Kruppel 樣因子15對和盈黑雞前體脂肪細胞增殖分化的影響

陳 蘭，張 濤，丁 浩，謝愷舟*，張跟喜，王金玉

(1. 揚州大學獸醫學院(比較醫學研究院)，揚州 225009； 2. 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；3. 教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州 225009)

家雞()是一種廣泛應用于發育生物學和基因組學研究的重要模式生物，是人類高質量膳食蛋白質的主要來源。幾十年來經過遺傳選育，使商品化肉雞的生長速度和飼料效率顯著提高。然而，由于對肉雞高生長速度的過度追求，導致現代肉雞品種出現了腹部脂肪過度沉積的現象。腹部脂肪沉積過多既浪費日糧能量，還引起生產性能下降、蛋雞繁殖性能減弱等問題，影響家禽產業經濟效益。因此，控制腹部脂肪過度沉積已成為目前肉雞育種工作的主要目標之一。

Kruppel 樣因子15(Kruppel-like factor 15，15)基因是Uchida等首次從人的腎cDNA文庫中獲得的，是一類含有鋅指結構的轉錄因子，位于雞的12號染色體上，在其羧基端具有3個CH鋅指結構，能夠識別并結合富含GC的DNA序列。研究發現，腹部脂肪沉積受多種遺傳因素調控，而KLF家族在脂肪生成過程中起著重要作用，脂肪形成受內部等級調節的影響。研究發現，15能夠調節棕色脂肪細胞葡萄糖和脂肪酸之間的燃料轉換，參與調控哺乳動物脂肪細胞分化和脂質沉積，還與膿毒癥、膠質瘤、肺腺癌、心房顫動等疾病治療和預后密切相關。

在本實驗室前期測序分析中發現，15基因可能參與調控雞脂肪沉積。研究表明，游離脂肪酸通過4抑制3T3-L1前脂肪細胞15的表達和葡萄糖消耗。另外，通過siRNA干擾15基因，能夠抑制豬前體脂肪細胞脂滴的形成，從而調控脂肪沉積。目前，關于15功能研究多集中在鼠、豬、牛等哺乳動物，在家禽上鮮有報道。本研究利用RT-qPCR技術檢測和盈黑雞15基因的組織表達譜及其在不同發育時期腹脂組織中的時序表達模式；利用siRNA技術干擾15，檢測前體脂肪細胞的增殖和成脂分化，分別從形態學和分子生物學等角度研究15對前體脂肪細胞增殖和成脂分化的影響，為進一步揭示15在雞脂肪沉積過程中發揮的功能及調控機理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為和盈黑雞，飼養于江蘇和盈家禽育種科技有限公司，分別隨機選取相同環境下飼養的和盈黑雞0(出殼第1天)、4、8、12和16周齡的健康公、母雞各4只，分別采集心、肝、脾、肺、胸肌、腿肌和腹脂組織。樣本放入裝有RNA wait樣品保存液(天根，中國)的無酶EP管中，置于-20 ℃冰箱保存備用，待提取總RNA。

選取5只10日齡左右的和盈黑雞母雞，無菌狀態下采集腹部脂肪組織用于原代前體脂肪細胞的分離培養。

1.2 試驗試劑

TRIzol購自Invitrogen(中國香港)；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自諾唯贊生物科技有限公司；I型膠原蛋白酶和胎牛血清購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Cell Counting Kit-8(Dojindo，日本)、EDU試劑盒(銳博生物，中國)、磷酸鹽緩沖液、青霉素/鏈霉素溶液、DMEM/F12培養基、Triton X-100、4%多聚甲醛、油酸和油紅O染色試劑盒均購自索萊寶生物科技有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇均為國產分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織RNA的提取 本試驗采用TRIzol法提取組織總RNA，通過NanoDrop-2000c測定總RNA的質量(OD值在1.8～2.0之間為合格)和濃度。

1.3.2 引物設計 根據GenBank上的原雞15序列(XM_025154676.1)、序列(NM_001031459. 1)和序列(XGAM_015292933. 2)，使用Primer Premier 5軟件跨內含子各設計1對RT-qPCR引物，以-(NC_052545.1)作為內參基因，內參基因引物序列參照張濤等的研究，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 熒光定量引物Table 1 The primers sequences of real-time PCR

1.3.3 cDNA合成及RT-qPCR檢測 反轉錄反應采用諾唯贊生物科技有限公司的兩步法試劑盒進行，總體系為20 μL：第一步添加RNA模板1 μg，gDNA wiper Mix 4 μL, RNA-Free ddHO補足至16 μL，吹打混勻，42 ℃ 孵育2 min；第二步，在第一步反應液中加入qRT Super Mix 4 μL，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，得到cDNA，-20 ℃冰箱保存備用。

RT-qPCR反應采用諾唯贊生物科技有限公司的SYBR Green染料法熒光定量試劑進行檢測，反應體系為： cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL， Master Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，RNA-Free ddHO補足至20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環數進行信息采集。

1.3.4 和盈黑雞原代前體脂肪細胞的分離培養 雞前體脂肪細胞的分離培養方法主要采用酶消化法，具體操作步驟：隨機選擇7～10日齡(7-10 d)的和盈黑雞母雞5只，頸靜脈放血，在 75%乙醇中潤洗消毒，然后收集腹部脂肪組織，置于60 mm無菌培養皿中，磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)浸洗3～5遍。將脂肪組織剪碎，按1∶3移入裝有Ⅰ型膠原蛋白酶消化液離心管中，37 ℃水浴，消化95 min，使其充分接觸消化。待消化完全(一般呈黏膠狀)，加入等體積完全培養基終止消化，然后分別用200和400目的細胞過濾篩依次過濾，收集濾液于無菌離心管中，500×離心10 min，棄上清液，用完全培養基重懸細胞沉淀，接種60 mm細胞培養皿中，置于37 ℃， 5%的CO培養箱中培養，待細胞貼壁，每隔48 h換液1次。

1.3.5 和盈黑雞原代前體脂肪細胞誘導分化 雞原代前體脂肪細胞在60 mm細胞培養皿培養，當細胞增殖密度達80%～90%時，進行傳代試驗，將細胞懸液接種12孔培養板，置于含5% CO培養箱中培養，待細胞增殖至完全融合時，更換誘導培養基(含有160 μmol·L油酸濃度的培養基)，每48 h更換誘導培養基1次，直至144 h分化完全。分別在誘導12、48、96、144 h時油紅O染色后觀察細胞形態并拍照，然后加入異丙醇萃取分析甘油三酯含量，每組各3個重復，收集的細胞樣品置于-80 ℃冰箱保存，待RNA提取。

1.3.6 EdU檢測 將原代前體脂肪細胞接種于12孔板培養，使用jetPRIME polyplus轉染試劑分別轉染siR-15和siR-NC后，利用EdU Cell Proliferation Detection Kit (Ribobio, 廣州, 中國)對細胞進行固定染色，倒置熒光顯微鏡觀察拍照，并用ImagePro Plus 6.0(Media Cybernetics, Maryland, 美國)進行統計學分析。

1.3.7 CCK-8檢測 將原代前體脂肪細胞接種96孔板培養，分別轉染siR-15和siR-NC，每組8個重復，使用cell Counting Kit-8 cell Counting Kit (Dojindo, Kumamoto, 日本)細胞增殖檢測試劑盒，通過酶標儀(Thermo Fisher, Platinum Elmer, 德國)測定不同時期(12、24、36和48 h)的450 nm吸光值，分析細胞增殖情況。

1.3.8 油紅O染色及甘油三酯含量測定 油紅O既是脂溶劑也是染脂劑，待細胞誘導分化12、48、96、144 h，分別固定、染色，具體操作參照油紅O染色試劑盒(Solarbio，北京，中國)說明書進行。染色完畢，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。隨后在培養板中加入200 μL異丙醇萃取10～15 min，酶標儀測定510 nm的吸光值分析甘油三酯含量。

1.3.9 數據分析 數據采用2法進行處理分析，組織表達分布計算公式為：ΔCt=Ct-Ct，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt；表達規律計算公式為：ΔCt=Ct-Ct，ΔΔCt=ΔCt-ΔCt。其中，Ct(初始循環數)為熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。使用SPSS20.0軟件對試驗數據進行分析，所有數據用“均值±標準差”表示，<0.05(*)或< 0.01(**)表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 目的基因與內參基因擴增

利用已設計好的15、、、和-的引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，得到的條帶與目的條帶一致，分別為189、138、155、196和169 bp，條帶長度與預期相符，清晰無拖尾，表明引物特異性良好，cDNA模板完整性好。

M.DNA相對分子質量標準;1～3. KLF15擴增的產物；4～6. PPARγ擴增產物；7～9. β-actin擴增產物；10～12. C/EBPa擴增產物;13～14. FAS擴增產物M. DL500 DNA Marker; 1-3. Amplification products of KLF15; 4-6. Amplification products of PPARγ; 7-9. Amplification products of β-actin; 10-12. Amplification products of C/EBPa;13-14. Amplification products of FAS圖1 PCR產物凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products

2.2 和盈黑雞KLF15基因表達分析

為了獲得15的組織表達分布和在脂肪組織中的發育性表達規律，利用RT-qPCR技術檢測15在和盈黑雞不同組織中的表達情況。結果顯示，15在和盈黑雞中呈現多組織廣泛表達的特性，在公雞肺、胸肌、肝、腹脂和腿肌均有較高的表達量，且極顯著高于其它組織(<0.01)，在母雞胸肌組織中表達量最高，其次是腹脂組織，顯著高于肝、心、腿肌和腎組織 (<0.05)，極顯著高于肺和脾組織(<0.01)(圖2)；分別選取1日齡及4、8、12和16周齡公、母雞各3只，采集腹脂組織繪制不同發育時期的表達規律。結果顯示，15在公、母雞腹脂中分別呈“L”和“U”表達趨勢，表達高峰均出現在1日齡，隨著生長發育的不斷進行公雞在4周齡時表達量最低，然后緩慢上升；母雞到達12周齡時最低，然后上升(圖3)。

圖中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01),不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)；內參基因為β-actin，n=3Different capital letters indicated highly significant differences (P<0.01), different lowercase letters showed significant differences (P<0.05).Internal reference gene is β-actin, n=3圖2 KLF15在公雞(A)和母雞(B)不同組織中的表達Fig.2 Expression of KLF15 in different tissues of male (A) and female (B) chickens

圖3 KLF15在和盈黑雞公雞(A)和母雞(B)脂肪組織不同階段的表達規律Fig.3 The expression patterns of KLF15 in abdominal fat of male (A) and female (B) Heying Black chickens at different growth stages

2.3 KLF15基因對雞前體脂肪細胞分化的影響

利用油酸誘導脂肪細胞分化，誘導分化12、48、96、144 h 時使用油紅O對細胞進行染色，并拍照觀察。每孔加入異丙醇萃取，酶標儀測定510 nm吸光值，分析TG含量，同時檢測分化不同時期15 mRNA水平。觀察發現，隨著誘導的進行，細胞形態隨之變化，在分化12 h時，細胞輪廓清晰，48 h胞內出現少量黃色小脂滴，96 h可見橙色大小不一的脂滴，144 h細胞輪廓模糊，呈現紅色片狀脂滴；TG含量分析發現，隨著分化的進行TG含量呈現持續上升趨勢，分化144 h時TG含量最高，顯著高于96 h(<0.05)，極顯著高于48和12 h(<0.01)，15 mRNA表達變化趨勢與之一致，在誘導成脂的前期15 mRNA呈現緩慢上升趨勢，分化144 h表達量達高峰(圖4)。

A、B、C、D.誘導分化12、48、96和144 h的細胞(100×)；E. 脂肪細胞分化不同時期TG含量；F. KLF15在分化不同時期的表達譜。*.差異顯著(P<0.05)，**.差異極顯著(P<0.01)，下同A, B, C, D. The preadipocytes induced for 12, 48, 96 and 144 h, respectively (100×); E. TG content in adipocytes at different stages of differentiation; F. Expression profile of KLF15 at different stages of differentiation. *.The significant difference (P<0.05), * *. The extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖4 KLF15對和盈黑雞原代前體脂肪細胞分化的影響Fig.4 Effects of KLF15 on preadipocyte differentiation of primary precursor of Heying Black chickens

2.4 干擾KLF15基因對前體脂肪細胞增殖的影響

采用CCK-8檢測干擾15基因后對前體脂肪細胞增殖的影響。如圖5所示，干擾15基因顯著抑制了細胞增殖，24 h 干擾組OD值顯著低于對照組(<0.05)，36～48 h極顯著低于對照組(<0.01)。

圖5 CCK-8檢測干擾KLF15對前體脂肪細胞增殖的影響Fig.5 Effect of interfering with KLF15 on cell proliferation using CCK-8 detection

采用EdU細胞增殖試劑盒檢測干擾15基因對前體脂肪細胞增殖的影響，EdU檢測結果如圖6所示，增殖細胞標記為紅色熒光，干擾15基因后，極顯著抑制了細胞增殖，紅色熒光細胞占藍色熒光細胞的比例明顯降低，ImagePro Plus 6.0分析發現干擾組細胞比例極顯著低于對照組(<0.01)，表明干擾15基因后前體脂肪細胞增殖受到抑制。

圖6 在雞前體脂肪細胞中干擾KLF15后EdU檢測結果Fig.6 EdU detection results of interfering with KLF15 in chicken preadipocytes

2.5 干擾KLF15基因對前體脂肪細胞分化的影響

2.5.1 干擾15基因對分化標記基因表達的影響 為研究15基因對前體脂肪細胞分化的調控作用，本研究利用RT-qPCR技術檢測干擾15基因后前體脂肪細胞分化標志基因、和的表達變化。結果如圖7所示，與對照組相比，干擾組、和的表達均被抑制，其中干擾組、表達極顯著低于對照組(<0.01)，表達顯著低于對照組(<0.05)。

圖7 在前體脂肪細胞中干擾KLF15對分化相關基因表達的影響Fig.7 Effects of interfering with KLF15 on the expression of differentiation-related genes in chicken preadipocytes

2.5.2 干擾15基因對前體脂肪細胞成脂分化的影響 在前體脂肪細胞誘導分化第6天時，利用油紅O試劑盒染色后進行形態學觀察。結果如圖8所示，干擾組紅色脂滴數量顯著少于對照組，甘油三酯含量測定分析結果表明，干擾組TG含量極顯著低于對照組(<0.01)，結果與油紅O染色的形態學觀察結果相符。綜上所述，干擾15基因后，明顯抑制了和盈黑雞原代前體脂肪細胞的成脂分化。

圖8 干擾KLF15基因對前體脂肪細胞分化的影響Fig.8 The effect of interfering with KLF15 on preadipocyte differentiation

3 討 論

15基因是KLFs家族成員之一，具有廣泛的生物學功能。15通過調控葡萄糖轉運因子4的表達在脂肪組織和肌肉組織的代謝通路中發揮關鍵作用。脂肪形成是一個復雜的過程，涉及許多不同的信號通路和轉錄因子的整合。研究表明，該家族已有多個成員可能參與脂肪細胞分化。本實驗室前期通過高通量測序技術結合生物信息學分析發現，15基因在雞前體脂肪細胞成脂分化過程中差異表達，推測其可能參與調控雞脂肪沉積。因此，本研究首先通過RT-qPCR技術對15在和盈黑雞各組織中的表達分布及在脂肪組織不同發育時期的表達規律進行定量分析，結果表明，15在8個被測組織中呈現廣泛表達的特性。在公雞的肺、胸肌、肝、腹脂和腿肌的表達量極顯著的高于其它組織(<0.01)，母雞中胸肌組織表達量最高，其次是腹脂組織顯著高于其它組織(<0.05)，而在脾組織中表達量最低。本結果與王英明等的研究結果存在相似之處，該研究顯示15同樣在肺中表達最高，腎組織中表達最低。而郭紅芳在牛上的研究與本研究結果相反，15基因在牛腎、肝和脂肪組織中均高表達，肺中表達量最低。表明15的表達存在物種特異性。發育性表達分析發現，15在公、母雞的表達分別呈現“L”型和“U”型趨勢，表達量最高峰均出現在1日齡時，隨后下降。表明15在生長發育初期高表達。本研究通過檢測15在體外培養和盈黑雞前體脂肪細胞分化過程中的表達差異來進一步明確15在機體細胞生長過程中的表達模式。在分化的12 h時檢測發現細胞開始融合，表達量相對較低，48 h胞內開始分化小脂滴，表達開始緩慢上升，96 h細胞形態模糊，脂滴明顯增多，表達量顯著上升，144 h已分化完全形成紅色大脂滴，表達量達高峰，此時TG含量最高，顯著或極顯著高于96、48和12 h。表明15在和盈黑雞前體脂肪細胞分化過程中發揮著重要作用。

研究明確了干擾15能夠抑制前體脂肪細胞的增殖，本研究檢測了在前體脂肪細胞中干擾15對細胞增殖能力的影響，結果發現，干擾15后，細胞增殖能力開始下降，在培養24、36和48 h細胞增殖水平顯著或極顯著低于對照組。同時，EdU檢測細胞增殖試驗結果與之一致。

研究闡明干擾15在和盈黑雞原代前體脂肪細胞成脂分化過程中的調控作用，本研究利用siRNA干擾15表達。發現干擾15后，和盈黑雞前體脂肪細胞內脂滴的數量明顯減少并變小，TG含量極顯著降低(<0.01)，表明15可能是前體脂肪細胞的正調控因子。Chai等研究報道，15參與前脂肪細胞的分化，與甘油三酯含量呈正相關，與本試驗結果一致。在豬脂質沉積過程中敲低15的表達，會導致甘油三酯水平顯著降低(<0.05)；Mori等在3T3-L1細胞中研究發現，過表達15基因能夠顯著促進3T3-L1細胞脂滴的形成，表明15在脂肪細胞分化過程中發揮著積極的作用。本研究中，干擾15基因后、等分化標志基因的表達水平顯著降低(<0.01)。PPARγ是成脂分化的關鍵轉錄因子之一，能夠調控脂肪細胞表型基因的表達，促進脂肪細胞的分化。C/EBPa是C/EBPs家族中的一員，與相互協同，正向調節細胞分化。研究發現，在牛前體脂肪細胞中，過表達15后成脂標志基因和顯著上調，而干擾15后成脂標志基因顯著下調，表明15在脂肪細胞分化和脂質代謝中發揮正向調控作用。高欣研究發現，豬腎細胞瞬時轉染15轉錄因子能夠顯著上調成脂關鍵因子的表達，促進細胞脂質沉積。脂肪酸合成酶(FAS)是催化脂肪酸從頭合成的關鍵酶，在細胞分化過程中發揮著重要作用。前期的研究表明，在脂肪細胞分化過程中呈現上升趨勢。本研究檢測發現，干擾15后前體脂肪細胞分化標志基因、和的表達水平明顯下降。因此推測，干擾15可能是通過下調分化標志基因的表達來調節前體脂肪細胞的分化成脂，但15具體的調控機理待更深層的研究證明。

4 結 論

本研究成功繪制了和盈黑雞15在多組織分布表達譜、脂肪組織時空表達譜及成脂分化過程中的表達規律，發現15多組織廣泛表達的特性，其在腹脂組織中表達量相對較高。在細胞分化過程中15呈現上升趨勢，在分化后期達到高峰。干擾15能夠顯著抑制細胞增殖分化。推測其在前體脂肪細胞分化過程中為正調控因子，可能通過調控分化標志基因、和的表達抑制細胞成脂分化。然而，關于進一步闡明15影響前體脂肪細胞增殖分化的機制還需深入研究，有望為肥胖治療開辟新的思路和途徑。