β-雌二醇和孕酮促進非洲豬瘟病毒體外復制

袁興國，申超超，趙登率，楊 博，崔卉梅，郝 雨，楊金柯，陳學輝，張 婷，張克山*，劉 霞，鄭海學，劉湘濤

(1.甘肅農業大學生命科學技術學院,蘭州 730070； 2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州大學獸醫學院，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730000)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是重要的豬傳染性疾病，對全球養豬業造成毀滅性的影響。ASF最早于20世紀初在東非被發現，是一種發病率和死亡率都很高的出血性疾病。由于缺乏安全的商品化疫苗，它會造成不可避免的重大經濟損失，其防控方式一般為屠宰感染動物以及對疫區進行物理隔離，來阻斷其傳播。在ASF暴發之前，中國的生豬數量占世界的一半以上，ASF對中國及周邊國家的動物健康、生豬生產和人民生活質量構成了重大威脅。

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)是一種大的包膜病毒，具有二十面體的形態，平均直徑為200 nm。病毒基因組由一個線形、共價封閉式雙鏈DNA分子組成。不同分離株的基因組長度在170～190 kb，編碼151～167個開放閱讀框。ASFV的復制主要是在細胞質，但細胞核在早期也是病毒DNA合成的場所。該病毒可影響所有品種和年齡段的野豬和家豬。ASFV強毒株可引起受感染動物的超急性或急性出血熱，死亡率高達100%。一般來說，臨床疾病可以有多種表現形式，從超急性死亡到無癥狀感染。然而，大多數ASFV分離株會引起家豬急性出血熱，致死率接近100%。規?；B殖場發病規律顯示，ASFV感染最早發病于母豬。并且懷孕母豬在感染后與豬群其他豬相比表現為最早發病且癥狀嚴重，發病后會出現流產，且在發病7 d后致死率可達100%。懷孕期母豬具有較高雌激素水平，一直保持至妊娠期結束。然而，雌激素對于ASFV的感染及其致病有何影響目前還不清楚。

長期以來，由于雌激素的影響，病毒感染后臨床癥狀呈現出性別差異現象。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是全球最普遍的人類病原體之一，長期感染約2.5億人。男性HBV相關的肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發生率要比女性高得多，比率約為(5～7):1。有研究報道，通過新型miR-18a介導的靶向機制，70%以上的女性HCC患者肝組織中雌激素受體(estrogen receptor-α polypeptide，ER-α)表達顯著降低，說明miR-18a可能阻斷雌激素的保護作用并導致女性更嚴重的HCC，表明雌二醇(β-estradiol，E2)對女性具有保護作用。在人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)感染早期，女性患者的病毒血癥明顯低于男性，并且在此期間女性患者CD4T細胞的損失是男性患者的兩倍。研究證實，這些差異與女性的E2水平有關，E2有助于CD4T的活化和減少病毒復制。另外用小鼠模型感染流感病毒后，用E2治療的小鼠表現出更短的病程和更晚的發病，總體上呈現出更低的發病率和死亡率，顯示出E2的保護作用。用孕酮(progesterone，P4)治療的小鼠病程更長，發病更早，總體發病率和死亡率都有所增加，顯示出有害的效果。目前雌激素與病毒感染相關的研究多集中在肝炎病毒、流感病毒等，在新型冠狀病毒SARS-CoV-2的研究中也有報道。

本研究用胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、空懷期豬血清(non-pregnant swine serum，NPSS)和懷孕期豬血清(pregnant swine serum，PSS)培養豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)和骨髓巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMDM)后再用ASFV感染細胞，發現PSS有顯著促進ASFV復制的作用，然后分別測定PSS和NPSS培養組細胞上清中的E2和P4含量，發現PSS培養組的E2和P4的含量均高于NPSS組，最后在E2和P4含量很低的FBS組中添加外源E2和P4，發現可以促進ASFV的復制。進一步用PSS和NPSS培養BMDM后，發現PSS培養會顯著抑制β-干擾素及下游抗病毒因子的轉錄，這可能是PSS能促進ASFV復制的初步原因。本研究結果在一定程度上為臨床上豬群感染ASF后母豬最早發病且懷孕母豬癥狀嚴重的現象提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲豬瘟病毒(ASFV CN/GS/2018)、PAMs和BMDM均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所非洲豬瘟區域實驗室保存； RPMI 1640 細胞培養液和FBS購自Thermo Scientific公司；空懷期豬血清和懷孕期豬血清從豬場采集處理得到；E2和P4 ELISA檢測試劑盒均購自Cayman公司；外源E2和P4購自SIGMA公司；鼠抗β-actin單抗、HRP標記山羊抗鼠IgG二抗和HRP標記山羊抗兔IgG二抗均購于Thermo Scientific公司；RNA 抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司； TB GreenPremix Ex Taq、PCR引物、RT Primer Mix購自TaKaRa公司；ASFV p30單抗和p72多抗由中國農業科學院蘭州獸醫研究所非洲豬瘟區域實驗室制備并保存；ECL顯色劑購于Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 血清的采集與處理 從豬場采集空懷期豬和懷孕期豬血液各5份，室溫放置過夜后4 000 r·min離心10 min，將5份血清各自混勻后在水浴鍋中56 ℃、30 min熱滅活。

1.2.2 細胞培養及病毒感染 PAMs和BMDM從液氮罐中取出后在37 ℃的水浴鍋中迅速解凍，1 500 r·min離心5 min，用分別含10% FBS、NPSS和PSS的RPMI 1640 培養液培養細胞。另一份將PAMs復蘇后分別用含10% FBS、10% FBS+E2、10% FBS+P4和10% FBS+E2+P4的培養液培養。37 ℃、5% CO培養24 h后感染ASFV(MOI=0.5)，48 h后收取樣品。一式兩份，一份采用絕對定量PCR檢測病毒拷貝數，一份采用Western blot檢測ASFV p30蛋白水平變化。

1.2.3 血清中E2與P4含量的測定 根據E2 ELISA檢測試劑盒(貨號：501890)和P4 ELISA檢測試劑盒(貨號：582601)說明書測定處理后的NPSS、PSS和FBS中E2和P4含量。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 絕對定量：反應體系25 μL，在ASFV(MOI=0.5)感染PAMs和BMDM 24 h后收集細胞樣本，用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini試劑盒提取樣本DNA，以ASFV p72基因為靶點，使用參考文獻[19]采用的實時熒光定量PCR，用相應的引物(表1)進行絕對定量PCR檢測ASFV基因組DNA拷貝數。擴增條件：95 ℃預熱30 s后，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40個循環。

相對定量：分別用添加10% NPSS和PSS的培養液培養BMDM 24 h后收集細胞并提取細胞總 RNA 后反轉錄成cDNA，使用相應引物(表1) 進行相對定量檢測。反應體系(10 μL)：TB GreenPremix Ex5 μL，上游引物(10 μmol·L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol·L) 0.5 μL，ddHO 3 μL，cDNA 1 μL。相對定量反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，共 40 個循環，同時進行熔解曲線分析，采用 2-ΔΔ方法，計算目的基因的相對表達量并進行分析。

表1 實時熒光定量PCR引物信息Table 1 Primer information of real-time fluorescence quantitative (RT-qPCR)

1.2.5 Western blot分析 棄去細胞培養液，添加含β-巰基乙醇的1×SDS Loading Buffer，使用細胞刮收集細胞樣品至EP管中，100 ℃金屬浴煮沸10 min。配制10%聚丙烯酰胺蛋白膠；取20 μL蛋白樣品上樣并加蛋白預染Marker； 80 V電壓電泳30 min后調至120 V； 100 V NC膜轉印1.5 h；然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h； 0.1% TBS’T快洗后孵育一抗(分別為ASFV p30單抗、p72多抗和鼠抗β-actin單抗)，4 ℃過夜；0.1% TBS’T快洗后孵育二抗，室溫2 h；0.1% TBS’T快洗后用高分辨圖像采集系統進行ECL顯影并保存。利用Image J軟件分析目的條帶的灰度值，根據所測灰度值計算蛋白相對表達水平(灰度值數值在目的條帶的下方用目的蛋白分析數值除以內參蛋白分析數值表示)。

1.2.6 數據分析 所有試驗至少重復3次。應用 GraphPad Prism 8軟件進行分析并作圖，運用獨立樣品檢驗進行統計學分析(*.<0.05表示數據具有統計學意義，**.<0.01表示數據具有顯著性差異，***.<0.001表示數據間具有極顯著性差異)。

2 結 果

2.1 懷孕豬血清(PSS)培養組和空懷豬血清培養組(NPSS) 相比促進ASFV復制

用分別含10% FBS、NPSS和PSS的RPMI 1640 細胞培養液將PAMs和BMDM培養24 h后感染ASFV，一式兩份，一份采用絕對定量PCR檢測ASFV病毒拷貝數，結果顯示用含PSS的培養液培養的PAMs和BMDM組病毒拷貝數顯著高于NPSS培養組(圖1A、B)。另一份收取樣品處理后采用Western blot檢測ASFV p30蛋白的表達變化，結果顯示PSS培養的PAMs和BMDM中ASFV p30蛋白表達量高于NPSS培養組(圖1C、D)。

A、B. 絕對定量PCR檢測各組病毒拷貝數；C、D. Western blot檢測各組p30蛋白表達量。FBS.胎牛血清; NPSS.空懷豬血清；PSS.懷孕豬血清; *.P<0.05,**.P<0.01，下同A, B. Absolute quantitative PCR detection of virus copies in each group；C, D. The expression of p30 protein was detected by Western blot. FBS.Fetal bovine serum; NPSS. Non-pregnant swine serum; PSS.Pregnant swine serum; *.P<0.05, **.P<0.01, the same as below圖1 懷孕豬血清組ASFV復制量高于空懷豬血清組Fig.1 The amount of ASFV replication in PSS group was higher than that in NPSS group

2.2 懷孕豬血清(PSS)中E2和P4含量高于空懷豬血清(NPSS)

分別采集5份空懷期豬血清和懷孕期豬血清，進行熱滅活后混勻，以去除個體因素引起的差異。然后用E2和P4 ELISA檢測試劑盒分別檢測這兩種血清中E2和P4的含量。結果顯示，PSS中E2(圖2A)的含量高于NPSS，且數據具有統計學意義。PSS中P4(圖2B)的含量顯著高于NPSS，且FBS中E2和P4的含量很低。

A. ELISA試劑盒檢測血清中雌二醇的含量；B. ELISA試劑盒檢測血清中孕酮的含量A. E2 content in serum detected by ELISA kit；B. P4 content in serum detected by ELISA kit圖2 懷孕豬血清中E2和P4含量均顯著高于空懷豬血清Fig.2 The contents of E2 and P4 in serum of pregnant swine were significantly higher than those of non-pregnant swine

2.3 添加外源E2和P4促進ASFV復制

將PAMs復蘇后用分別含10% FBS、10% FBS+ 20 ng E2、10% FBS+20 ng P4和10% FBS+10 ng(E2+P4)的培養液培養，48 h后收取樣品。一式兩份，一份采用絕對定量PCR檢測ASFV病毒拷貝數。結果顯示，添加E2后ASFV病毒拷貝數升高，且數據具有統計學意義。添加P4試驗組和混合添加E2及P4試驗組ASFV病毒拷貝數顯著高于對照組(圖3A)。另一份樣品收取處理后采用Western blot檢測各組ASFV p72和p30蛋白表達變化。結果顯示，添加E2、P4及混合添加這兩種激素后ASFV p72和p30蛋白表達均升高(圖3B)。

A.絕對定量PCR檢測各組病毒拷貝數；B. Western blot檢測各組p72和p30蛋白表達量A.Absolute quantitative PCR detection of virus copies in each group；B. The expression of p72 and p30 protein was detected by Western blot圖3 胎牛血清中添加E2和P4會促進ASFV復制Fig.3 The addition of E2 and P4 to FBS alone or in combination will promote ASFV replication

2.4 懷孕豬血清(PSS)培養BMDM抑制干擾素及下游抗病毒因子轉錄

為探究懷孕豬血清(PSS)培養組促進ASFV復制的原因，進一步檢測了NPSS和PSS培養組在未感染狀態下干擾素及部分下游抗病毒因子的轉錄。分別用添加10% NPSS和PSS的培養液培養BMDM 24 h后收取樣品，利用相對定量檢測IFN-β(圖4A)、ISG-15(圖4B)、ISG-56(圖4C)以及MX1(圖4D)的mRNA表達水平。結果顯示，PSS培養組IFN-β及下游抗病毒因子轉錄顯著下降。

圖4 懷孕豬血清培養BMDM會抑制β-干擾素及下游抗病毒因子轉錄Fig.4 PSS treatment of BMDM can inhibit the transcription of beta-interferon and downstream antiviral factors

3 討 論

E2和P4在不同的生殖和非生殖過程中起著重要作用，如排卵、妊娠、神經保護、學習和記憶以及免疫反應。E2和P4的功能主要通過它們的細胞內受體發揮。E2和P4主要在卵巢、腎上腺、胎盤和中樞神經系統合成。一旦釋放，P4會進入血液，在血液中它要么自由循環，要么與血漿蛋白(如白蛋白或球蛋白)結合。本研究證實了母豬在懷孕期間E2和P4的合成及釋放會增加，證明E2和P4對于維持機體正常生理功能發揮重要的作用。

本研究結果與其他文獻報道一致，E2也可以促進戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)復制。有研究表明，在妊娠晚期感染HEV的孕婦血清中E2的水平極高，并且在體外用17β-雌二醇和雌激素類似物(如DES)處理細胞后，以劑量依賴的方式促進HEV的復制。而用抗雌激素藥物處理細胞后，HEV的復制被抑制，這初步解釋了妊娠晚期婦女比未懷孕患者病毒滴度高的原因。并且由于類固醇激素具有免疫抑制作用，通過NF-κB介導淋巴細胞凋亡，使患者表現出嚴重的肝損傷和較高的死亡率。P4的免疫調節功被證明對HIV-1傳播和復制也有影響，主要成分為P4的避孕藥，如醋酸甲羥孕酮 (DMPA)，可以增加生殖道中HIV-1的復制從而使病情更重。另外，使用避孕藥還會增加對 HIV-1 的易感性，使得感染病毒HIV的風險增加2～3倍。本研究結果證實具有高含量E2和P4的PSS和商品化的E2、P4處理細胞后，都促進ASFV體外復制，證實了高含量的E2和P4可能是懷孕豬病情較重的原因之一。

生物體對病毒感染的最初反應之一是合成抗病毒細胞因子，如I型干擾素(IFN-α/β)、白細胞介素、趨化因子以及其他促炎細胞因子。干擾素的產生提供了抵御病毒感染的第一道防線。干擾素可以誘導數百個干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的轉錄，這些基因的蛋白產物能在病毒復制的多個步驟發揮抑制作用，因此幾乎所有病毒都可以通過阻斷干擾素的合成或作用來逃避干擾素的抗病毒作用。除了抗病毒作用外，干擾素還影響免疫細胞的功能，激活免疫細胞的干擾素合成與分泌有助于抑制病毒的致病作用。目前ASFV與干擾素相關的研究主要與病毒蛋白的功能與其逃避天然免疫有關，比如ASFV E120R 蛋白通過與 IRF3 相互作用阻止其激活來抑制IFN-β的產生，ASFV CD2v蛋白誘導豬外周血單核細胞IFN-β表達和凋亡等。在本研究中，用PSS處理BMDM后，IFN-β及其下游抗病毒因子ISG15、ISG56和MX1的轉錄都被顯著抑制,證明PSS處理在體外可抑制干擾素的合成從而逃避其抗病毒作用，為E2和P4促進ASFV體外復制提供了進一步的解釋。

本研究證實了PSS中高含量的E2和P4可以促進ASFV的復制，其原因可能與PSS培養細胞后抑制β-干擾素及下游抗病毒因子的產生有關，具體的機制還需要進一步的探討。此結果為臨床上解釋豬群感染ASF后母豬發病最早且懷孕母豬病情較重的現象提供了一定的科學依據。

4 結 論

懷孕期豬血清與空懷期豬血清相比會促進ASFV復制，并且與空懷期豬血清相比，懷孕期豬血清的E2和P4含量更高，在雌激素含量很低的FBS中單獨或者混合添加外源E2和P4同樣會促進ASFV的復制。與空懷期豬血清相比，懷孕期豬血清培養BMDM后可以下調干擾素及下游抗病毒細胞因子的轉錄，這可能是懷孕期豬血清促進ASFV復制的初步原因。