1株非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體識別的B細胞抗原表位的鑒定

陳孝軍，馬 俊，陳熊男，梁祎凡，高 琦，黃 釗，許潤達，鄭佳琛，鄭澤中，張桂紅,4，王 衡,3*，龔 浪*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學非洲豬瘟防控技術(shù)研究中心，廣州 510642； 2. 國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?廣州)，廣州 510642；3. 華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院廣東省臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642；4. 華南農(nóng)業(yè)大學國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種具有傳染性和高致病性的病毒性疾病，感染野豬和家豬，致死率可達100%。2018年，我國首次報道了ASF疫情，此后疫情的蔓延給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。ASF的病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒科，基因組為170～194 kb的雙鏈DNA，編碼151～167個開放閱讀框(ORFs)。ASFV編碼的許多蛋白質(zhì)可參與病毒入侵、復(fù)制、組裝、釋放及免疫逃逸等過程，但由于其基因組龐大，目前，仍有約一半的ASFV基因缺乏相關(guān)已知或可預(yù)測的功能信息。

p30蛋白是ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由病毒基因204編碼。在病毒感染宿主細胞早期p30大量表達，并且具有良好的抗原性，常作為血清學診斷抗原。此外，p30蛋白在非洲豬瘟病毒粒子進入宿主細胞中發(fā)揮重要作用，抗p30蛋白的抗體對病毒內(nèi)化有一定的抑制作用，這提示p30蛋白參與ASFV的內(nèi)化過程，但具體作用機制尚不清楚。目前，對于p30蛋白的認知有限，需要對其進行深入研究，以闡明其在ASFV感染宿主細胞過程中的作用機制。

當下沒有商業(yè)化疫苗和安全有效的藥物用于ASF的預(yù)防和治療，對于疫病防控只能依賴嚴格的生物安全措施。因此，盡早對疑似感染動物進行確診有利于及時隔離和剔除傳染源，防止疫情擴散。本研究制備了1株針對ASFV GZ201801毒株p30蛋白的單克隆抗體，利用生物信息學分析和截短表達等方式對其抗原表位區(qū)域進行初步鑒定，同時應(yīng)用噬菌體十二肽庫篩選并鑒定出與該單克隆抗體特異性結(jié)合的表位多肽，為ASFV感染早期血清學診斷試劑的研發(fā)和p30蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ASFV毒株GZ201801(GenBank：MT496893.1)由本實驗室分離，保存于華南農(nóng)業(yè)大學動物生物安全三級實驗室；豬肺泡巨噬細胞(PAMs)、羅猴胎腎細胞(MA-104)、pET-32a原核表達載體、pEGFP-C1真核表達載體由本實驗室保存。pCzn1原核表達載體、Top10菌株、Arctic-Express表達菌、骨髓瘤細胞SP2/0購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司，BALB/c小鼠購自揚州大學，p30表位多肽由上海強耀生物科技公司完成合成及純化。

1.2 酶和相關(guān)試劑

Trans1-T1化學感受態(tài)細胞購自TransGen公司，Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司，Ⅰ和Ⅰ等限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，KOD高保真酶購自TOYOBO公司，瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司，10×DNA Loading Buffer購自Vazyme公司，Star Marker D2000 Plus購自Genstar公司，1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、滅菌PBS、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、Protein Marker、T4 DNA連接酶、山羊抗鼠IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 555和山羊抗鼠IgG-HRP二抗購自Thermo Scientific公司，IRDye800CW山羊抗鼠IgG二抗購自LI-COR公司，HiFi DNA同源重組酶購自NEB公司，弗氏佐劑購自Sigma公司，0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司，Ni-IDA親和層析膠購自Novagen公司，.ER2738和噬菌體展示隨機12肽庫試劑盒購自NEB公司，HRP-羊抗豬IgG購自KPL公司，TMB顯色液購自天根生化科技有限公司，ASFV陰性血清由本實驗室制備并通過法國ID-VET ASFV iELISA抗體檢測試劑盒檢測確認，非洲豬瘟標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 p30蛋白原核表達及純化

參考非洲豬瘟病毒GZ201801毒株的204基因序列，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法進行密碼子優(yōu)化，由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進行基因合成。將該基因連入載體pCzn1的Ⅰ和Ⅰ酶切位點之間，將獲得的重組質(zhì)粒pCzn1-p30轉(zhuǎn)入Top10克隆菌株，挑取陽性克隆子進行測序鑒定。將鑒定無誤的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Arctic Express大腸桿菌中，使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達目的蛋白。優(yōu)化表達條件，將誘導(dǎo)條件調(diào)整至20 ℃，經(jīng)分析目標蛋白主要以包涵體形式表達。通過變復(fù)性的方式，重溶目標蛋白，Ni柱親和純化獲得p30蛋白。

1.4 雜交瘤細胞制備及亞細胞克隆

使用p30蛋白作為免疫原，選取5只BALB/c小鼠，將p30蛋白與弗氏佐劑混合免疫，按皮下注射50 μg·只進行免疫。2～3周加強免疫1次，3次免疫后采血檢測，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)確定其抗血清效價。具體操作方法：用PBS將純化后的p30蛋白稀釋為1 μg·mL，100 μL·孔4 ℃包被過夜；棄去包被液，洗板3次， 每孔加入200 μL封閉液，37 ℃孵育1 h；抗血清按1∶500倍比稀釋，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；取出酶標板，棄液，洗板3次，向每孔中加入100 μL山羊抗鼠IgG-HRP二抗(1∶20 000)，37 ℃孵育1 h； 每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃顯色15 min； 每孔加入100 μL 1 mol·LHCL溶液終止反應(yīng)；立即在酶標儀450 nm波長讀數(shù)，將OD值大于設(shè)定的陰性對照OD值的2.1倍的孔對應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價。

細胞融合前1周，用含10%FBS DMEM培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)SP2/0骨髓瘤細胞。挑選3次免疫后血清ELISA效價在1∶50 000以上的小鼠，在融合前3 d終免，腹腔注射抗原100 μg；無菌取其脾，收集脾細胞并用紅細胞裂解液去除紅細胞；混合骨髓瘤細胞和脾細胞，使骨髓瘤細胞與脾細胞數(shù)量比為1∶2，隨后使用電融合的方式進行細胞融合；將融合的細胞鋪到96孔板中，每孔100 μL，然后將細胞培養(yǎng)板置于5% CO培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)7～10 d進行融合篩選。融合篩選采用iELISA的方法(如上所述)，根據(jù)iELISA結(jié)果判斷陽性孔(樣品孔OD值/陰性孔OD值≥2.1則判定為陽性孔)，陽性孔細胞采用有限倍數(shù)稀釋法進行2～3次亞細胞克隆，檢測到100%陽性后，挑出單克隆孔擴大培養(yǎng)定株，獲得單克隆細胞株。

1.5 單克隆細胞株篩選

將ELISA篩選獲得的單克隆細胞株進行間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定。試驗方法：首先將PAMs鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，20% FBS 1640培養(yǎng)基，5% CO，37 ℃培養(yǎng)過夜；ASFV GZ201801株以MOI=0.1接種PAMs，感染24 h后，用4%多聚甲醛固定，用0.1% Triton-100透膜，并用5% BSA封閉；以單克隆細胞株上清作為一抗，37 ℃孵育2 h； 山羊抗鼠IgG(H+L)Alexa FluorPlus 555二抗孵育45～60 min后在熒光顯微鏡下觀察試驗結(jié)果。上述活病毒操作均在華南農(nóng)業(yè)大學動物生物安全三級實驗室中進行。

1.6 單克隆抗體特異性鑒定

單克隆抗體特異性通過IFA和免疫印跡(Western blot)試驗鑒定。IFA試驗步驟同“1.5”，Western blot試驗步驟：ASFV GZ201801毒株以MOI=0.1感染PAMs，分別在接毒后0、12、24和48 h裂解細胞收獲蛋白樣品；將樣品進行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；PVDF膜用5%脫脂乳室溫封閉1 h，一抗為制備的p30單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，二抗為IRDye800CW山羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h，利用Odyssey雙色激光成像系統(tǒng)觀察試驗結(jié)果。

1.7 p30蛋白抗原表位鑒定

利用抗原表位預(yù)測工具(IEDB)對p30蛋白進行B細胞線性表位預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié)果對204基因進行截短，并構(gòu)建重組EGFP綠色熒光標簽的真核表達質(zhì)粒，引物如表1所示。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MA-104細胞，轉(zhuǎn)染24～48 h后，分別進行IFA和Western blot試驗篩選抗原表位。隨后，將篩選到的p30蛋白的抗原表位區(qū)域進行原核表達(pET-32a載體)和Ni柱純化，獲得純化蛋白，通過Western blot和iELISA驗證其與p30單克隆抗體和非洲豬瘟陰性、陽性血清的反應(yīng)原性。

表1 引物與序列Table 1 Primers and sequences

1.8 p30單克隆抗體特異性親和噬菌體的生物淘選與測序分析

采用固相生物淘選的方法，利用噬菌體十二肽庫對靶分子p30單克隆抗體進行4輪淘選；前3輪生物淘選程序：噬菌體的淘選、淘選產(chǎn)物的滴度測定、淘選產(chǎn)物的擴增、擴增產(chǎn)物的滴度4個主要步驟，第4輪僅進行洗脫，不進行擴增。淘選的主要步驟按照《噬菌體表面展示肽庫快速篩選肽配體使用手冊》進行操作。將陽性噬菌體單克隆的PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序(引物F-M13：5′-TCACCTCGAAAGCAAGCTGA-3′；引物R-M13：5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′)，運用生物學軟件MegAlign(Version 11.0)進行比對分析，篩選獲得與p30蛋白氨基酸序列同源性高的十二肽序列，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計合成多肽。

1.9 ELISA鑒定合成多肽與p30單克隆抗體及ASFV標準血清的反應(yīng)原性

多肽以碳酸鹽緩沖液稀釋至0.2 μg每孔包被至酶標板，每孔100 μL，4 ℃孵育過夜，并設(shè)置空白對照與陰性小鼠血清對照，p30單克隆抗體(初始濃度為4 mg·mL) 以PBST進行10～10倍稀釋，小鼠陰性血清10倍稀釋，ASFV陰、陽性血清進行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋，其他操作流程同“1.4”。

1.10 ASFV不同基因型毒株間p30蛋白氨基酸同源性比較分析

通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)下載獲取22種不同基因型ASFV毒株的p30蛋白氨基酸序列，并利用MegAlign(Version 11.0)進行同源比對，分析上述鑒定的表位多肽氨基酸位點的保守性。

2 結(jié) 果

2.1 p30蛋白原核表達與純化

pCzn1-p30重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到符合204基因片段大小的條帶(圖1A)。利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，目標蛋白主要存在于沉淀中(圖1B)。

A. pCzn1-p30重組質(zhì)粒雙酶切鑒定(M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.酶切前質(zhì)粒；2.酶切后質(zhì)粒)；B.蛋白表達鑒定(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.未誘導(dǎo)；2.誘導(dǎo)后；3.誘導(dǎo)破碎后上清；4.誘導(dǎo)破碎后沉淀)A. Identification of pCZN1-p30 recombinant plasmid by double enzyme digestion (M. DNA marker; 1. Pre-digestion plasmid; 2. Post-digestion plasmid); B. Identification of protein expression (M. Protein marker; 1. Uninduced; 2. Induced; 3. Induced crushing supernatant; 4. Induced crushing precipitation)圖1 p30蛋白原核表達Fig.1 Prokaryotic expression of p30 protein

包涵體經(jīng)過變復(fù)性的方式重溶目標蛋白，通過Ni柱親和純化，將純化后的蛋白進行12% SDS-PAGE和Western blot鑒定，結(jié)果表明成功獲得純化的p30蛋白(圖2A、B)。

A. 純化蛋白的SDS-PAGE分析(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.破碎后處理樣品；2.流出液；3.洗脫液)；B. 純化蛋白的Western blot分析(M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.純化后樣品)A. SDS-PAGE analysis of purified protein (M. Protein marker; 1. Post-crushing samples; 2. Effluent; 3. Eluent); B. Analysis of purified protein by Western blot analysis (M. Protein marker; 1. Purified samples)圖2 p30蛋白原核純化Fig.2 Purification of p30 protein

2.2 單克隆抗體制備與純化

雜交瘤細胞經(jīng)過亞細胞克隆共獲得6F11G6、8H7D11、8H7F6、8H7F8和8H7G4共5株單克隆細胞株，但IFA鑒定結(jié)果(結(jié)果略)顯示僅6F11G6單克隆細胞株具有較好的試驗效果，故選擇6F11G6單克隆株進行單抗制備及后續(xù)的表位鑒定試驗。將Protein A瓊脂糖凝膠介質(zhì)裝入親和純化層析柱，將6F11G6細胞上清緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，立即在PBS中4 ℃透析過夜，即得到純化單克隆抗體。

2.3 單克隆抗體特異性鑒定

Western blot鑒定結(jié)果：與未接種病毒的PAMs相比，接種了ASFV的細胞在12、24和48 h后檢測到特異性的p30條帶，且隨接毒時間的增加，p30蛋白的表達量增加(圖3A)，表明該單克隆抗體具有特異性識別p30蛋白的功能。IFA鑒定結(jié)果：在病毒接種組有特異性紅色熒光(TXRED)，而非接毒對照組(Mock)無熒光(圖3B)，表明其特異性良好，可用于后續(xù)試驗。

A. Western blot鑒定單克隆抗體特異性，ASFV表示接毒組，分別于接毒0、12、24和48 h后收集樣品，uninfected表示未接毒細胞對照組，同樣于0、12、24和48 h收集樣品，使用β-actin作為內(nèi)參蛋白；B. IFA鑒定單克隆抗體特異性，ASFV表示接毒組，Mock表示未接毒組，藍色熒光(DAPI)代表細胞核，紅色熒光(TXRED)代表p30單抗識別的p30蛋白，Merge代表兩種熒光的重合圖像，bar=200 μmA. Western blot was used to identify the specificity of monoclonal antibodies. ASFV represented the exposed group, samples were collected at 0, 12, 24 and 48 h after post-infection, while uninfected represented the control group, samples were also collected at 0, 12, 24 and 48 h, using β-actin as internal reference protein; B. IFA identifies the specificity of monoclonal antibodies, ASFV represents the exposed group, Mock represents the unexposed group, blue fluorescence (DAPI) represents the nucleus, red fluorescence (TXRED) represents the p30 mAb recognition of p30 protein, and Merge represents the overlap image of the two fluorescence types, bar=200 μm圖3 單克隆抗體特異性鑒定Fig.3 Specific identification of the monoclonal antibody

2.4 p30蛋白抗原表位鑒定

2.4.1 p30蛋白B細胞線性抗原表位預(yù)測與截短表達 依據(jù)氨基酸親水性、表面可及性和抗原性對p30蛋白的抗原表位進行預(yù)測(圖4A)，共預(yù)測到7個可能的抗原表位(黃色區(qū)域)。根據(jù)預(yù)測結(jié)果將p30蛋白截短表達為13個短肽(p30-1～p30-13)，即分別從N端和C端依次增加預(yù)測的抗原表位數(shù)量，直至將完整的p30蛋白氨基酸序列覆蓋(圖4B)。

A. p30蛋白B細胞抗原表位預(yù)測，黃色區(qū)域為預(yù)測的抗原表位區(qū)域；B. p30蛋白截短方式示意圖，用p30-1～13表示各截短肽段A. Predicting B cell epitopes of p30 protein, and the yellow region is the predicted epitope region; B. Schematic diagram of p30 protein truncation method, using p30-1-13 to represent each truncated peptide segment圖4 p30蛋白B細胞線性抗原表位預(yù)測與截短表達Fig.4 Prediction the B cells linear epitopes and truncation of p30 protein

2.4.2 抗原表位的IFA篩選結(jié)果 將綠色熒光標簽的各截短肽段重組真核表達質(zhì)粒與陽性對照(綠色熒光標簽的完整p30蛋白質(zhì)粒)、陰性對照(綠色熒光標簽空載體質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染MA-104細胞，隨后利用制備的單克隆抗體進行IFA試驗。各組均出現(xiàn)綠色熒光(FITC)，表明重組蛋白與短肽都能成功表達；p30、p30-1、p30-3、p30-8和p30-13出現(xiàn)紅色熒光(TXRED)，并且與綠色熒光共定位，其他短肽以及陰性對照組均未出現(xiàn)紅色熒光(圖5)。因此短肽p30-1、p30-3、p30-8和p30-13能被p30單克隆抗體識別。

圖5 抗原表位篩選IFA結(jié)果(bar=200 μm)Fig.5 The result of antigenic epitopes screening by IFA (bar=200 μm)

2.4.3 抗原表位的Western blot篩選結(jié)果 將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MA-104細胞，然后利用p30單克隆抗體進行Western blot試驗。Western blot結(jié)果與IFA結(jié)果一致，即p30、p30-1、p30-3、p30-8和p30-13出現(xiàn)符合預(yù)期大小的蛋白條帶，表明短肽p30-1、p30-3、p30-8和p30-13能與p30單克隆抗體結(jié)合(圖6)，其共同的氨基酸序列為M-K，推測該段序列為本研究制備的p30蛋白單克隆抗體識別的抗原表位區(qū)域。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；p30.轉(zhuǎn)染完整EGFP-p30表達質(zhì)粒；1～13. 轉(zhuǎn)染截短突變體EGFP-p30-1～13表達質(zhì)粒；EV. 轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1質(zhì)粒；MOCK. 未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MA-104細胞對照組M. Protein marker; p30. Complete EGFP-p30 expression plasmid was transfected; 1-13. Transfection of truncated mutant EGFP-p30-1-13 expression plasmid; EV. Transfected empty vector pEGFP-C1 plasmid; MOCK. MA-104 cell control without plasmid transfection圖6 抗原表位篩選Western blot結(jié)果Fig.6 The result of antigenic epitopes screening by Western blot

2.4.4 抗原表位(M-K)驗證 進一步應(yīng)用p30單克隆抗體和ASFV標準陽性血清，通過Western blot(圖7A)和iELISA(圖7B)對p30(M-K)特異性進行驗證，結(jié)果表明84-142位氨基酸序列組成的p30截短蛋白能被p30單克隆抗體和ASFV標準陽性血清特異性識別，提示該段序列是本研究制備的mAb所識別的p30蛋白抗原表位區(qū)域。

2.5 p30單克隆抗體特異性親和噬菌體的測序分析

將與p30單克隆抗體特異性親和的噬菌體PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結(jié)果與ASFV-HLJ毒株p30蛋白氨基酸序列進行比對，結(jié)果提示,該單克隆抗體對應(yīng)表位分布于TSSFETLFE之間(圖8)。在此基礎(chǔ)上，前后延長合成兩段多肽(Peptide-TN和Peptide-CT)進行活性分析，多肽序列見表2。

表2 合成肽信息Table 2 Information of the synthetic peptide

圖8 p30單克隆抗體特異性親和噬菌體測序分析Fig.8 Sequencing analysis of p30 monoclonal antibody specific affinity phage

2.6 合成多肽與p30單克隆抗體及ASFV標準血清的反應(yīng)原性

分別將合成多肽作為包被抗原與p30單克隆抗體和ASFV標準血清進行結(jié)合力驗證，ELISA結(jié)果顯示：兩條多肽在0.2～5.0 μg·孔的包被區(qū)間與單克隆抗體具有相似的結(jié)合力，隨著單克隆抗體稀釋度增加，結(jié)合能力下降，而陰性小鼠血清與多肽幾乎不反應(yīng)(圖9)；且與ASFV標準陽性血清具有特異性結(jié)合反應(yīng)(表3)。

表3 合成多肽與ASFV 標準血清的結(jié)合能力Table 3 Binding activities of the synthetic peptides to ASFV standard serum

圖9 多肽與p30單克隆抗體結(jié)合能力Fig.9 Binding activities of the synthetic peptides to p30 monoclonal antibody

2.7 ASFV不同基因型毒株間p30蛋白氨基酸同源性比較分析

ASFV p30蛋白氨基酸序列比對結(jié)果顯示：TSSFETLFE多肽序列在ASFV 22種基因型毒株間保守(表4)。

表4 ASFV不同基因型毒株間p30蛋白氨基酸同源性比較分析Table 4 Comparative analysis of amino acid homology of p30 protein among ASFV genotypes

(續(xù)表4 Continued)

3 討 論

非洲豬瘟是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，僅根據(jù)感染豬的臨床癥狀很難將ASF與豬瘟(CSF)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)和豬丹毒等具有相似臨床癥狀的疫病進行區(qū)分，因此實驗室診斷對于ASF的鑒定至關(guān)重要。目前，常用的實驗室診斷方法主要包括紅細胞吸附試驗(HAD)、聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、熒光定量PCR(qPCR)、iELISA等，其中，qPCR因其靈敏度和準確性較高而被廣泛使用，但其缺點是對儀器設(shè)備的要求較高。血清學診斷是常用的診斷檢測方法，因為它操作簡單，成本相對較低，對專用設(shè)備的要求也較低，缺點是靈敏度的特異性不如qPCR。但當豬被減毒或低毒力毒株感染時，血清學診斷可能是檢測被感染動物的最佳方法。有研究報道2020年我國家豬中已出現(xiàn)自然產(chǎn)生的低毒力非洲豬瘟病毒，所以研發(fā)出特異性強靈敏度高的血清學診斷試劑具有十分重要的意義。OIE推薦的非洲豬瘟的血清學檢測方法是ELISA，目前商業(yè)化的ELISA試劑盒主要基于蛋白p30、p54、p72和pp62等，其中p30蛋白被認為最適合用于免疫吸附試驗。因此，評估p30蛋白的抗原表位特征，尤其是保守表位特征，將有助于發(fā)展和改進ASF診斷和監(jiān)測的血清學檢測方法。

在p30蛋白抗原表位研究方面，Murgia等針對BA71V毒株的p30蛋白表位鑒定結(jié)果表明免疫優(yōu)勢區(qū)位于111-130位氨基酸覆蓋的寡肽。Petrovan等的研究初步鑒定了p30的61-93位氨基酸之間的表位，該區(qū)域也被ASFV感染豬的血清識別，提示該區(qū)域是具有重要免疫功能的表位。同時也鑒定了p30蛋白C端部分中的一個大多肽片段(120-204 aa)與高度柔性和潛在無序傾向區(qū)域(91-143 aa)部分重疊可能是p30蛋白的抗原表位區(qū)域，該結(jié)果與本研究的試驗結(jié)果相似。Wu等開發(fā)了1組21株p30蛋白的單克隆抗體，通過iELISA進行了主要表位定位，確定了4個獨特的抗原表位區(qū)域，分別為61-90 aa、96-115 aa、116-125 aa和146-160 aa，其中后兩個抗原區(qū)域在不同ASFV毒株中高度保守。本研究通過IFA、Western blot和iELISA初步確定了本實驗室制備的1株針對ASFV GZ201801毒株p30蛋白的mAb所識別的抗原表位區(qū)域為M-K，并通過噬菌體展示技術(shù)對抗原表位進行定位。

噬菌體展示技術(shù)由Smith等建立于1985年，迄今以其操作簡便與高效篩選的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，如分子成像、疫苗研發(fā)、抗體制備及納米技術(shù)等領(lǐng)域。同時，利用噬菌體展示文庫，與靶分子特異性結(jié)合的多肽配體被高效篩選與鑒定，為進一步發(fā)展疾病診斷與治療策略提供思路。本研究應(yīng)用噬菌體十二肽展示文庫成功篩獲得高頻克隆展示序列，這些序列集中分布于ASFV GZ201801毒株p30蛋白的TSSFETLFE區(qū)域。在此分析基礎(chǔ)上設(shè)計合成十四肽，iELISA結(jié)果表明兩條合成多肽TNECTSSFETLFEQ和CTSSFETLFEQEPS均與制備的p30單克隆抗體具有高度親和活性。綜合氨基酸比對分析結(jié)果提示TSSFETLFE為針對p30蛋白的一處保守B細胞線性表位核心區(qū)域，該結(jié)果在本研究使用截短蛋白篩選基礎(chǔ)上，進一步縮小了表位分布范圍。

A. 抗原表位Western blot驗證，分別使用p30蛋白mAb和ASFV陽性血清進行驗證[M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；E1. p30(84M-K142)蛋白洗脫液1；E2. p30(84M-K142)蛋白洗脫液2；EV. pET-32a空載體原核表達對照組]；B. 抗原表位iELISA驗證(PS. ASFV標準陽性血清；NS. ASFV陰性血清)A. Verification of the epitopes by Western blot, the p30 protein mAb and ASFV positive serum were used for validation (M. Protein marker; E1. p30 (84M-K142) protein eluent 1；E2. p30 (84M-K142) protein eluent 2; EV. The control group of pET-32a empty vector prokaryotic expression); B. Verification of the epitopes by iELISA (PS. positive serum of ASFV; NS. negative serum of ASFV)圖7 抗原表位驗證Fig.7 Verification of the epitopes

4 結(jié) 論

本研究制備了1株非洲豬瘟病毒GZ201801毒株p30蛋白的單克隆抗體，同時利用蛋白截短表達的方式鑒定了M-K是其識別的抗原表位區(qū)域，進一步通過噬菌體展示技術(shù)確定了一個保守表位(TSSFETLFE)，豐富了p30蛋白的抗原表位信息，為進一步研究p30蛋白抗原核心基序及發(fā)展ASFV血清學診斷材料奠定基礎(chǔ)。