牦牛RBM3的基因克隆及其在不同繁殖時期卵巢、輸卵管、子宮中的表達定位

張 暉，潘陽陽，王靖雷，張 瑞，黃嘉馨，余四九，崔 燕

(甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

RNA結合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)作為一種已知的冷休克蛋白，在正常條件下存在于多種組織和細胞中，當動物機體與細胞在受到低溫、低氧和局部缺血應激時可以刺激它的表達，并通過促進其他相關蛋白的合成維護應激條件下機體與細胞的正常生理功能。從人類組織分離得到的RBM3分子量為17 ku，最長的開放閱讀框編碼157個氨基酸。從結構上來看，RBM3包含兩個結構域：一個是氨基酸末端的RNA識別基序(RRM)，它包含兩個高度保守序列：核糖核蛋白1(ribonucleoprotein1, RNP1)和核糖核蛋白2(ribonucleoprotein2, RNP2)；另一個是富含甘氨酸、精氨酸和酪氨酸的羧基末端序列。RBM3作為一種富含甘氨酸的蛋白質，通過加速核糖體組裝、穩定mRNA和減少microRNA的表達來促進蛋白質的翻譯。Wellmann等在人類成纖維細胞內的研究發現，RBM3的mRNA和蛋白質在缺氧條件下的表達量有所增加。李云龍等也提出，在哺乳動物體內RBM3蛋白的表達量會隨著溫度的降低而不斷增加。

研究證實，RBM3可以在包括人體細胞k562、HepG2、T24在內的多種細胞系中表達。而有關小鼠()的研究表明，RBM3可通過減少microRNA表達來誘導小鼠神經母細胞瘤細胞(N2a)中的整體翻譯水平。Yan等研究發現，RBM3促進了在缺氧條件下神經干細胞(neural stem cell, NSC)的增殖。另外，RBM3在黑熊()這類冬眠動物的肌肉、肝和心中都有表達，并且在松鼠()冬眠晚期的心、肝、腦組織中高表達。2020年，潘陽陽等通過試驗驗證了RBM3參與牦牛()這一高原特有哺乳動物卵丘細胞低溫應激調控。因此，研究在高寒低氧環境中哺乳動物經受低溫時RBM3的表達變化，有利于RBM3參與調控動物機體缺氧、低溫的機制研究。而牦牛作為在我國青藏高原地區的特有動物，由于長期生活在高寒低氧的高原地區，生態學特征獨特。受到溫度、含氧量等因素以及生存環境的綜合影響，牦牛的繁殖能力低下，在自然條件下一年一胎或兩年一胎限制了高原畜牧業的發展。所以，研究低溫相關蛋白RBM3對牦牛生理調控機制具有重要作用。

本研究采集不同繁殖時期(卵泡期、黃體期和妊娠期)雌性牦牛的卵巢、輸卵管、子宮，進行牦牛3基因克隆和相關生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測3 mRNA的表達量，利用蛋白質免疫印跡(Western blot, WB)檢測RBM3蛋白的表達量，利用免疫組織化學法(immunohistochemistry, IHC)檢測RBM3蛋白的表達定位，為探討RBM3在高原環境下對牦牛生殖的調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年10月在青海省馬佳肴屠宰場采集樣品。卵泡期、黃體期和妊娠期的4～6歲健康雌性牦牛各3頭。采集卵巢上見成熟卵泡(卵泡期)和新鮮黃體(黃體期)同側以及妊娠3個月(妊娠期)妊娠側的卵巢、子宮和輸卵管。將所采樣品修剪后，用生理鹽水沖洗干凈，一部分儲存于-80 ℃，另一部分室溫下保存于4%多聚甲醛溶液中。

1.2 主要儀器與試劑

普通PCR儀購于德國Eppendorf公司，qRT-PCR儀購于瑞士Roche公司，顯微拍照儀購于日本Olympus公司，多功能成像儀購于美國GE公司；BeyoEcL PLus液購于上海碧云天公司，Trizol試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，TB GreenPremix Ex TaqⅡ、JM109感受態細胞購于大連TaKaRa公司；熒光定量PCR所用試劑、反轉錄試劑盒均購于美國Promega公司；DNA純化回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；基因克隆試驗配制培養基所用試劑購于北京Solarbio公司；IHC試劑盒、WB所用抗體Rabbit Anti-beta-Actin antibody、Rabbit Anti-RBM3 antibody、Goat Anti-Rabbit IgG HH&L/RP以及DAB顯色液購于北京Bioss公司。其他試劑均為國產分析純。

1.3 牦牛RBM3基因克隆

1.3.1 引物設計 參照GenBank公布的牛()3基因序列(XM_024987852.1)進行引物設計，肌動蛋白(-)基因為內參，由上海生工進行引物合成，引物信息見表1。

表1 目的基因和內參基因引物序列Table 1 Primer sequences amplifying target and house-keeping genes

1.3.2 總RNA提取 試劑盒法提取樣品總RNA，測定所提取的RNA濃度和OD/OD值后，將達到濃度和OD/OD值參照標準的RNA進行反轉錄，合成的cDNA保存在-20 ℃備用。

1.3.3 牦牛3基因克隆 以樣品cDNA為模板擴增3基因。總反應體系為20 μL：TaqPCR Master Mix 10 μL, ddHO 8 μL, cDNA模板1 μL, 10 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL；反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃保存5 min，循環35次進行PCR反應。將PCR產物進行凝膠電泳，回收產物于-20 ℃保存。用TaKaRa試劑盒構建重組質粒，將回收產物與pMD19-T Vector連接，然后把連接產物(10 μL)轉化至 JM109感受態細胞(100 μL)。 把連接轉化后的產物加入890 μL SOC液體培養基中，搖床培養(37 ℃, 200 r·min)15 h， 涂布于LB瓊脂平板培養基(含有Amp, X-gal, IPTG)上進行培養(37 ℃, 14 h)，挑取平板培養基上的單個白色菌落并將其置于含有Amp的LB液體培養基，37 ℃振蕩培養16 h。最后，將得到的菌液進行測序，根據測序結果對3基因進行后續分析。

1.3.4 生物信息學分析 對牦牛3基因的測序結果進行分析，具體分析網站信息見表2。

表2 生物信息學分析網站Table 2 Bioinformatics analysis websites

1.4 qRT-PCR檢測RBM3基因的表達

qRT-PCR檢測牦牛不同繁殖階段卵巢、輸卵管、子宮中3基因的表達水平。在20 μL (TB GreenPremix Ex TaqⅡ 10 μL，Free Water 6.4 μL, cDNA模板2 μL，10 μmol·L的上、下游引物各0.8 μL)的體系下以95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、 60 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，循環40次的條件進行PCR反應，重復4次。按照2計算3基因在每組樣品中的相對表達量。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測RBM3蛋白的表達

1.5.1 蛋白樣品的制備 將試驗樣品低溫研磨后取110 mg，按照蛋白裂解液(Radio Immunoprecipitation assa, RIPA)與蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)100∶1的比例配制蛋白裂解液并取110 μL加入研磨好的試驗樣品。然后4 ℃振蕩裂解2 h后，4 ℃離心(12 000×g)5 min， 吸取上清在-80 ℃保存備用。

1.5.2 蛋白質免疫印跡 經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，電泳后電轉膜(濕轉)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，5%脫脂牛奶室溫振蕩封閉2 h。 將目的條帶和內參條帶分別加一抗兔抗RBM3抗體(1∶1 000 PBST稀釋)和兔抗beta-Actin抗體(1∶2 000 PBST稀釋)4 ℃孵育11 h后用PBST(PBS∶Tween20=2 000∶1) 溶液洗10次(6 min·次)； 山羊抗兔IgG H&L/HRP(1∶3 000 PBST稀釋)二抗室溫搖床孵育1 h后PBST溶液洗6次， 每次15 min；在膜上滴加電化學發光液避光孵育2 min后WB掃描成像儀掃描蛋白條帶，重復3次， 最后分析RBM3蛋白相對表達量。

1.6 IHC定位RBM3蛋白表達

固定組織，依次脫水、包埋、切片(厚度4 μm)、脫蠟、熱修復。再進行如下步驟：滴加3% HO并在濕盒孵育10 min(37 ℃)；滴加封閉液在濕盒孵育15 min(37 ℃)；滴加一抗兔抗RBM3抗體(1∶400 PBS稀釋)在濕盒孵育過夜(4 ℃)，同時設置只加PBS(0.02 mol·L)的對照；滴加二抗(B液)在濕盒孵育15 min(37 ℃)；滴加C液在濕盒孵育15 min (37 ℃)；顯色。最后蘇木精復染、脫水、透明、樹脂封片并拍照。

1.7 數據分析

依據qRT-PCR結果計算3的相對表達量，利用Image J軟件灰度值分析RBM3蛋白的表達量(目的灰度數值/內參灰度數值)，運用SPSS軟件對基因和蛋白相對表達量的差異顯著性進行單因素方差分析，用軟件GraphPad Prism 8繪制數據圖。

2 結 果

2.1 牦牛RBM3基因的擴增與克隆

PCR結果顯示(圖1)，9組樣品在618 bp處出現預期的整齊條帶。與NCBI數據庫與參考序列將3基因克隆測序結果進行比對后，相似性100%。已將牦牛3序列提交至GenBank(登錄號：MF142258.1)。本部分試驗檢測出了牦牛3序列，此結果將繼續用于后續生物信息學分析等試驗內容。

M.DNA相對分子質量標準；1～3.卵泡期、黃體期、妊娠期卵巢；4～6.卵泡期、黃體期、妊娠期輸卵管；7～9.卵泡期、黃體期、妊娠期子宮M.DL2000 DNA Marker; 1-3. The ovary at follicular, luteal, gestation phases; 4-6. The fallopian tube at follicular, luteal, gestation phases; 7-9. The uterus at follicular, luteal, gestation phases圖1 RBM3 PCR擴增電泳結果Fig.1 The electrophoresis results of RBM3 PCR amplification

2.2 生物信息學分析

2.2.1 牦牛3基因開放閱讀框分析 開放閱讀框分析發現，牦牛3的開放閱讀框(ORF)全長為483 bp，編碼了160個氨基酸。選取具有代表性的動物進行相似性比對，結果顯示牦牛3基因與野牦牛()相似性最高(99.79%)，相似性較高的還有數值為99.59%的瘤牛()與99.17%的普通牛()；與其他動物的相似性從高到低依次為：山羊()98.96%、彎角劍羚()98.76%、水牛()97.17%、綿羊()96.16%、單峰駝()91.36%、羊駝()91.36%、野駱駝()91.36%、西伯利亞虎()91.30%。經MEGA 7.0軟件比對(圖2)后，構建系統進化樹結果顯示(圖3)，牦牛3基因與野牦牛親緣關系最近。將牦牛與包括基因相似性最高的野牦牛在內的所有在列動物相比，3基因編碼區序列在第98位核苷酸(圖2黑色箭頭處)有差異，且對應編碼的第33位氨基酸在牦牛上是苯丙氨酸(Phe)，而在其他動物上編碼的結果是絲氨酸(Ser)。另外，第51位核苷酸的比對中，牦牛、野牦牛和除西伯利亞虎之外的所有在列動物都有差異，但其編碼的氨基酸均為蘇氨酸(Thr)，沒有改變。

黑色箭頭標記是第51、98位核苷酸Black arrows point to nucleotide No.51 and No.98圖2 不同物種間RBM3基因序列比對Fig.2 Sequence alignment of RBM3 orthologues among different species

圖3 RBM3基因的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RBM3 gene

2.2.2 牦牛3基因編碼蛋白的理化性質分析和結構預測 RBM3蛋白預測分子量大小17.5 ku。分析后得知，3基因編碼了含有18種氨基酸在內的160個氨基酸，甘氨酸(Gly)的含量最高，為21.2%；含量最低的是組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸 (Lys)、和甲硫氨酸(Met)，含量為1.9%；半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)的含量為0。3基因編碼的氨基酸中含有帶負電的氨基酸(Asp+Glu)20個(12.5%)，帶正電氨基酸(Arg+Lys)22個(13.8%)。該編碼區共2 361個蛋白原子，理論等電點(PI)8.83，不穩定指數為24.58，是穩定蛋白。二級結構預測結果顯示(圖4A)，構成RBM3蛋白α-螺旋的氨基酸個數為21個，占氨基酸總數的13.1%；構成RBM3蛋白延伸鏈的氨基酸有30個， 占18.8%；109個氨基酸無規則卷曲，占68.1%。RBM3蛋白的三級結構預測結果如圖4B所示。

A. 牦牛RBM3蛋白的二級結構預測；B.牦牛RBM3蛋白三級結構預測的兩個不同角度A. The secondary structure prediction of RBM3 protein in yak; B. Prediction of tertiary structure of yak RBM3 protein from two different angles圖4 牦牛RBM3蛋白結構預測Fig.4 The structure prediction of RBM3 protein in yak

2.2.3 牦牛RBM3蛋白跨膜結構域和磷酸化位點分析 蛋白跨膜結構域預測結果(圖5A)表明RBM3蛋白不是跨膜蛋白。蛋白磷酸化位點分析結果(圖5B)表明，在組成RBM3蛋白的氨基酸中有10個絲氨酸(Ser)、2個蘇氨酸(Thr)、5個酪氨酸(Tyr)的磷酸化位點具備成為蛋白質激酶磷酸化位點的條件。

A.牦牛RBM3蛋白跨膜區域分析；B.牦牛RBM3蛋白磷酸化位點分析A.The protein transmembrane regional analysis of RBM3 protein in yak; B. The protein phosphorylation site analysis of RBM3 protein in yak圖5 牦牛RBM3蛋白跨膜區域和磷酸化位點分析Fig.5 The protein transmembrane region and phosphorylation sites analysis of RBM3 protein in yak

2.3 RBM3基因表達檢測

qRT-PCR結果(圖6)顯示，3基因在不同繁殖階段的牦牛卵巢、輸卵管、子宮中都有表達。在卵巢中，3基因在卵泡期的表達量顯著低于黃體期和妊娠期(<0.05)；在輸卵管中，3基因在卵泡期的表達量顯著高于黃體期和妊娠期(<0.05)；在子宮中，3基因在各時期表達量存在明顯差異，卵泡期最低，黃體期和妊娠期較高(<0.05)。3基因在牦牛發情周期不同階段的主要生殖器官上呈差異性表達。

β-actin為內參基因；n=4。不同字母代表差異顯著(P<0.05)β-actin is the reference gene; n=4. Different letters indicate significanct difference (P<0.05)圖6 RBM3 mRNA在牦牛不同組織中的相對表達量Fig.6 Relative expression of RBM3 mRNA in different tissues in yak

2.4 RBM3蛋白表達檢測

WB結果(圖7A)表明，RBM3蛋白在卵泡期、黃體期、妊娠期的牦牛卵巢、輸卵管、子宮中都有表達且存在差異。通過定量分析(圖7B)在卵巢上，RBM3蛋白在黃體期的表達量最高，妊娠期次之，卵泡期最低，3個樣本之間差異顯著(<0.05)；在輸卵管上，RBM3蛋白在黃體期和妊娠期表達較高且兩者之間差異不顯著(>0.05)，卵泡期的表達量最低，和同組的其他兩個樣本之間的差異均顯著(<0.05)； 在子宮中，RBM3蛋白在妊娠期的表達量最低，卵泡期的表達量最高，黃體期的表達量介于卵泡期和妊娠期之間，3個樣本間差異顯著(<0.05)。

A.RBM3和β-actin蛋白在牦牛不同組織中的檢測結果；B.RBM3蛋白在牦牛不同組織中的相對表達量。1～3. 卵泡期、黃體期、妊娠期卵巢；4～6. 卵泡期、黃體期、妊娠期輸卵管；7～9. 卵泡期、黃體期、妊娠期子宮A. Detection results of RBM3 and β-actin in different tissues of yak; B. Relative expression of RBM3 in different tissues of yak. 1-3. The ovary at follicular, luteal, gestation phases; 4-6. The fallopian tube at follicular, luteal, gestation phases; 7-9. The uterus at follicular， luteal, gestation phases圖7 RBM3蛋白在牦牛不同組織中的表達情況Fig.7 Expression of RBM3 protein in different tissues of yak

2.5 牦牛RBM3蛋白在主要生殖器官的定位檢測結果

通過免疫組織化學方法檢測(圖8)發現，RBM3蛋白在牦牛發情不同階段的卵巢、輸卵管、子宮切片中都有陽性表達，且均為細胞質表達。在卵巢上(圖8A、8B、8C)RBM3的主要表達分布在卵泡顆粒層(follicle granular layer, SG)、卵泡膜(theca follicle, TF)、黃體細胞(luteal cells, LC)；RBM3在輸卵管上(圖8D、8E、8F)的主要表達位置為黏膜上皮(epithelium mucosae, EM)；RBM3在子宮上(圖8G、8H、8I)的主要表達位置為子宮內膜(endometrium, EN)和子宮腺(uterine glands, UG)。

A-I. 陰性表達；A1、A2、B1、B2、C1、C2. 卵巢；D1、D2、E1、E2、F1、F2. 輸卵管；G1、G2、H1、H2、I1、I2. 子宮。SG. 卵泡顆粒層；TF. 卵泡膜；LC. 黃體細胞；EM. 黏膜上皮；EN. 子宮內膜；UG. 子宮腺。卵泡期. A組、D組、G組；黃體期. B組、E組、H組；妊娠期. C組、F組、I組A-I. Negative expression; A1, A2, B1, B2, C1, C2. Ovary; D1, D2, E1, E2, F1, F2. Fallopian tube; G1, G2, H1, H2, I1, I2. Uterus. SG. Follicle granular layer; TF. Theca follicle; LC. Luteal cells; EM. Epithelium mucosae; EN. Endometrium; UG. Uterine glands. Follicular phase. Group A, D and G; Luteal phase. Group B, E and H; Gestation phase. Group C, F and I圖8 RBM3蛋白在在牦牛不同組織中的分布Fig.8 Distribution of RBM3 proteins in different tissues of yak

3 討 論

RBM3作為動物體內的一種應激調節基因，其與冷應激的關系在1997被發現，但越來越多的研究表明它在細胞中有著較為復雜的功能和作用。在正常生理條件下，它可以保護細胞免受內在刺激造成的損傷，而在機體遭受低溫、低氧等應激刺激時，則會誘導其表達并通過多種途徑調節應激反應。有研究表明，當動物機體內的RBM3表達量增加時，機體對抗外界有害刺激的能力就會有所增加，從而在惡劣環境下為細胞提供一個較為良好的內部環境。近些年來，RBM3被認為是潛在的原癌基因進行了大量與之相關的研究，但對其參與生殖調控的研究卻不多。本研究成功克隆了牦牛3基因，分析后發現其N端含有特殊蛋白結構域RNP1和RNP2，與前人研究結果一致，存在RGG結構域。有學者發現，RBM3與部分冷休克蛋白(cold shock proteins, CSPs)具有中度核苷酸序列和功能相似性，在進化過程中保守，本研究結果顯示牦牛3與野牦牛、瘤牛、普通牛親緣性較近，其在物種間高度保守，與前人研究RBM3是高度保守的RNA結合蛋白的結論一致。3的核苷酸序列與其他物種相比存在差異：第51位核苷酸和與除西伯利亞虎之外的所有比對動物都有差異，但編碼的氨基酸沒有發生改變(蘇氨酸，Thr)；第98位核苷酸也存在差異，所編碼氨基酸由參與機體糖代謝、脂肪代謝的苯丙氨酸(Phe)變為在脂肪、脂肪酸新陳代謝和肌肉的生長中發揮重要作用的絲氨酸(Ser)，可能為牦牛3基因特點，需進一步研究。

本試驗分別對RBM3的mRNA和蛋白在牦牛子宮、卵巢和輸卵管中相對表達量進行了檢測，發現卵泡期、黃體期、妊娠期3個不同繁殖時期的RBM3在mRNA和蛋白層面的表達趨勢存在差異。這可能是由于3基因在本試驗涉及到的雌性牦牛不同時期、不同部位存在翻譯和轉錄層面的調控，如磷酸化和甲基化，都對3生物學功能有重要的調節作用，由此出現時空表達差異。這一差異的存在為后續進一步深入開展3生理功能和翻譯后修飾的相關研究提供了思路，有待進一步研究。

在雌性哺乳動物生殖過程中，卵巢作為維持雌性特征最重要的腺體器官，在生殖過程以及相關調控中發揮著重要作用。本研究發現，RBM3在牦牛卵巢中的主要表達位置為卵泡顆粒層、卵泡膜以及黃體細胞，并在黃體期和妊娠期呈現高表達。黃體作為在卵巢內形成的內分泌腺體樣結構，通過產生孕酮、雌激素以及其他激素來調控個體發情周期和妊娠。卵泡顆粒細胞作為參與調控原始卵泡的啟動、發育、卵泡選擇、成熟以及排卵過程的重要角色，與卵泡膜細胞之間也存在著一定相互作用，而且這種相互作用在卵泡發育和卵母細胞的成熟過程中有重要意義。在卵巢中，卵泡破裂排卵后退化形成黃體，前人研究表明黃體細胞可以通過自分泌與旁分泌方式在黃體功能調節中起到局部調節作用，其中黃體期黃體通過分泌孕酮來抑制卵巢排卵、妊娠期黃體持續分泌孕酮維持妊娠。因此，RBM3在牦牛黃體期、妊娠期卵巢的高表達可能與黃體功能調節和妊娠維持有關系。

輸卵管作為動物體內精子獲能、受精及胚胎早期發育的場所。在本試驗中，RBM3在牦牛輸卵管中的主要表達位置為黏膜上皮，黏膜上皮可以通過分泌物影響精卵結合和合子的形成，對早期胚胎的發育和轉運具有重要作用。從已知的研究結果來看，輸卵管在卵泡期受卵巢分泌雌激素的影響，黏膜上皮細胞快速生長、發育和增殖，分泌輸卵管液為受精和早期胚胎發育提供穩定的環境。卵巢排卵后，卵泡液和卵子一起進入輸卵管，在黃體期輸卵管中卵泡液和輸卵管液的融合為精子到達受精部位提供了保障，妊娠期輸卵管變粗、伸長、彎曲變多并促進早期胚胎的發育。本試驗發現，RBM3在黃體期和妊娠期輸卵管的表達量顯著高于卵泡期，結合免疫組化結果推測RBM3在牦牛輸卵管中參與了生殖配子在輸卵管內的運行以及早期胚胎發育過程，這可能和RBM3調控細胞生長、分化的生理學功能有關。

子宮作為胎生動物胚胎附植以及生長發育的場所，其生長發育和活動由復雜的內分泌系統所控制，并且具有重要的生理功能。在本研究中，RBM3在子宮的主要表達位置為子宮內膜和子宮腺，而且在子宮卵泡期的表達顯著高于黃體期和妊娠期。子宮內膜作為子宮的壁層具有促進發情周期循環、孕育胎兒、內分泌等作用；而子宮腺則可以分泌多種妊娠識別、胚胎著床、促進胎兒發育的多種物質。在卵泡期階段，子宮內膜以增殖、生長以及細胞內代謝為主，子宮腺的分泌水平也在這一時期較高。子宮內膜可以通過腺體產生的大量因子，而子宮腺通過感受激素刺激可以分泌相關因子，還可以通過分泌相關生長因子控制自身的正常生理周期。這一結果可能與子宮肌的運動對生殖機能的影響、提供胎兒生長發育的環境、構成胎兒發育的環境等生理功能存在聯系。因此推測，RBM3參與了雌性牦牛的子宮生理周期的調控以及妊娠識別等過程。

4 結 論

本研究成功克隆了牦牛3基因，登錄號為：MF142258.1，3基因ORF全長為483 bp，編碼18種、160個氨基酸。預測RBM3蛋白存在17個磷酸化位點，是穩定的非跨膜蛋白。RBM3蛋白及基因在雌性牦牛發情周期不同階段的卵巢、子宮、輸卵管中均有表達，但存在差異。本研究結果提示，RBM3參與了牦牛發情周期以及妊娠過程的調控。