基于RAD-seq靜原雞保種群體的遺傳變異分析

馬麗霞，曹?chē)?guó)偉，朱紅芳，鄧占釗，蔡正云，周成浩，韓 威，顧亞玲，張 娟*

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021； 2. 彭陽(yáng)縣畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，固原 756599；3. 彭陽(yáng)縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，固原 756599； 4. 江蘇省家禽科學(xué)研究所 國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)，揚(yáng)州 225125)

靜原雞原名固原雞，也稱(chēng)靜寧雞，原產(chǎn)地和中心產(chǎn)區(qū)位于寧夏回族自治區(qū)固原市和甘肅省靜寧縣。2006年被列入《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》，是寧夏回族自治區(qū)5個(gè)區(qū)級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種之一。靜原雞根據(jù)羽色可以分為白羽、麻羽和黑羽，具有典型的地方禽類(lèi)品種屬性，如：耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)性好以及良好的山區(qū)放養(yǎng)性等。同時(shí)，靜原雞兼具屠宰率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、脂肪酸含量高、膽固醇含量低等特點(diǎn)，已逐漸成為當(dāng)?shù)鼐G色食品品牌之一。但由于引入品種雞的沖擊，使得這一優(yōu)良地方品種雜化現(xiàn)象嚴(yán)重，并出現(xiàn)生活力降低、生長(zhǎng)勢(shì)減弱、生產(chǎn)性能下降、抗病能力差等一系列不良現(xiàn)象。因此，加快靜原雞的保種對(duì)保護(hù)國(guó)家及地方畜禽種質(zhì)資源具有重要意義。現(xiàn)階段，靜原雞的保護(hù)主要以保種場(chǎng)為主體，以家系等量留種的原則開(kāi)展活體保護(hù)，雖然在極大程度上保護(hù)了靜原雞群體的遺傳多樣性，但也存在因初始群體系譜不完善造成的祖源不清問(wèn)題。

在物種資源保護(hù)中，系譜記錄依賴(lài)于基礎(chǔ)群，當(dāng)系譜數(shù)據(jù)記錄存在問(wèn)題時(shí)，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體間的親緣關(guān)系及近交系數(shù)出現(xiàn)錯(cuò)誤，因此會(huì)出現(xiàn)近交衰退和適應(yīng)能力下降等現(xiàn)象，而種群內(nèi)的遺傳多樣性對(duì)于適應(yīng)能力和避免近交衰退是必要的。目前，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)已成為最理想的群體遺傳多樣性和基因組學(xué)的分子標(biāo)記，而限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)的DNA(re-striction-site associated DNA，RAD)測(cè)序技術(shù)能鑒定出廣泛覆蓋基因組范圍的SNP位點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于資源群體的遺傳多樣性研究。在家禽中，韓威等基于RAD-seq技術(shù)在19個(gè)地方雞種中鑒定出400 562個(gè)SNPs標(biāo)記，揭示了19個(gè)品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)并發(fā)掘了與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、生殖機(jī)能調(diào)控、應(yīng)激響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的種質(zhì)特性基因。在草食動(dòng)物中，Liu等利用RAD-seq技術(shù)研究了6個(gè)中國(guó)地方兔品種和2個(gè)引進(jìn)兔品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，鑒定出了與黑素生成相關(guān)的基因。Liu等采用RAD-seq技術(shù)在內(nèi)蒙古、甘肅、青海和新疆4個(gè)地區(qū)的47只家養(yǎng)雙峰駝中檢測(cè)到1 568 087個(gè)SNPs，且新疆駱駝的遺傳多樣性最高，連鎖不平衡(LD)系數(shù)的衰減率最快。

鑒于此，本研究利用RAD-seq技術(shù)從分子水平研究靜原雞群體的遺傳多樣性和分子遺傳進(jìn)化，比較白羽、麻羽和黑羽靜原雞的遺傳多樣性差異以及群體結(jié)構(gòu)間的關(guān)系，篩選與靜原雞羽色性狀相關(guān)的候選基因，以期為靜原雞不同羽色的品系化培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集和DNA的提取

本試驗(yàn)所用靜原雞樣品來(lái)自寧夏回族自治區(qū)固原市彭陽(yáng)縣靜原雞繁育中心。在相同飼養(yǎng)條件下選取180日齡品種特征明顯、發(fā)育正常且健康的白羽(white feather, WF)、麻羽(hemp feather, HF)、黑羽(black feather, BF)靜原雞各60只(40只母雞，20只公雞)，翅下靜脈采血1.5 mL，EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝，通過(guò)酚-氯仿法抽提血液基因組DNA。

1.2 RAD文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

利用ddRAD建庫(kù)方式構(gòu)建長(zhǎng)度范圍在300～500 bp的pair-end文庫(kù)，進(jìn)行R I(G^AATTC)和III(Hin1IICATG^)雙酶切簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。

1.3 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控和過(guò)濾

利用GATK和samtools程序?qū)υ紲y(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，截除Reads中的測(cè)序接頭以及引物序列，過(guò)濾平均質(zhì)量值小于Q5的Reads、過(guò)濾N個(gè)數(shù) > 5的Reads和長(zhǎng)度過(guò)短序列，獲取SNP質(zhì)量值Q≥30，最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)≥ 0.05，SNP信息完整度≥0.70的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。其它過(guò)濾參數(shù)：QD < 2.0，MQ < 40.0，F(xiàn)S > 60.0，SOR > 6.0，MQRankSum < -12.5，ReadPosRankSum < -8.0，符合參數(shù)即過(guò)濾。對(duì)SNP進(jìn)行過(guò)濾后，使用得到的SNP標(biāo)記進(jìn)行PCA、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、群體結(jié)構(gòu)、選擇性清除等分析。

1.4 SNP的檢測(cè)

利用BWA軟件將獲得的Clean Reads比對(duì)到參考基因組上(http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/gallus_gallus)，根據(jù)Clean Reads在參考基因組的定位結(jié)果，使用GATK軟件進(jìn)行SNP的檢測(cè)。

1.5 群體遺傳多樣性分析

通過(guò)PopGen軟件計(jì)算觀察雜合度()、群體內(nèi)核酸多態(tài)性()和群體的平均近交系數(shù)()。利用軟件PopLDdecay進(jìn)行連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)分析，參數(shù)設(shè)置為：-OutPairLD 5。

1.6 群體結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)軟件GCTA進(jìn)行主成分分析(principal components analysis，PCA)，然后利用R包繪制PCA散點(diǎn)圖。對(duì)過(guò)濾后篩選得到的SNPs標(biāo)記，采用軟件FastTree中的極大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(phylogenetic tree)，并使用Shimodaira-Hasegawa test方法判斷每個(gè)節(jié)點(diǎn)的可信度。使用admixture軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，預(yù)先設(shè)定K=2～15的遺傳簇?cái)?shù)。

1.7 選擇性清除分析

對(duì)經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后的SNP進(jìn)行選擇性清除分析。采用遺傳分化系數(shù)()和核苷酸多樣度(π)相結(jié)合的方法，以100K為一個(gè)window，10K為步長(zhǎng)取一個(gè)區(qū)域(群體中任意兩條不同序列的堿基差異數(shù)取平均值)，值按照大小排列，取大小排在前5%的區(qū)域信息，π的比值取位于前5%與后5%的區(qū)域，根據(jù)與π比值篩選出的區(qū)域取交集作為關(guān)聯(lián)結(jié)果，該過(guò)程使用軟件vcftools進(jìn)行分析。

1.8 全基因組關(guān)聯(lián)分析

使用TASSEL(https://tassel.bitbucket.io)軟件的MLM模型對(duì)不同群體的羽色性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計(jì)算模型為：=α+β+μ+，其中，為表型性狀，為基因型(固定效應(yīng))的指示矩陣，為固定效應(yīng)的估計(jì)參數(shù)；為群體遺傳結(jié)構(gòu)的指示矩陣，為SNP的效應(yīng)；為個(gè)體親緣關(guān)系指示矩陣，為預(yù)測(cè)的隨機(jī)個(gè)體；是隨機(jī)殘差，服從e～(0，δe2)。通過(guò)關(guān)聯(lián)的顯著度(-value)篩選出潛在的候選SNPs，利用ANNOVAR對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行注釋。

1.9 基因注釋和富集分析

將選擇性清除分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析得到的顯著SNPs位點(diǎn)映射至ENSEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/gallus_gallus)公布的雞參考基因組上，進(jìn)行顯著位點(diǎn)的注釋。利用KOBAS(http://bioinfo.org/kobas/annotate/)對(duì)受選擇的基因進(jìn)行KEGG分析。

2 結(jié) 果

2.1 RAD測(cè)序和數(shù)據(jù)質(zhì)量

利用RAD-seq技術(shù)對(duì)靜原雞3個(gè)類(lèi)群180只雞進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)Illumina平臺(tái)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序獲得198.83 Gb 的Clean Data，白羽、麻羽、黑羽靜原雞的Reads數(shù)分別為3 731 394、4 100 199和3 674 557。 Q30達(dá)到93%以上，Q20達(dá)到97%以上，GC含量達(dá)到39%以上(表1)。總體而言，測(cè)序數(shù)據(jù)顯示出很高的PHRED質(zhì)量。

表1 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table for evaluation of sample sequencing data

2.2 群體遺傳多樣性分析

靜原雞白羽、麻羽群體內(nèi)鑒定到的SNPs依次為238 533和233 562個(gè)，黑羽的SNPs數(shù)最多為240 820個(gè)。 3種羽色的靜原雞、和分別在0.273 2～0.278 2、0.304 9～0.309 6和0.096 1～0.109 8之間(表2)。LD衰減分析表明，不同類(lèi)群LD系數(shù)的衰減率差異較小。3個(gè)類(lèi)群SNPs距離在0～50 kb范圍內(nèi)衰減較快，衰減系數(shù)從0.5降至0.1以下。SNP距離在50～300 kb范圍LD水平較低，當(dāng)LD系數(shù)r=0.1時(shí)，各類(lèi)群對(duì)應(yīng)的LD衰減距離基本相等(圖1)。

圖中橫坐標(biāo)表示連鎖不平衡發(fā)生的距離，縱坐標(biāo)是連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)The abscissa in the figure represents the distance of linkage disequilibrium, and the ordinate is the correlation coefficient of linkage disequilibrium圖1 LD隨距離增長(zhǎng)的衰減圖Fig.1 LD decay with distance

表2 靜原雞3種羽色遺傳參數(shù)的比較Table 2 Comparison of genetic parameters of 3 feather colors of Jingyuan chicken

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

主成分分析的結(jié)果中PC1和PC2這兩個(gè)特征向量分別可以解釋8.98%和4.41%的遺傳變異，結(jié)果表明除了麻羽靜原雞144號(hào)和黑羽靜原雞180號(hào)兩個(gè)個(gè)體以外，靜原雞其他個(gè)體形成了白羽、麻羽和黑羽3個(gè)互不重疊的類(lèi)群，且類(lèi)群之間分型明顯(圖2)。本研究利用極大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示相同羽色的靜原雞親緣關(guān)系較近，不同羽色的靜原雞之間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，該結(jié)果與PCA結(jié)果一致(圖3)。本研究利用admixture軟件分析不同遺傳物質(zhì)在每個(gè)個(gè)體中的比例，在對(duì)每個(gè)K值進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析時(shí)，進(jìn)行了交叉驗(yàn)證，K=3的交叉驗(yàn)證最適合于靜原雞的真實(shí)分化史(圖4A)。結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，白羽與其他羽色分離，表明該類(lèi)群與麻羽和黑羽系統(tǒng)發(fā)育上存在相對(duì)較遠(yuǎn)的距離。當(dāng)K=3時(shí)，180個(gè)個(gè)體根據(jù)羽色分成了3個(gè)類(lèi)群，與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。當(dāng)K=4時(shí)，白羽的祖先背景較為純正，具有主要的遺傳祖先。雖然黑羽和麻羽有多個(gè)遺傳祖先，但一個(gè)主要的遺傳祖先是顯而易見(jiàn)的(圖4B)。

圖中PC1為主成分1，PC2為主成分2。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，每組樣品用不同顏色表示PC1 is the principal component 1, PC2 is the principal component 2. Each point in the figure represents a sample, and each group of samples is represented by each color圖2 PCA分析Fig.2 PCA analysis

樹(shù)形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直觀展示了不同種類(lèi)之間的進(jìn)化關(guān)系，親緣關(guān)系較近物種的進(jìn)化分枝往往聚成一簇The tree-shaped topological structure intuitively shows the evolutionary relationship between different species, and the evolutionary branches of species with close kinship are often clustered together圖3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree

A.CV-error圖: 橫坐標(biāo)表示不同的K值，縱坐標(biāo)表示不同的K值所對(duì)應(yīng)的CV-error值。B.群體遺傳結(jié)構(gòu)圖：橫坐標(biāo)是每個(gè)樣品的結(jié)構(gòu)，其中每一列表示一個(gè)個(gè)體，其中不同顏色片段的長(zhǎng)度表示該個(gè)體基因組中某個(gè)祖先所占的比例。圖片上側(cè)K=2～4表示假定的祖先群體個(gè)數(shù)從2一直到4，K值是樣本所包含的亞群或者祖先數(shù)A. CV-error plot: The horizontal coordinates indicate different K values, and the vertical coordinates indicate the CV-error values corresponding to different K values. B. Genetic structure of the population: The abscissa is the structure of each sample, where each column represents an individual, and the length of the different color fragments represents the proportion of an ancestor in the individual’s genome. On the upper side of the picture, K=2 to 4 means that the number of assumed ancestor groups ranges from 2 to 4, and the K value is the number of subgroups or ancestors contained in the sample圖4 群體結(jié)構(gòu)分析圖Fig.4 population structure analysis diagram

2.4 選擇性清除分析

通過(guò)結(jié)合π和來(lái)選擇前5%的區(qū)域。以靜原雞白羽為試驗(yàn)組，黑羽為正向選擇組，共獲得819個(gè)正向選擇區(qū)域(圖5A)。以白羽為試驗(yàn)組，麻羽為正向選擇組，共獲得正向選擇區(qū)域730個(gè)(圖5B)。以黑羽為對(duì)照組，麻羽為正向選擇組，檢測(cè)到719個(gè)正向選擇區(qū)域(圖5C)。對(duì)篩選區(qū)域進(jìn)行基因注釋之后利用KOBAS對(duì)檢測(cè)的候選基因進(jìn)行KEGG富集分析，KEGG富集結(jié)果表明候選基因顯著富集到37條通路(<0.05)，其中與羽色相關(guān)的通路中富集最顯著的是黑色素生成途徑，此外還有酪氨酸代謝和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)等(圖6)。在這些通路上最終篩選出11個(gè)與靜原雞羽色相關(guān)的候選基因(表3)。

A.白羽vs.黑羽的選擇性清除分析；B.白羽vs.麻羽的選擇性清除分析；C.黑羽vs.麻羽的選擇性清除分析。橫坐標(biāo)為π的比值和縱坐標(biāo)為Fst值分別對(duì)應(yīng)上面的頻率分布圖和右側(cè)的頻率分布圖，中部的點(diǎn)圖則代表不同窗口內(nèi)的相應(yīng)的Fst和π比值。其中最上方藍(lán)色和紅色區(qū)域?yàn)棣羞x擇出來(lái)的top 5%區(qū)域，綠色區(qū)域?yàn)镕st所選擇top 5%區(qū)域，中間藍(lán)色和紅色區(qū)域?yàn)镕st和π的交集，即為候選的位點(diǎn)A. Selective sweep analysis of white feathers vs. black feathers; B. Selective sweep analysis of white feathers vs. hemp feathers; C. Selective sweep analysis of black feathers vs. hemp feathers. The frequency distribution diagram above and the frequency distribution diagram on the right correspond to the π ratio on the abscissa and Fst value on the ordinate, respectively, the dot diagram in the middle represent the corresponding Fst and π ratios in different windows. The top blue and red areas are the top 5% area selected by π, the green areas are the top 5% area selected by Fst, and the middle blue and red areas are the intersection of Fst and π, which is the candidate sites圖5 選擇性清除分析Fig.5 Selective sweep analysis

表3 選擇性清除分析的選擇區(qū)域及候選基因Table 3 Selection regions and candidate genes for selective sweep analysis

圖6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)對(duì)靜原雞羽色進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)，白羽性狀關(guān)聯(lián)到66個(gè)顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)(<1.48×10)，分布在1、4、8、15號(hào)4條染色體上(圖7A)，臨近或坐落于、、2等30個(gè)基因，單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異(R)范圍為3.16%～9.18%，前10個(gè)基因見(jiàn)表4；麻羽性狀鑒定到259個(gè)顯著相關(guān)SNPs位點(diǎn)(<1.48×10)，這些位點(diǎn)主要分布在1～9號(hào)染色體上(圖7C)，臨近或坐落于2、135、3等116個(gè)基因，單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異(R)為6.73%～19.53%，前10個(gè)基因見(jiàn)表5，黑羽性狀關(guān)聯(lián)到200個(gè)顯著相關(guān)的SNPs位點(diǎn)(<1.48×10)，與黑羽性狀相關(guān)的SNPs主要位于1～9號(hào)染色體上(圖7E)，臨近或坐落于4、4、135等114個(gè)基因，單個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)解釋的表型變異(R)為5.85%～14.85%，前10個(gè)基因見(jiàn)表6。QQ圖是關(guān)聯(lián)分析結(jié)果重要的質(zhì)控圖，λ能夠判斷群體是否分層，λ在1.05以上說(shuō)明群體存在分層，本研究的λ值均小于1.05說(shuō)明個(gè)體均勻分布，不存在群體分層現(xiàn)象(圖7B、7D、7F)。通過(guò)文獻(xiàn)查閱和KOBAS對(duì)關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行KEGG富集分析(圖8)，在白羽和麻羽靜原雞中分別篩選出2個(gè)(、)與羽色相關(guān)的基因，在黑羽靜原雞中篩選出兩個(gè)基因(6、2)與羽色相關(guān)，這些基因主要在黑色素合成和酪氨酸代謝中發(fā)揮重要的調(diào)控作用(表7)。

A.白羽的曼哈頓圖； C.麻羽的曼哈頓圖； E.黑羽的曼哈頓圖，橫坐標(biāo)為染色體。縱坐標(biāo)-lgP，P值越小關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)，表現(xiàn)為縱坐標(biāo)越大，紅線(xiàn)表示0.05/全部SNPs的閾值，藍(lán)線(xiàn)表示1/全部SNPs的閾值。B.白羽的QQ圖；D.麻羽的QQ圖；F.黑羽的QQ圖。QQ圖的縱坐標(biāo)是SNP位點(diǎn)的P-value值(這是實(shí)際得到的結(jié)果)，與曼哈頓圖一樣也是表示為-lg(P-value)；橫軸是則是均勻分布的概率值(這是期望的結(jié)果)，同樣也是換算為-lg(P-value)A. Manhattan figure of white feathers; C. Manhattan figure of hemp feathers; E. Manhattan figure of black feathers. The horizontal coordinate is chromosomes, the vertical coordinate is -lgP, the smaller the P value, the stronger the association, which is expressed as a larger vertical coordinate, the red line indicates the threshold of 0.05/all SNPs and the blue line indicates the threshold of 1/all SNPs. B. White feather’s QQ picture; D. Hemp feather’s QQ picture; F. Black feather’s QQ picture. The vertical coordinate of the QQ plot is the P-value of the SNP loci (this is the actual result obtained), which is also expressed as -lg(P-value) as in the Manhattan plot; the horizontal axis is the probability value of the uniform distribution (this is the expected result), which is also converted to -lg (P-value)圖7 靜原雞羽色性狀的曼哈頓圖和QQ圖Fig.7 Manhattan and QQ maps of feather color traits of Jingyuan chicken

A. 白羽相關(guān)基因的KEGG通路富集分析；B. 麻羽相關(guān)基因的KEGG通路富集分析；C.黑羽相關(guān)基因的KEGG通路富集分析。x軸表示富集度，y軸表示通路名稱(chēng)，氣泡大小表示富集到通路中的基因數(shù)量，顏色表示富集到該通路富集顯著性A. KEGG pathway enrichment analysis of genes related to white feathers; B. KEGG pathway enrichment analysis of genes related to hemp feathers; C. KEGG pathway enrichment analysis of genes related to black feathers. x-axis indicates the degree of enrichment, the y-axis indicates the pathway names, bubble size indicates the number of genes enriched to the pathway, and color indicates the enrichment significance enriched to pathway圖8 KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis

表4 白羽關(guān)聯(lián)顯著SNPs統(tǒng)計(jì)信息表Table 4 Statistical information table of significant SNPs associated with white feathers

表5 麻羽關(guān)聯(lián)顯著SNPs統(tǒng)計(jì)信息表Table 5 Statistical information table of significant SNPs associated with hemp feathers

表6 黑羽關(guān)聯(lián)顯著SNPs統(tǒng)計(jì)信息表Table 6 Statistical information table of significant SNPs associated with black feathers

表7 GWAS篩選的候選基因Table 7 Candidate genes screened by GWAS

3 討 論

3.1 靜原雞遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)多樣性

隨著生產(chǎn)技術(shù)及生產(chǎn)力的發(fā)展，畜禽經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇、遺傳漂變和人工選擇，其遺傳多樣性隨之發(fā)生改變。靜原雞作為國(guó)家級(jí)地方保護(hù)資源，其遺傳多樣性同樣受到了嚴(yán)重威脅。2013年，固原市彭陽(yáng)縣建立了靜原雞原種保種場(chǎng)，對(duì)靜原雞進(jìn)行系統(tǒng)保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，但是在這期間由于保種知識(shí)的欠缺，導(dǎo)致系譜數(shù)據(jù)的大量缺失和錯(cuò)誤，因此本研究通過(guò)分子保種技術(shù)保護(hù)靜原雞群體的遺傳多樣性并持續(xù)監(jiān)測(cè)保種群的狀態(tài)，評(píng)估和制定有效的保種技術(shù)手段，對(duì)靜原雞以及我國(guó)地方雞種的保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。是反映等位基因頻率的一個(gè)指標(biāo)，其數(shù)值越接近，表明群體的分布越均勻。可以明確近交程度，對(duì)于選種選配防止近交衰退和品系繁育具有重要的指導(dǎo)意義。越高，說(shuō)明物種的多樣性越高。本研究利用RAD-seq在靜原雞共檢測(cè)出712 915個(gè)SNPs，3個(gè)類(lèi)群的、和分別在0.273 2～0.278 2、0.304 9～0.309 6和0.096 1～0.109 8之間，與韓威等所研究的19個(gè)地方雞種相比，靜原雞的和均高于19個(gè)地方雞種，低于瓢雞、河南斗雞、金湖烏鳳雞等8個(gè)地方雞種，由此表明靜原雞遺傳多樣性豐富，品系選育良好，資源活力好，開(kāi)發(fā)利用潛力較大。LD是評(píng)價(jià)遺傳多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，3個(gè)類(lèi)群LD系數(shù)的衰減率差異較小，說(shuō)明該群體沒(méi)有經(jīng)過(guò)較強(qiáng)的選擇，受選擇的強(qiáng)度低。主成分分析中除麻羽靜原雞144號(hào)和黑羽靜原雞180號(hào)兩個(gè)個(gè)體之外，其他個(gè)體根據(jù)羽色聚在一起，這與進(jìn)化樹(shù)和群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致，說(shuō)明靜原雞根據(jù)羽色分成了不同的類(lèi)群，這為靜原雞的分群保種提供了理論依據(jù)。

3.2 選擇性清除分析

物種的進(jìn)化離不開(kāi)選擇，在選擇的過(guò)程中，群體內(nèi)的有利突變發(fā)生后，這個(gè)突變基因的適合度越高，越容易被固定，與此基因座連鎖的染色體區(qū)域，由于搭車(chē)效應(yīng)也被固定下來(lái)，大片緊密連鎖的染色體區(qū)域因此失去多態(tài)性，這種由于搭車(chē)效應(yīng)引起多態(tài)性下降的現(xiàn)象，遺傳上稱(chēng)為選擇清除。通過(guò)選擇清除分析，可以鑒定出差異基因組區(qū)域，結(jié)合功能注釋進(jìn)一步預(yù)測(cè)表型相關(guān)的候選基因。本研究通過(guò)選擇性清除分別獲得819、730、719個(gè)選擇區(qū)域，這些區(qū)域內(nèi)篩選到與靜原雞羽色相關(guān)的候選基因共11個(gè)(4、16、、、、1、、1R、2A、、)。TYR是一種酪氨酸酶，它的表達(dá)缺乏將導(dǎo)致白羽球莖黑色素生物合成不足，是白羽形成的直接原因。李洪林鑒定出控制興義矮腳雞隱性白羽的主效基因?yàn)椤Ｔ谏丶?xì)胞的增殖和分化中起重要作用，包括黑素母細(xì)胞和黑素細(xì)胞，研究表明2在番鴨黑羽中的表達(dá)量高于白羽。FZD4是一種Wnt蛋白的受體，通過(guò)Wnt信號(hào)途徑調(diào)控黑色素生成。16是WNT信號(hào)通路中的重要基因，在神經(jīng)嵴來(lái)源的黑素細(xì)胞發(fā)育和遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。1或3表達(dá)缺陷的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞形成的喪失。具有內(nèi)在的GTPase活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中起重要作用，研究表明基因突變會(huì)造成黑色素細(xì)胞增生，從而導(dǎo)致黑色素瘤。是色素沉著的主要調(diào)節(jié)劑，是Wnt信號(hào)通路的靶標(biāo)，降低1的表達(dá)可能會(huì)下調(diào)的表達(dá)，最終減少黑色素的合成。在黑色素合成途徑中，前體多巴(3, 4-二羥基苯丙氨酸)和多巴胺由和合成。1R編碼一個(gè)七跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體，主要在發(fā)育中的羽毛和頭發(fā)的黑色素細(xì)胞中表達(dá)。Nam等研究發(fā)現(xiàn)，位置和表達(dá)水平的差異對(duì)韓國(guó)本土雞品種的羽毛色素沉著的影響比1R表達(dá)水平的變化更大。CAMK2A是鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶，研究表明，2是調(diào)控中國(guó)五指山黑豬毛色的候選基因。PRKCA和PRKCB是兩種蛋白激酶，PRKCA和PRKCB的激活是抑制黑色素合成的原因，研究已證實(shí)了的表達(dá)與小鼠皮膚色素沉著大致相關(guān)。綜上所述，調(diào)控靜原雞羽色的基因主要與黑色素合成相關(guān)。

3.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析是利用自然群體探測(cè)物種的遺傳變異，進(jìn)而分析復(fù)雜性狀遺傳結(jié)構(gòu)的有力工具，近年來(lái)已在雞、牛、豬、羊等物種中均有廣泛研究。本研究針對(duì)靜原雞的3種羽色性狀開(kāi)展全基因組關(guān)聯(lián)分析，初步鑒定到影響靜原雞群體白、麻、黑3種羽色性狀相關(guān)的致因突變位點(diǎn)和候選基因。其中鑒定到與白羽性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)7個(gè)，對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)富集在酪氨酸酶通路，該通路在合成黑色素和其他多酚化合物等色素時(shí)起重要作用，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，有2個(gè) 顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)189168614、189176762位于基因的第3內(nèi)含子上。該基因被選擇性清除和全基因組關(guān)聯(lián)分析同時(shí)篩選到，由此推測(cè)是控制靜原雞白羽的關(guān)鍵候選基因，具體調(diào)控過(guò)程還需進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，對(duì)黑羽顯著關(guān)聯(lián)水平SNPs分析發(fā)現(xiàn)919883和129265651位點(diǎn)與黑色素形成有關(guān)，這兩個(gè)位點(diǎn)分別位于2基因的第2內(nèi)含子和6的第2內(nèi)含子上，2是一種磷酸肌醇磷脂酶，6是一種Wnt蛋白的受體。Zhang等通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析了2基因在各種癌癥系中的mRNA表達(dá)情況，同時(shí)結(jié)合其他生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)2是影響黑色素瘤增殖和凋亡的關(guān)鍵因素。Korstanje等基于生物信息學(xué)分析確定了兩個(gè)導(dǎo)致色素沉著缺陷的寡聚體復(fù)合物6和5R，研究發(fā)現(xiàn)6敲除將導(dǎo)致色素沉著障礙，由此得出6能夠間接影響色素沉著。但有關(guān)2和6對(duì)羽色的調(diào)控研究尚未見(jiàn)報(bào)道。除此之外與麻羽性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有178個(gè)，其中與羽色相關(guān)的只有13923834位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于的9號(hào)內(nèi)含子上，TH是酪氨酸3-羥化酶，F(xiàn)ernstrom等研究表明，在TH酶的催化下，能生成DOPA，而DOPA 是黑色素形成的關(guān)鍵物質(zhì)。由此說(shuō)明可能是調(diào)控羽色的基因。綜上所述，靜原雞3種羽色形成的分子機(jī)制不同，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，以現(xiàn)有的資源群體并不能準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)到所有致因突變和潛在候選基因，在后續(xù)研究中將擴(kuò)大資源群體規(guī)模、優(yōu)化模型和方法，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)突變位點(diǎn)進(jìn)行挖掘和驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究利用RAD-seq技術(shù)對(duì)白羽、麻羽和黑羽靜原雞群體進(jìn)行了全基因組范圍內(nèi)的遺傳變異檢測(cè)，基于鑒定到的SNPs計(jì)算群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了靜原雞群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，通過(guò)選擇性清除和全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定了與羽色相關(guān)的4、16、、、、1、、1R、2A、、基因。綜上所述，本研究結(jié)果將對(duì)靜原雞這一地方種質(zhì)資源群體的保護(hù)奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為靜原雞不同羽色的品系化培育提供新的遺傳標(biāo)記和基因靶點(diǎn)。