北京黑豬DKK3和CCR1基因多態性檢測及其與背膘厚的關聯分析

田威龍，蘭干球， 張龍超， 王立賢， 梁 晶*， 劉 欣*

(1.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

自約9 000年前被馴化以來，豬在人類生存中發揮了重要作用。豬作為一種農業動物，是人類主要的肉類蛋白來源。事實上，截至2018年，豬肉已經成為世界上消費最多的肉類。然而，豬不僅被用作食用肉類，由于它們在解剖學、生理學和遺傳學上與人類相似，并且脂肪沉積水平很高，因此豬是用于研究人類肥胖和能量代謝的合適模型。此外，脂肪沉積是一項重要的經濟性狀，它與胴體質量、肉質和消費者的適口性相關，而背膘厚是脂肪沉積的一個重要指標。因此，豬的背膘厚性狀一直是研究的熱點。Yang等對1 200頭約克夏和長白豬的345 570個核苷酸多態性(SNPs)進行了單標記回歸分析，以確定與背膘厚相關的SNPs，結果發現SSC12:46226580、SSC6:149876737和SSC8:54567459等13個顯著的SNPs與背膘厚有關。Gozalo-Marcilla等通過對8個具有不同遺傳背景的豬進行全基因組關聯分析，結果發現4R、23和等27個基因組區域的264個SNPs與背膘厚有顯著關聯。這些研究說明了廣大研究者正致力于尋找可靠的SNPs用來提高背膘厚的選擇效率，提高經濟效益，然而目前對于背膘厚的研究多集中于大白、長白等商品豬種，缺乏對地方優質品種的研究。

隨著SNPs基因分型陣列、基因表達分析和其他高通量基因分型技術的出現，越來越多的與背膘厚度相關的候選基因被報道。趨化因子受體1(1)屬于G-蛋白偶聯受體家族成員，可被穩態或炎癥趨化因子選擇性激活，在多種免疫細胞中表達，如：中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、T細胞和NK細胞。趨化因子通過與靶細胞膜上G-蛋白偶聯受體(GPCR)超家族的特定趨化因子受體結合來發揮其生物學活性。研究表明，CCR1及其配體在機體呼吸道系統、免疫系統、生殖系統和生長發育中均發揮著重要作用。Kogelman等研究發現，1基因在肥胖豬過度表達。DKK3是一種多功能蛋白，通過 Wnt/β-catenin 途徑參與各種細胞過程，如細胞分化、增殖和凋亡，并導致多種疾病，包括癌癥和慢性心力衰竭等。Wnt/β-catenin通路相關基因在脂肪分化和發育過程中表達。因此，3基因可能通過這一途徑在脂肪中發揮不同的作用。本課題組在先前的研究中已經發現了1和3可作為背膘厚的候選基因。

在養豬業中，通常測量背膘厚度以指示豬的生產和生長性能。因此，了解控制北京黑豬背膘厚的遺傳決定因素對于改善肉品質、提高育種效率和獲得遺傳進展具有重要意義。本試驗以413頭北京黑豬為試驗對象，將3和1基因作為影響背膘厚的候選基因，利用PCR直接測序技術篩選3和1基因上的SNPs，將篩選的SNPs與背膘厚狀進行關聯分析，篩選出對北京黑豬背膘厚有重要作用的SNPs位點，以期為北京黑豬肉用生產性能的改良和選育奠定基礎，為分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

本研究使用的北京黑豬均來自北京黑六牧業科技有限公司，為2020年8月至2020年11月屠宰測定的共413頭北京黑豬，所有的黑豬健康狀況良好、體重相近、飼養管理統一。采集豬的耳組織，置于2 mL 凍存管中，并迅速置于液氮中速凍，后置于-80 ℃ 冰箱冷凍保存。

1.2 性狀測定

用電子游標卡尺準確測量右側胴體六七肋處背膘厚和腰薦處背膘厚，并記錄。

1.3 引物設計

根據NCBI數據庫中豬的3基因序列(登錄號：NM_001039749.1)，利用Premier 5.0設計8對 引物，覆蓋3基因的全部外顯子區域。CCl基因序列(登錄號：NM_001001621.1)，針對1基因的全部外顯子區域，共設計5對引物。引物由上海生工生物股份有限公司合成。設計引物見表1。

1.4 DNA提取及PCR擴增

取約10 mg背最長肌，置于2 mL研磨管中，后放入冷凍研磨機中進行研磨。使用天根生化有限公司生產的細胞/組織/血液DNA提取試劑盒提取總DNA，利用分光光度計(美國，Thermo Fisher)和1%瓊脂糖檢測合格后，以此為模板進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃終延伸2 min。

表1 DKK3和CCR1基因擴增引物Table 1 Amplification primers of DKK3 and CCR1 genes

1.5 SNPs多態性檢驗及統計分析

取符合要求的PCR產物送上海生工生物股份有限公司進行測序。對測序結果用DNAMAN和Chromas軟件進行核苷酸序列和波峰圖對比分析，尋找突變位點。使用Excel計算等位基因頻率和基因型頻率。運用SAS 9.2統計軟件中的Duncan’s多重檢驗分析不同位點各基因型對北京黑豬背膘厚的影響，結果用“平均值±標準差”表示，用<0.05作為差異顯著性判斷標準。利用Hapioview4.1軟件對篩選出的3基因SNPs位點進行連鎖不平衡分析。

2 結 果

2.1 北京黑豬背膘厚表型統計

本研究共測定了413頭北京黑豬的背膘厚性狀(表2)。六七肋背膘厚的最大值為5.258 cm，最小值為2.735 cm，平均值為3.067 cm，標準差為0.619 cm；腰薦背膘厚的最大值為4.842 cm，最小值為2.437 cm，平均值為2.743 cm，標準差為0.695 cm。

表2 北京黑豬背膘厚表型統計Table 2 Phenotypic statistics of backfat thickness in Beijing black pigs

2.2 DKK3和CCR1基因多態性分析

3基因外顯子區域檢測到10個SNPs位點，分別為g.47385307 G>T、g.47399612 A>G、g.47443779 T>C、g.47443783 C>T、g.47443858 C>T、g.47443903 A>G、g.47444258 C>T、g.47444275 C>T、 g.47444912 G>T和g.47445304 T>C，其中g.47385307 G>T為可變剪切突變，g.47399612 A>G 為錯義突變，其余均為3′UTR突變。由表3可知，北京黑豬3基因g.47385307 G>T和g.47444912 G>T突變位點GG基因型為優勢基因型(0.674和0.884)，G為優勢等位基因，g.47399612 A>G和g.47443903 A>G突變位點AA基因型為優勢基因型(0.538和0.786)，A為優勢等位基因，g.47443779 T>C突變位點TT基因型為優勢基因型(0.509)，T為優勢等位基因，g.47445304 T>C突變位點TC基因型為優勢基因型(0.382)，C為優勢等位基因，其余的突變位點，CC基因型為優勢基因型，C均為優勢等位基因。

表3 DKK3基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 3 The genotype and allele frequencies of polymorphism sites of DKK3 gene

1基因外顯子區域檢測到3個SNPs位點，分別為g.29229037 G>A、g.29229315 T>C和g.29229694 C>T， 其中c g.29229037 G>A和g.29229694 C>T 為同義突變，g.29229315 T>C為錯義突變。由表4可知，北京黑豬1基因g.29229037 G>A 突變位點GA基因型為優勢基因型(0.363)，G為優勢等位基因，g.29229315 T>C突變位點TC基因型為優勢基因型(0.393)，T為優勢等位基因，g.29229694 C>T突變位點CC基因型為優勢基因型(0.506)，C為優勢等位基因。

表4 CCR1基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 4 The genotype and allele frequencies of polymorphism sites of CCR1 gene

2.3 基因多態性與背膘厚性狀的關聯分析

利用SAS軟件對北京黑豬1和3基因突變位點與六七肋背膘厚和腰薦部背膘厚進行差異顯著性檢驗，由表5可知，有4個3′UTR突變位點均與腰薦部背膘厚顯著關聯(<0.05)，分別為g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、g.47444912 G>T和g.47445304 T>C，其余位點與六七肋背膘厚和腰薦部背膘厚均不顯著關聯(>0.05)，其中g.47443779 T>C位點TT基因型個體的腰薦背膘厚顯著高于CC基因型個體(<0.05)，g.47444258 C>T位點CC和CT基因型個體的腰薦背膘厚顯著高于TT基因型個體(<0.05)，g.47444912 G>T位點的TT基因型個體腰薦背膘厚顯著高于GT基因型個體(<0.05)，g.47445304 T>C位點CC基因型個體的腰薦背膘厚顯著高于TT基因型個體(<0.05)。由表6可知，1基因只有1個突變位點基因型與六七肋背膘厚顯著相關(<0.05)， g.29229037 G>A位點GG基因型個體的六七肋背膘厚顯著高于AA基因型個體(<0.05)。

表5 北京黑豬DKK3基因10個SNPs與背膘厚的關聯分析Table 5 Association analysis of 10 SNPs in DKK3 gene and backfat thickness in Beijing black pigs

表6 北京黑豬CCR1基因3個SNPs與背膘厚的關聯分析Table 6 Association analysis of 3 SNPs in CCR1 gene and backfat thickness in Beijing black pigs

2.4 連鎖不平衡分析

對3的10個SNPs進行連鎖不平衡分析，分析結果顯示(圖1)，共形成了2處連鎖不平衡模塊，分別是g.47443779 T>C、g.47443783 C>T和g.47443858 C>T形成了第一個模塊，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T形成了第二個模塊。其中g.47443779 T>C和g.47443783 C>T處于完全連鎖狀態(D’=1), g.47443783 C>T和g.47443858 C>T處于完全連鎖狀態(D’=1)，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T呈現高度連鎖狀態(D’=0.98)。由表7和表8可知，block1形成4種單倍型，block2形成3種單倍型。

表7 DKK3基因block1單倍型及其頻率Table 7 The haplotypes and their frequencies of DKK3 gene block1

表8 DKK3基因block2單倍型及其頻率Table 8 The haplotypes and their frequencies of DKK3 gene block2

圖1 北京黑豬DKK3基因SNPs的連鎖不平衡Fig.1 The linkage disequilibrium analysis of SNPs in DKK3 gene in Beijing black pigs

3 討 論

作為家豬的重要經濟性狀，背膘厚在豬遺傳學中得到了廣泛的研究。高背膘厚不僅導致飼料效率低下，而且也不受消費者的青睞。在滿足消費者需求的同時，生豬養殖的目標是在不影響豬肉口感的前提下，降低胴體脂肪，提高瘦肉率。目前的研究多集中于杜洛克、大白豬和約克夏豬等商品豬背膘厚。北京黑豬作為中國培育的優良品種之一，毛黑色，中等體型和生長速度快，肉色鮮紅，大理石紋評分高，被認為是高端豬肉之一。然而對影響北京黑豬背膘厚相關SNPs的研究卻鮮見報道。本研究以3和1基因為影響北京黑豬背膘厚的候選基因，探究其基因多態性對北京黑豬背膘厚性狀的影響，以期能夠篩選出可用于提高北京黑豬背膘厚性狀的分子標記。

背膘厚度是家豬脂肪沉積的典型數量性狀，顯示出中等至高度的遺傳性。本研究利用SAS軟件對檢測到的突變位點的不同基因型分別與北京黑豬的背膘厚進行關聯分析，希望為北京黑豬背膘厚研究提供更多的SNPs標記。在1外顯子檢測到3個SNPs，其中2個為同義突變(g.29229037 G>A和g.29229694 C>T)，1個為錯義突變(g.29229315 T>C)。關聯分析發現，g.29229037 G>A GG基因型個體的六七肋背膘厚顯著高于AA基因型個體(<0.05)。 目前對于1突變位點的研究發現其多與疾病有關。Toyoda等發現,1基因rs3181077位點與發作性睡病有關。此外，位于人類1基因3′-側翼區域的SNPs與Beh?et綜合征密切相關，Beh?et綜合征被認為是一種以眼/皮膚炎癥、復發性口腔潰瘍和生殖器潰瘍為特征的自身免疫性疾病。已有報道1基因是人體脂肪組織中甘油三酯調控的關鍵候選基因。本研究在北京黑豬群體中發現1基因g.29229037 G>A突變與六七肋背膘厚顯著相關。

在北京黑豬3基因的外顯子區共檢測到10個SNPs，其中有4個突變位點(g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、 g.47444912 G>T和g.47445304 T>C)基因型與腰薦背膘厚顯著相關(<0.05)。3與Wnt/B-catenin信號通路相關，Wnt/B-catenin 信號通路相關基因在脂肪分化發育過程中表達。該信號通路可阻斷脂肪分化關鍵轉錄因子(C/EBPα和PPARγ)的表達，從而影響脂肪分化。因此，3基因可能通過這一途徑在脂肪中發揮不同的作用。這4個位點突變均為3′UTR 突變，說明3′UTR突變對于豬背膘厚性狀具有重要影響。Zang等在豬2基因中發現其3′UTR 的多態位點與豬背膘厚和瘦肉率顯著相關。研究表明，3′UTR包含miRNA的靶點。miRNA是短的內源性RNA，通過與3′UTR中的位點配對來調節靶基因的蛋白質表達，從而發揮重要的基因調控作用。miRNA已被證明在廣泛的生物過程中發揮調節作用，例如發病機制、組織發育、脂肪細胞分化和脂肪生成等過程。第一個報道的miRNA對脂質代謝的影響是在果蠅中，其中miR-14的缺失導致甘油三酯和甘油二酯的積累增加。所以miRNA可能通過調控3基因3′UTR 進而影響脂質代謝，本課題組先前的研究發現miR-3477-5p 可以通過調節靶基因3進而影響脂肪生成。下一步可以進行3基因4個3′UTR突變的靶向miRNA研究。

相對于單個SNPs對表型的影響，一組具有連鎖效應的SNPs所形成單倍型的作用更大。因此本研究對3的10個SNPs進行連鎖不平衡分析，分析結果顯示g.47443779 T>C-g.47443783 C>T處于完全連鎖狀態(D’=1)，g.47443783 C>T-g.47443858 C>T處于完全連鎖狀態(D’=1)，g.47444258 C>T和g.47444275 C>T呈現高度連鎖狀態(D’=0.98)。所以雖然g.47443783 C>T與g.47444275 C>T位點不同基因型與背膘厚關聯時無顯著差異，但是可以認為其是影響背膘厚的潛在SNPs。

4 結 論

本試驗檢測北京黑豬群體中1和3基因的SNPs位點，并分析了這些SNPs位點與背膘厚性狀的相關性。北京黑豬3基因的g.47443779 T>C、g.47444258 C>T、g.47444912 G>T和g.47445304 T>C位點與北京黑豬的腰薦背膘厚顯著相關；1基因的g.29229037 G>A位點與北京黑豬的六七肋背膘厚顯著相關。本研究為1和3基因作為北京黑豬背膘厚性狀的候選基因應用于豬遺傳育種提供了參考。