學國家原蟲研究所玄學南教授饋贈，本實驗室傳代和保存；同源重組相關試劑、實時熒光定量PCR相關試劑購自北京全式金生物技術有限公司；PCR相關試劑購自北京聚合美生物科技有限公司；免疫印跡相關試劑購自北京華興博創基因技術有限公司；HRP標記羊抗鼠IgG二抗、ELISA相關試劑購自北京邁晨科技有限公司；4～5周齡的雌性 BALB/c小鼠(SPF級)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與重組蛋白的原核表達、鑒定 按照基因號TGGT1_200250在ToxoDB數據庫中找到TgMIC17A對應的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，在引物兩端引入pET-28a(+)載體的同源臂(下劃線標記)。F：5′-CTGCAATCTCCAG GGCTC-3′，R：5′-GCATGTGATATCGCCTGC-3′。以弓形蟲cDNA為模板，擴增TgMIC17A基因全長。將獲得的目的基因片段與pET-28a(+)骨架進行同源重組，連接產物送北京睿博生物科技公司測序鑒定。

將測序正確的pET-28a-TgMIC17A轉化至表達菌Rosetta(DE3)中，IPTG(0.8 mmol·L，37 ℃)誘導重組蛋白表達，分離上清與包涵體，進行包涵體復性，SDS-PAGE分析復性蛋白的大小與純度。

以鼠源His單抗(1∶2 000)為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗進行免疫印跡分析。同時，分別以鼠源弓形蟲陽性血清和鼠源新孢子蟲陽性血清(1∶300)為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG為二抗進行免疫印跡試驗，分析重組蛋白的反應原性和交叉反應性。

1.2.2 小鼠的免疫程序及抗體水平檢測 將30只4～5周齡雌性BALB/c小鼠隨機分成5組并進行標記，每組6只小鼠。小鼠的試驗分組、免疫劑量、攻蟲劑量設計如表1所示。

表1 小鼠的試驗分組情況Table 1 Experimental grouping of mice

每次免疫間隔10 d，每組小鼠均免疫兩次。初次免疫，每只小鼠的重組蛋白免疫量為100 μg，應用弗氏完全佐劑與重組蛋白1∶1混合乳化；二次免疫，每只小鼠的重組蛋白免疫量為50 μg，應用弗氏不完全佐劑與重組蛋白1∶1混合乳化。兩次均采用背部皮下多點注射進行免疫。

于第二次免疫后10 d，每組隨機取1只小鼠進行眼底靜脈叢采血，每只小鼠收集200～300 μL血液于1.5 mL離心管中，37 ℃溫箱放置1 h，再于4 ℃冰箱放置過夜析出血清，4 000 r·min離心20 min，收集血清。以TgMIC17A重組蛋白作為包被抗原(2 μg·mL， 每孔100 μL)，以小鼠血清為一抗(1∶100)，以HRP標記羊抗鼠IgG為二抗(1∶5 000)進行酶聯免疫吸附試驗，測定血清抗體水平。

1.2.3 小鼠攻蟲試驗 于第二次免疫10 d后，按照表1對各組小鼠進行攻蟲，觀察小鼠的臨床癥狀，每4 d記錄一次體重，同時記錄死亡時間和存活率。存活小鼠持續觀察30 d后處死，采集小鼠腦組織并提取DNA。根據小鼠的28S基因和弓形蟲的529基因序列、新孢子蟲的Nc5基因設計特異性引物，對小鼠腦組織荷蟲量進行實時熒光定量PCR檢測。28S基因：上游引物(P)5′-TGCCATGGTAATCCTGCTCA-3′，下游引物(P)5′-CCTCAGCCAAGCACATACACC-3′；529基因：上游引物(P)5′-CACAGAAGGGACAGAAGT-3′，下游引物(P)5′-TCGCCTTCATCTACAGTC-3′；Nc5基因：上游引物(P)5′-ACTGGAGGCACGCTGAACAC-3′，下游引物(P)5′-AACAATGCTTCGCAAGAGGAA-3′。通過比較未免疫組和免疫組小鼠在攻蟲后的體重變化、存活率、腦組織荷蟲量，評價TgMIC17A對弓形蟲感染小鼠的免疫保護性，對新孢子蟲感染小鼠的交叉免疫保護性。

2 結 果

2.1 基因克隆與重組蛋白的原核表達、鑒定

經生物信息學分析，TgMIC17A的mRNA序列包含1 056個堿基，蛋白序列包含351個氨基酸，相對分子質量大小為38.7 ku，等電點為8.21，無跨膜區，N端0—29 aa處為信號肽。根據ToxoDB數據庫中的信息可知，TgMIC17A在弓形蟲不同蟲株中的轉錄水平，及在蟲體的不同發育時期的轉錄水平均較高。TgMIC17A和NcMIC17A的相同氨基酸比例為59%，氨基酸相似性為75%，提示存在一定的交叉性。

PCR擴增得到大小為1 053 bp的單一片段(圖1A)，與pET-28a(+)骨架進行單片段連接，測序結果與ToxoDB數據庫中基因序列完全符合，證明原核表達載體構建成功。TgMIC17A重組蛋白主要在包涵體中表達，大小約為40 ku(圖1B)，與預期相符。

A. TgMIC17A基因克隆結果(M. DL5000 DNA相對分子質量標準；1. TgMIC17A基因克隆產物)；B. 重組蛋白表達情況(M. 蛋白質相對分子質量標準；1. 未誘導菌液；2. 誘導后菌液；3. 裂解后上清液；4. 裂解后包涵體沉淀)A. Amplification of TgMIC17A gene (M. DL5000 DNA marker; 1. TgMIC17A gene); B. Recombinant protein expression (M. Protein marker; 1. Uninduced; 2. Induced; 3. Supernatant; 4. Inclusion bodies)圖1 TgMIC17A基因克隆與重組蛋白的原核表達Fig.1 Cloning of TgMIC17A gene and prokaryotic expression of protein

Western blot結果顯示,重組蛋白可與鼠源His單抗發生反應，且條帶大小符合預期結果，約為40 ku，證明所收集的蛋白確定為帶有6×His標簽的TgMIC17A重組蛋白(圖2A)；同時該蛋白可與鼠源弓形蟲陽性血清和鼠源新孢子蟲陽性血清發生反應，證明該蛋白具有良好的反應原性且及交叉反應性(圖2A、B)。

A. TgMIC17A的表達情況、反應原性驗證(M. 蛋白相對分子質量標準；1. TgMIC17A重組蛋白與His-mAb反應；2. TgMIC17A重組蛋白與弓形蟲陽性血清反應；3. 陽性對照-弓形蟲全蟲抗原與弓形蟲陽性血清反應)；B. TgMIC17A的交叉反應性鑒定(M. 蛋白相對分子質量標準；1. 陽性對照-新孢子蟲全蟲抗原與新孢子蟲陽性血清反應；2、3. TgMIC17A重組蛋白與新孢子蟲陽性血清反應)A. Protein expression and antigenicity verification (M. Protein marker; 1. rTgMIC17A reacts with His-mAb; 2. rTgMIC17A reacts with T. gondii positive serum antibody; 3. Positive control-T. gondii lysate antigen reacts with T. gondii positive serum antibody); B. Recombinant protein expression (M. Protein marker; 1. Positive control-N. caninum lysate antigen reacts with mouse N. caninum positive serum antibody; 2，3. rTgMIC17A reacts with N. caninum positive serum antibody)圖2 TgMIC17A重組蛋白的免疫印跡結果Fig.2 Western blot results of rTgMIC17A

2.2 TgMIC17A交叉免疫保護效力的研究

2.2.1 重組蛋白免疫小鼠后產生的抗體水平 采用間接ELISA測定各組小鼠產生的IgG抗體水平。結果顯示(圖3)，TgMIC17A重組蛋白免疫小鼠，可以誘導小鼠產生特異性IgG抗體，免疫組與對照組的IgG水平之間存在顯著性差異(<0.01)。

**. P<0.01圖3 TgMIC17A重組蛋白免疫小鼠后產生的IgG水平Fig.3 Antibody levels produced after immunized mice with rTgMIC17A

2.2.2 小鼠的相對體重變化 攻蟲后每4 d稱量一次小鼠的體重，以首次稱量的小鼠體重為基準，繪制相對體重變化曲線(圖4)。小鼠感染弓形蟲后，出現增重抑制情況，平均體重從第4天開始下降，至第16天降到最低，然后開始回升。比較各組小鼠的體重變化幅度，未免疫組小鼠的體重下降幅度最大，與空白組、免疫組存在顯著性差異；而免疫組小鼠體重下降幅度小，與空白組之間沒有顯著性差異；小鼠感染新孢子蟲后，各組小鼠體重均整體呈上升趨勢，沒有顯著性差異。

A. 小鼠感染弓形蟲后的相對體重變化[“*”表示未免疫+Pru組小鼠的體重與空白對照組小鼠的體重有顯著差異(P<0.05)，“**”表示有極顯著差異(P<0.01)；“#”表示攻蟲后免疫組小鼠的體重與未免疫組小鼠的體重有顯著差異(P<0.05)]；B. 小鼠感染新孢子蟲后的相對體重變化(“ns”表示空白組、未免疫組、免疫組小鼠的體重均無顯著差異)A. Relative body weight of mice after challenge with T. gondii ("*" means that the relative body weight of the mice in the unimmunized group is significantly different from that of the blank control group (P<0.05), and "**" means that there is a very significant difference (P<0.01); B. Relative body weight of mice after challenge with N. caninum ("ns" means that there is no significant difference in the relative body weight of mice in the blank group, unimmunized group and immunized group)圖4 小鼠攻蟲后的相對體重變化Fig.4 Relative body weight of mice after challenge

2.2.3 小鼠的存活率 小鼠在感染弓形蟲后，未免疫組在第8天有1只小鼠死亡，其余小鼠存活，存活率為83.3%；免疫組小鼠全部存活，存活率為100.0%；小鼠在感染新孢子蟲后，未免疫組和免疫組小鼠均全部存活，存活率為100.0%；空白組小鼠全部存活。免疫組小鼠均表現出相對更輕的臨床癥狀，且先于未免疫組小鼠開始好轉。

2.2.4 小鼠腦荷蟲量檢測 取小鼠腦組織提取DNA，采用實時熒光定量PCR檢測小鼠腦組織中弓形蟲或新孢子蟲的荷蟲量，評價TgMIC17A重組蛋白免疫小鼠對兩種寄生蟲感染的保護作用。結果顯示(圖5)，無論是感染弓形蟲還是新孢子蟲，免疫組小鼠的腦荷蟲量均顯著低于未免疫組小鼠。

A.感染弓形蟲；B.感染新孢子蟲。**. P<0.01A. T. gondii infection; B. N. caninum infection. **. P<0.01圖5 小鼠感染弓形蟲、新孢子蟲后腦荷蟲量Fig.5 Parasites load in brain of mice infected with T. gondii and N. caninum

3 討 論

弓形蟲病和新孢子蟲病給全球的畜牧養殖業造成嚴重的損失，迄今為止，尚未篩選到治療這兩種疾病的有效藥物，開發安全有效的疫苗是研究熱點之一。尋找這兩種寄生蟲的交叉保護抗原，為動物提供更強的交叉保護作用是篩選候選疫苗的途徑之一。

目前，被證實的弓形蟲和新孢子蟲的交叉反應抗原包括頂膜抗原AMA1、蛋白質二硫鍵異構酶PDI、熱休克蛋白HSP70、核糖體磷酸蛋白P0、核糖體蛋白RP1、緩殖子表面蛋白BAG5、免疫相關蛋白IMP1、微線蛋白MIC3等。但并非所有的交叉反應抗原都能保護動物抵抗弓形蟲和新孢子蟲的感染，例如弓形蟲緩殖子階段特異性蛋白BAG5，其抗體只與新孢子蟲緩殖子發生反應，不與新孢子蟲速殖子發生反應，即對新孢子蟲速殖子的感染沒有保護力。目前，有交叉免疫保護效果的抗原，多是與寄生蟲入侵、增殖密切相關的蛋白。例如TgAMA1是弓形蟲入侵過程中的必要蛋白，條件性敲除后，弓形蟲不能入侵宿主細胞，NcAMA1的抗體能有效抑制新孢子蟲和弓形蟲的入侵；PDI在蟲體入侵宿主及增殖過程中發揮重要的作用，TgPDI和NcPDI的單抗可以抑制弓形蟲和新孢子蟲的生長；MIC3是蟲體入侵時重要的黏附分子之一，TgMIC3重組蛋白免疫小鼠感染弓形蟲后可延長存活時間，感染新孢子蟲后腦荷蟲量明顯降低，這提示人們在尋找具有疫苗潛力的交叉反應抗原時，可以將對蟲體入侵宿主細胞至關重要的蛋白作為候選。

前期研究顯示，MIC17A是一種可被分泌到胞外的微線蛋白，在弓形蟲和新孢子蟲中的同源性較高，且具有交叉反應性。TgMIC17A重組蛋白免疫小鼠后，原計劃比較未免疫組小鼠與免疫組小鼠感染弓形蟲或新孢子蟲的存活率，但由于蟲株毒力經多次傳代變弱、小鼠之間存在個體差異等原因，未免疫組與免疫組之間沒有顯著差異。因此，通過檢測存活小鼠腦荷蟲量評價TgMIC17A的免疫保護效果。感染Pru后，免疫組小鼠的臨床癥狀、增重抑制情況相較于對照組明顯減輕，且腦荷蟲量顯著降低，說明免疫組小鼠對弓形蟲感染產生了良好的免疫保護力；感染Nc1后，免疫組小鼠的增重抑制情況沒有明顯改善，但腦荷蟲量顯著降低，說明免疫組小鼠對新孢子蟲的感染產生了一定的免疫保護力。

4 結 論

MIC17A是弓形蟲和新孢子蟲的交叉反應抗原。本研究成功表達了TgMIC17A重組蛋白，TgMIC17A重組蛋白對弓形蟲和新孢子蟲感染具有交叉免疫保護效果，為篩選具有交叉免疫保護力的重組蛋白疫苗提供了可借鑒的資料。