基于TMT技術對低氧與常氧條件下牦牛PASMCs的蛋白組學分析

張 蘭，姚一凡,2,3，覃安琪，李 睿，張伊陽，陳樹吾,2,3，許 瑾，喬自林,2,3，楊 琨,2,3*

(1.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030； 2.甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，蘭州 730030；3.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，蘭州 730030)

高原地區(qū)具有強紫外線、牧草生長季短、低溫、低氧等特殊的環(huán)境特點，牦牛()是青藏高原上特有的物種，其具有肺功能強大、覓食能力強和代謝能力高等一系列適應高原地區(qū)的特點。它不僅能夠很好的生存，而且還能將其穩(wěn)定的適應性遺傳到下一代，是研究低氧適應性的最理想物種，其潛在的分子機制仍然很大程度上未知。在正常生理條件下，低氧會導致肺循環(huán)早期肺血管管徑變化和后期肺血管重構，以及可能出現(xiàn)低氧性肺動脈高壓等。其中肺血管平滑肌細胞的異常增殖是肺血管重構的主要原因之一。因此，本研究選用成年牦牛肺動脈平滑肌細胞為牦牛適應性調節(jié)蛋白奠定基礎，以及為提高人或動物低氧損傷帶來疾病的藥物的研發(fā)提供一定基礎數(shù)據(jù)。

同位素標記相對和絕對定量串聯(lián)質譜標簽(tandem mass tag, TMT)技術是一種新型多肽體外標記技術。現(xiàn)在TMT技術已經是探索動物生長發(fā)育、動物疾病調控機制以及了解細胞機體活動規(guī)律的應用技術手段。具有高通量、重復性高以及定量準確等特性。研究表明，低氧條件下(1% O)的蛋白質組學分析揭示了細胞代謝的變化，包括能量代謝、線粒體活性和脂質代謝相關的蛋白質。更有研究者驗證，在低氧培養(yǎng)條件下(1% O濃度)培養(yǎng)細胞48 h后，觀察到細胞的增殖抑制作用，但是隨著培養(yǎng)時間的增加(72 h)會引起相反的效果，細胞增殖率增加。因此，本研究旨在探索對低氧(1% O)和常氧(20% O)條件下培養(yǎng)的PASMCs采用TMT結合液相色譜-質譜(LC-MS/MS)技術檢測差異表達蛋白(DEPs)，從而進行DEPs的作用分析，以便對低氧與常氧下PASMCs的DEPs有廣泛而全面的了解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從青海省西寧某屠宰場采集成年牦牛肺動脈血管，置于25 ℃左右的生理鹽水中，盡快帶回實驗室。用生理鹽水和PBS分別沖洗3次，將PASMCs進行原代培養(yǎng)，之后將PASMCs分為低氧組(1% O)和常氧組(20% O)，培養(yǎng)72 h。每組設3個重復。

1.2 SDT裂解法提取蛋白及SDS-PAGE電泳

取低氧和常氧條件下培養(yǎng)的細胞樣品并加入適量SDT裂解液,采用超聲處理, 沸水浴15 min, 14 000×離心15 min，取上清后進行蛋白質定量。將保存樣品各取蛋白質20 μg，分別加入6×上樣緩沖液，沸水浴5 min，進行12% SDS-PAGE電泳(恒壓250 V，40 min)。

1.3 肽段標記及高pH反向分離

將樣品進行FASP酶解，各酶解樣品分別取100 μg肽段，按照TMT標記試劑盒(賽默飛世爾科技公司，90064CH)進行標記。將標記后的肽段混合后進行分級。色譜柱以100% A液(10 mmol·LHCOONH4, 5% ACN, pH=10.0)平衡，分離梯度見表1。洗脫過程吸光值為214 nm，每隔1 min收集一次，共收集洗脫組分約40份。將樣品凍干后用0.1% FA復溶合并為10份。

表1 高pH分離梯度Table 1 High pH separation gradient

1.4 質譜分析及鑒定

每份樣品采用納升流速Easy nLC系統(tǒng)進行分離。緩沖液A液(0.1%甲酸水溶液)以100%平衡。

樣品由自動進樣器進入分析柱進行分離。洗脫梯度見表2。

表2 液相色譜洗脫梯度Table 2 Liquid chromatography elution gradients

1.5 蛋白鑒定及生物信息學分析

將得到的原始數(shù)據(jù)按照ScoreSequestHT>0且uniquepeptide≥1條件去除空白值，篩選可信蛋白。在篩選的可信蛋白基礎上，根據(jù)FC(fold change)≥1.3或≤0.78，且<0.05條件進行DEPs篩選。使用Blast2GO軟件對鑒定的DEPs進行GO分析，分別從3個方面描述差異蛋白質的屬性：包括參與的生物過程、分子功能和細胞組分。對DEPs進行KEGG通路富集分析其主要參與的信號通路，并應用Interpro數(shù)據(jù)庫對DEPs進行功能結構域注釋分析。

2 結 果

2.1 蛋白樣本質控

經BCA法測定各組蛋白濃度，各樣本蛋白濃度均大于5 g·L。取一定量蛋白樣本進行SDS-PAGE，經考馬斯亮藍染色，結果顯示各樣本電泳條帶均清晰豐富，分布均勻，且重復性好，可以滿足下一步TMT標記蛋白組學試驗要求(圖1A)。圖1B為質譜分析BasePeak圖譜，主要反映樣品的色譜分離度、肽段信號強度以及樣品中蛋白質的構成復雜程度等。如果從色譜圖上看到在不同時間洗脫的峰較多，而且相對豐度較高，則說明樣品中的肽段種類較多，復雜程度較高。另一方面，可以通過比較不同樣品信號峰的分布情況以及質譜信號強度的相似度，來判斷樣品酶解后肽段的平行性，從而為各樣品間平行性的判斷提供依據(jù)，如圖1B所示色譜質譜行為正常，組內和組間的所有樣本平行性好。

A. 樣品SDS-PAGE電泳圖：每個樣品使用5 μg蛋白質進行檢測,并用考馬斯亮藍進行染色; M. 蛋白質相對分子質量標準;A1、A2、A3表示低氧組(1% O2)3個重復;B1、B2、B3表示常氧組(20% O2)3個重復。B.樣品質譜峰圖： 橫坐標為肽段在色譜中的保留時間，縱坐標為質譜信號強度；主要峰上的數(shù)字標記分別為信號峰強度最高的肽段的保留時間和質荷比A. SDS-PAGE of the sample: 5 μg protein of each sample was used for isolation, and the proteins were stained with Coomassie brilliant blue; M. Molecular weight of protein marker; A1,A2 and A3 represent 3 replicates in the hypoxia group (1% O2)；B1, B2 and B3 represent 3 replicates in normoxia group (20% O2). B. Sample quality spectrum peak: The abscissa is the retention time of the peptide in the chromatography， the ordinate is the mass spectrum signal intensity; The digital markers on the main peaks are the retention time and mass charge ratio of the peptide with the highest signal peak intensity圖1 定量蛋白質組學分析中蛋白質樣品的鑒定Fig.1 Identification of protein samples in quantitative proteomic analysis

2.2 蛋白質鑒定

通過TMT蛋白定量技術和串聯(lián)質譜分析，將得到的原始數(shù)據(jù)按照ScoreSequestHT>0且uniquepeptide≥1條件去除空白值，篩選可信蛋白。得到譜圖總數(shù)為488 006個，肽段譜圖數(shù)(peptide spectrum match, PSM)為116 752個，肽段總數(shù)為70 444個，唯一肽段總數(shù)為59 583個，蛋白質總數(shù)為7 600種(表3)。

表3 串聯(lián)質譜法測定蛋白質樣品的定量結果Table 3 Quantitative results of protein samples determined by tandem mass spectrometry

在兩組樣品中篩選的可信蛋白基礎上，根據(jù)FC(fold change)≥1.3或≤0.78，且<0.05條件進行DEPs篩選。共鑒定了6 859種蛋白質，其中差異比較組所有差異表達蛋白質有531種，上調差異表達蛋白質有186種，下調差異表達蛋白質有345種(圖2A)。差異表達蛋白聚類圖(圖2B)顯示，兩種條件的樣品生物學重復性較好。

A. DEPs火山圖：橫坐標表示Fold Change差異表達倍數(shù)值，縱坐標表示P值以10為底取負對數(shù)值；紅色散點表示上調蛋白(186個)，藍色散點表示下調蛋白(345個)，灰色散點表示沒有變化蛋白。B. DEPs聚類熱圖：每列代表一組樣品，其中紅色代表顯著性上調蛋白，藍色代表顯著性下調蛋白，灰色部分代表無蛋白信息；橫坐標為樣品信息，縱坐標為顯著性差異表達蛋白；A1、A2、A3表示低氧組(1% O2)3個重復組,B1、B2、B3表示常氧組(20% O2)3個重復組A. DEPs volcano figure: The abscissa represents the differential expression multiple value of Fold Change, and the ordinate represents the negative log value of P value to the base 10; Red scatter dots show upregulated proteins (186), blue scatter dots represent down-regulated proteins (345), grey scatter dots indicate no changing protein. B. DEPs clustering heat map: Each column represents a group of samples, in which red represents significantly up-regulated protein, blue represents significantly down-regulated protein, and gray represents no protein information; the abscissa is the sample information, and the ordinate is the significantly differentially expressed protein; A1, A2 and A3 represent 3 replicates in the hypoxia group (1% O2), while B1, B2 and B3 represent 3 replicates in the normoxia group (20% O2)圖2 低氧與常氧條件下牦牛PASMCs比較蛋白質組學分析Fig.2 Proteomic analysis in PASMCs of yaks under hypoxia and normoxia conditions

2.3 Western blot 驗證

將篩選出的DEPs隨機挑選出進行免疫蛋白印跡驗證(圖3)，結果與TMT檢測結果一致。說明該技術具有可靠性。

A.PDK1和Smad2蛋白檢測結果;B. PDK1蛋白相對表達量; C. Smad2蛋白相對表達量。內參蛋白為β-actin; Nor表示常氧組，Hyp表示低氧組；**.P<0.01A. PDK1 and Smad2 protein detection results; B. Relative expression of PDK1 protein; C. Relative expression of Smad2 protein. β-actin is internal reference protein; Nor stands for normoxia group, Hyp stands for hypoxia group; **. P<0.01圖3 DEPs的Western blot 驗證Fig.3 Western blot analysis of DEPs

2.4 生物學信息分析

為了進一步了解低氧與常氧下DEPs的生物學意義，通過GO功能注釋和KEGG通路富集對DEPs進行富集分析。GO條目被分為細胞組成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物學過程(biological process, BP)3個部分(圖4)，其中差異表達蛋白富集數(shù)量最多的幾個類別為細胞外空隙(extracellular space)，質膜的組成部分(integral component of plasma membrane)，細胞表面(cell surface)，絲氨酸型內肽酶抑制劑活性(serine-type endopeptidase inhibitor activity)，肝素結合(heparin binding)，鈣離子結合(calcium ion binding)，內肽酶活性的負調控(negative regulation of endopeptidase activity)，衰老(aging)，嗜中性粒細胞脫顆粒(neutrophil degranulation)。

橫坐標表示P值以10為底取負對數(shù)值，縱坐標表示GO功能注釋名稱The abscissa represents the negative log of P to the base 10, and the vertical axis represents the GO functional annotation names圖4 GO富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis diagram

進一步KEGG通路富集數(shù)據(jù)分析，圖中顯示了富集前10的通路(圖5)，結果表明，顯著DEPs富集在次生代謝產物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites；21種蛋白)，溶酶體(lysosome；14種蛋白)，補體系統(tǒng)(complement and coagulation cascades；10種蛋白)， HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway；8種蛋白)，糖酵解與糖代謝合成(glycolysis/gluconeogenesis；8種蛋白)，膽固醇代謝(cholesterol metabolism；7種蛋白)，中樞碳代謝(central carbon metabolism in cancer；7種蛋白)， PPAR信號通路(PPAR signaling pathway；7種蛋白)，細胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction；6種蛋白)，其他多糖降解(other glycan degradation；4種蛋白)。

表4 重要DEPs篩選Table 4 Screening of important DEPs

橫坐標表示P值以10為底取負對數(shù)值，縱坐標表示KEGG通路名稱The abscissa represents the negative log of P value to the base 10, and the ordinate indicates the KEGG pathway names圖5 KEGG富集分析圖Fig.5 KEGG enrichment analysis diagram

通過對DEPs功能分析，在次生代謝產物的生物合成、細胞因子受體相互作用、糖酵解與糖代謝合成、HIF-1信號通路中篩選出7個與低氧適應性相關的DEPs，見表4。

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位，蛋白質的亞細胞定位是進行蛋白質功能研究的重要信息，蛋白質合成后只有被轉運到正確的細胞器中才能參與各項生命活動，并有效地發(fā)揮功能。因此，本研究使用軟件WoLF PSORT對差DEPs進行亞細胞定位分析。結果顯示(圖6)，質膜(plasma membrane)占28.9%，細胞外基質(extracellular)占25.4%，細胞溶質(cytosol)占18.6%，細胞核(nucleus)占15.4%。

圖6 差異蛋白質亞細胞定位分析圖Fig.6 Subcellular localization analysis of differential proteins

結構域是蛋白質結構、功能和進化的單位。研究蛋白質的結構域對于理解蛋白質的生物學功能及其進化具有重要的意義。因此，本研究采用Interpro資源數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白質的功能結構域的注釋及富集情況。DEPs結構域結果顯示(圖7)，富集在表皮生長因子樣結構域(EGF-like domain)的DEPs比較多。

橫坐標表示P值以10為底取負對數(shù)值，縱坐標表示結構域名稱The abscissa represents the negative log of P value to the base 10, and the ordinate indicates the domain names圖7 差異蛋白質結構域分析圖Fig.7 Domains analysis of differential proteins

3 討 論

TMT技術用于定量蛋白質組學，具有高通量和高重現(xiàn)性。在這項研究中，基于TMT技術以牦牛PASMCs作為研究對象，對在低氧和常氧不同培養(yǎng)條件下的DEPs進行篩選，并進行生物學信息分析。

結果表明，經TMT分析，在比較低氧和常氧下的PASMCs的2組蛋白樣品中共獲得6 859個蛋白，以FC≥1.3或≤0.78，且<0.05 條件進行篩選，獲得DEPs共531個，其中上調DEPs有186個，下調DEPs有345個。分別富集在糖代謝、酶活性等低氧適應相關類別上。這些DEPs主要富集在中樞碳代謝、糖酵解與糖代謝合成、HIF-1信號通路、次生代謝產物的生物合成等低氧適應相關通路中。推測這些DEPs給機體的提供氧和能量在低氧下起重要作用。低氧狀態(tài)下通過誘導激活HIF-1α對局部組織和細胞的缺氧、缺血，并改變糖代謝和氧代謝的平衡來維持機體的生理穩(wěn)態(tài)，并且通過氧化應激和自噬調節(jié)來維持組織細胞生存。

本研究通過GO與KEGG對DEPs進行功能富集和分析，其中在次生代謝產物的生物合成、細胞因子受體相互作用、糖酵解與糖代謝合成、HIF-1信號通路中篩選出7個重要的DEPs(PGK、HK、LDH、PGAM、pfkA、IL6ST、PDK1)，在缺氧狀態(tài)下以糖酵解作為主要的供能方式。磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)是一種胞內蛋白，是產生能量的糖酵解酶，可催化1,3-二磷酸甘油酸與ADP的可逆轉移，產生3-磷酸甘油酸和ATP。PGK不僅在協(xié)調糖酵解和三羧酸循環(huán)中發(fā)揮重要作用，而且還作為二硫化物還原酶參與血管生成過程。PGK可被O-GlcNAc糖基化激活并誘導至線粒體。在線粒體內PGK作為一種激酶激活丙酮酸脫氫酶激酶1(PDHK1)磷酸化并抑制丙酮酸脫氫酶(PDH)復合物，降低線粒體丙酮酸利用率以減少氧化磷酸化，同時增加乳酸的產生。在低氧條件下，HIF-1α上調PGK的表達, 利用糖酵解途徑為機體提供能量, 并參與血管生成過程，滿足機體活動需要，進而適應外界環(huán)境。己糖激酶(hexokinases, HK)將葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸，是調節(jié)糖酵解的關鍵酶。缺氧條件下HK的上調增強了糖酵解，增加了細胞的自噬和上皮-間質轉化。己糖激酶的上調可通過與線粒體外膜結合促進糖酵解，為細胞代謝提供ATP。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)有LDHA和LDHB兩種亞型，在低氧條件下，LDHA通過HIF信號調節(jié)TME, HIF-1α或HIF-2α均與啟動子中的HRE-D相互作用，LDH的上調表達提高了糖酵解水平和細胞代謝能力。在缺氧微環(huán)境中，HIF-1α可以通過穩(wěn)定上調HK、LDH、PGK等糖酵解酶的表達促進葡萄糖吸收/糖酵解和線粒體代謝，為細胞提供能量。磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate Mutase, PGAM)是一種參與糖酵解過程的關鍵酶，可以通過將3-磷酸甘油酸轉變?yōu)?-磷酸甘油酸促進糖酵解，在低氧下，HIF可誘導PGAM表達并與其啟動子區(qū)低氧反應原件結合發(fā)揮轉錄調控作用，從而導致PGAM活性升高，進而促進糖酵解。磷酸果糖激酶(phosphofructose kinase, pfkA)是細胞糖酵解代謝途徑中的限速酶，可以催化果糖-6-磷酸發(fā)生磷酸化變成果糖-1,6-二磷酸。近幾年的研究表明，在低氧微環(huán)境中pfkA表達上調，促進細胞代謝，給機體提供能量。白介素6信號傳感器(IL6ST)在低氧下顯著下調，近幾年研究發(fā)現(xiàn)IL6ST為抑癌蛋白，可用于腫瘤診斷和治療。已成為多種疾病治療的潛在新靶點，抑制IL6ST表達在腫瘤的治療中具有重要作用。目前已經開發(fā)出抑制IL6ST的方法并進行了臨床試驗，但通過缺氧抑制該蛋白表達尚未見報道。丙酮酸脫氫酶激酶 (pyruvate dehydrogenase kinase, PDK) 是糖酵解過程中重要的調節(jié)酶，在調節(jié)體內葡萄糖和脂肪酸代謝過程中發(fā)揮著至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可上調PDK1的表達，促使腫瘤細胞的糖酵解。近年來發(fā)現(xiàn)，PDK1特異性地在腫瘤細胞中高表達，有可能成為腫瘤治療的新靶點。本試驗也采用WB驗證了PDK1在低氧和常氧下的蛋白表達量，結果顯示，PDK1在低氧和常氧下的表達量差異極顯著(圖3)。

隨著組學技術的發(fā)展，目前對于物種的適應性研究分析也越來越多，在本研究中篩選出的PGK、HK、LDH和PGAM與前期研究低氧脅迫雜交魚篩選的蛋白(PGK、HK、LDH和PGAM)一致，在低氧和常氧條件下的表達差異性較大，證實了本試驗的準確性。本試驗篩選的pfkA與前期低氧對大鼠肝脂代謝的試驗結果一致，低氧和常氧條件下pfkA表達的差異性比較顯著。對于本試驗篩選的IL6ST和PDK1，目前在癌癥的研究中較多，也有研究證實它們與低氧相關，但是具體在低氧下的機制尚未明確。

4 結 論

本研究采用TMT技術對缺氧和常氧條件下牦牛PASMCs的DEPs進行篩選和功能分析。結果表明，DEPs分別富集在代謝、酶活性、低氧適應性等相關類別與通路中。在中樞碳代謝、糖酵解與糖代謝合成、HIF-1信號通路、次生代謝產物的生物合成等低氧適應相關通路中發(fā)現(xiàn)7個重要的DEPs(PGK、HK、LDH、PGAM、pfkA、IL6ST、PDK1)，可能與低氧環(huán)境的適應有關。本研究是探索牦牛PASMCs在低氧下適應性差異蛋白的初步試驗，這些結果為進一步研究牦牛低氧適應性提供了基礎數(shù)據(jù)。