非洲豬瘟病毒免疫逃逸分子機制研究進展

趙旭陽，靳家鑫，路聞龍，張 帥，黃 麗，張改平，孫愛軍*，莊國慶*

(1. 河南農業大學動物醫學院，國家動物免疫學國際聯合研究中心，鄭州 450046；2. 中國農業科學院 哈爾濱獸醫研究所，獸醫生物技術國家重點實驗室，哈爾濱 150069)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬引起的一種出血性傳染病，對我國生豬養殖業造成重大威脅，迄今尚無安全有效的商品化疫苗面市。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科()、非洲豬瘟病毒屬()，也是已知僅有的蟲媒DNA病毒，其基因組為170～193 kb的雙鏈DNA，包含151～167個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，病毒粒子呈正二十面體對稱結構，直徑260 nm左右，由類核、核心殼、內膜、衣殼和外囊膜5層結構組成。

ASFV屬于一類具有相同遠古起源的核質大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs)。NCLDVs包括痘病毒科、虹彩病毒科、囊泡病毒科、疫霉病毒科、潘多拉病毒科和馬賽病毒科等，多數成員的基因組大小為100～400 kb，主要在被感染真核生物胞質中名為“病毒工廠”的特定區域進行復制。除了結構上的一些共同和獨特的特征，在NCLDVs的感染復制周期也存在一些轉錄共性，但這種共性是否影響病毒的生物特性有待于進一步解析。在長期協同進化過程中，大多數NCLDVs表現出針對宿主機體免疫防御的適應性，可通過編碼相關蛋白抑制宿主細胞凋亡并調節免疫反應，形成復雜的免疫逃逸機制。例如：虹彩病毒和ASFV(224)均可獨立表達抑制細胞凋亡的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apotosis proteins, IAPs)，與宿主的抗凋亡蛋白Bcl-2協同調節細胞凋亡；痘病毒和ASFV(238)等可表達抑制宿主細胞NF-κB轉錄因子活化的蛋白，通過調控NF-κB通路影響多種免疫相關分子的功能發揮。

ASFV可編碼超過150種蛋白，其中24%為結構蛋白，19%與病毒轉錄相關，6%參與維持病毒基因組完整，4%與病毒入侵相關，3%與病毒的免疫逃逸相關，還有34%功能未知。目前，已證實與免疫逃逸相關的病毒蛋白有DP71L、A238L、MGF360、MGF 530/505、I329L、A224L、A179L、EP153R、p54、CD2v、L83L等，參與抑制Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)反應、調節炎癥反應、調節細胞凋亡和細胞自噬等信號通路并影響獲得性細胞免疫。本文總結了ASFV免疫逃逸相關機制的國內外研究進展，并探討其在ASF疫苗研發中的潛在價值，期望為ASF疫苗研發和綜合防控提供一定理論支持。

1 ASFV的入侵與復制

ASFV感染周期始于病毒吸附并侵入宿主細胞。體內感染過程中，ASFV經口-鼻傳播途徑或者皮膚傷口感染進入機體，在扁桃體和鼻黏膜附近淋巴結侵入單核巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)等抗原遞呈細胞(antigen presenting cells， APC)并增殖，隨后感染其他淋巴組織和器官，破壞機體的免疫系統。ASFV主要通過網格蛋白介導的受體依賴性內吞(clathrin-mediated receptor-dependent endocytosis)途徑侵入宿主細胞，也可經由巨胞飲(macropinocytosis)進入細胞，但與其特異性結合細胞受體尚不明確。ASFV侵入宿主細胞后，經過內體途徑逐漸脫去衣殼，暴露出的病毒內膜與晚期內體發生膜融合釋放出病毒核心，核心經微管轉運到核周微管組織中心(microtubule organizing centers，MTOC)區域開始早期基因表達和基因組的復制。隨著“病毒工廠”的形成，ASFV開始大量復制增殖，組裝好的子代病毒顆粒通過微管轉運至細胞膜附近，以“出芽”的方式釋放。

2 ASFV參與的免疫反應

天然免疫系統是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線，巨噬細胞通過Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)等一系列模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體和損傷相關分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，分泌細胞因子/趨化因子啟動免疫反應，也可通過吞噬作用將病原體攝入胞內，將處理后的抗原遞呈在細胞表面激活特異性免疫應答。ASFV通過網格蛋白介導的吞噬作用侵入巨噬細胞，經內體途徑脫去衣殼，并將含有遺傳物質的病毒核心釋放至胞質。這一過程中，PAMPs通過內質網應激引起自噬和凋亡通路激活，膜融合的過程也刺激了凋亡信號的生成；病毒基因組DNA迅速被細胞PRRs識別，進而引起干擾素和炎癥反應，但ASFV也能通過眾多結構和非結構蛋白調控cGAS-STING、TLRs、NF-κB、JAK-STAT等炎癥和干擾素相關信號通路，抑制IFN、白細胞介素(IL)等細胞因子的表達，增強自身致病性。另一方面，ASFV感染下調了MHC-Ⅱ類分子相關基因，抑制抗原加工和遞呈，同時調節CXCL10等趨化因子的表達大量招募T細胞、自然殺傷(natural killer，NK)細胞等經典單核細胞，但避免中性粒細胞等抗病毒細胞的募集，有利于自身傳播和復制。ASFV感染機體時體液免疫發揮的作用當前仍存在爭議，表達ASFV的抗原或者抗原混合物能夠刺激機體產生中和抗體，但不能形成完全的免疫保護力。ASFV免疫豬體中CD8淋巴細胞的缺失降低了對相關強毒株的保護性免疫，提示僅有ASFV特異性抗體不足以抵抗ASFV感染，CD8淋巴細胞在ASFV保護性免疫中也具有重要作用。對小鼠接種rNDV-P72，發現機體除了能產生較高濃度的P72特異性抗體外，T細胞也發生增殖并分泌細胞因子IFN-γ、IL-4。因此，體液免疫和細胞免疫在抗ASFV感染中均起一定作用。

3 ASFV免疫逃逸機制

作為一種基因組大、蛋白多樣、結構復雜的大型DNA病毒，ASFV在長期的進化過程中逐漸形成了一套極為復雜的免疫逃逸機制，可以通過不同的方式逃避機體的免疫應答。ASFV編碼超過150種蛋白，其中3%與病毒的免疫逃逸相關，多種蛋白能對宿主的免疫系統起到干擾作用，分別參與調控宿主細胞的IFN反應、細胞凋亡、炎癥反應和細胞自噬等，幫助病毒逃避免疫監視，在機體內增殖并引起疾病(圖1)。

圖1 ASFV通過編碼蛋白干擾宿主天然免疫反應Fig.1 ASFV proteins interference the host immune response

3.1 ASFV抑制干擾素反應

ASFV主要的靶細胞是巨噬細胞，其能夠通過TLRs等一系列PRRs識別PAMPs啟動免疫反應，激活IFN信號通路進而分泌細胞因子/趨化因子。IFN是一類細胞因子，能夠在感染和未感染的鄰近細胞中誘導抗病毒狀態，脊椎動物的抗病毒機制高度依賴于IFN的作用。IFN是宿主對病毒感染產生天然免疫反應的關鍵介質，誘導數百種可能具有直接抗病毒活性的ISGs表達，并通過激活未成熟DC增強NK細胞功能，促進T和B淋巴細胞的存活和效應功能來調節先天免疫和適應性免疫。DC進一步通過TLRs激活相關功能并完成抗原提呈，有效地將天然免疫與獲得性免疫聯系起來。研究表明，體外表達的豬IFN蛋白具有很高的抗ASFV活性，可以有效抑制ASFV的復制。

由于IFN介導的巨噬細胞激活對ASFV構成嚴重威脅，ASFV必須進化出對抗策略來對抗這種反應，從而導致調控IFN應答的ASFV基因不斷進化。ASFV基因組結構可分為中間的保守區和兩端的可變區，位于可變區的多基因家族(multi gene family，MGF)基因決定了ASFV基因的多樣性。早期研究發現，MGFs的主要功能為抑制機體IFN反應，其多個基因拷貝缺失后導致宿主細胞IFN表達水平隨之發生變化。MGF 360-9L是MGF 360家族成員之一，構建其重組真核表達質粒，轉染至PK-15細胞，證實該蛋白主要定位在核內，其抑制天然免疫信號轉導的功能可能發生在核內；而MGF360-15R(A276R)通過獨立于IRF7機制的TLR3和胞質途徑抑制IFN的誘導表達；MGF360-12L能阻斷核轉運蛋白與NF-κB之間的相互作用，干擾NF-κB的核易位從而顯著抑制IFN的產生；另外，MGF505-7R(A528R)靶向p65的激活與核易位來抑制TLR8介導的NF-κB活性，進而抑制干擾素和炎癥因子信號通路，并能通過抑制JAK1和JAK2信號通路促進病毒致病性；MGF505-11R通過與STING的相互作用負調節cGAS-STING信號通路，進而抑制Ⅰ型IFN的產生。基因缺失試驗表明，MGF360-505R敲除的ASFV通過抑制NF-κB信號通路減少IL-1β的轉錄，最終降低了細胞凋亡和病毒復制水平。這些研究表明，多種MGFs可能是ASFV的致病因子，通過調控炎癥和IFN信號通路促進免疫逃逸。

在ASFV感染宿主細胞過程中，cGAS-STING信號通路在調控IFN反應中發揮著重要作用。宿主細胞通過環型GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)感應ASFV基因組DNA，在ATP和GTP存在的情況下，催化形成環二核苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)，cGAMP與IFN刺激因子(stimulator of interferon，STING)在內質網結合并導致其構象變化，二聚化的STING轉移至高爾基體并招募TBK1形成磷酸激酶復合物，進一步促進 NF-κB與IRF3磷酸化和入核，啟動IFN和炎癥因子的轉錄。研究表明，ASFV China 2018/1株的編碼蛋白DP96R抑制了cGAS-STING-TBK1信號通路從而干擾TBK1誘導的Ⅰ型IFN抗病毒反應，但不影響IRF3-5D介導的IFN-β啟動子激活。另一方面，與ASFV弱致病性毒株NH/P68相比，高致病性毒株Armenia/07能夠顯著抑制cGAS-STING信號通路進而抑制IFN-β產生，這可能揭示cGAS-STING誘導Ⅰ型IFN表達與ASFV的毒力相關。另外的一些研究發現，ASFV編碼的I329L蛋白是TLR3的同源物，能在TRIF水平上抑制IFN的誘導，引起免疫逃逸；ASFV結構蛋白E120R在細胞內穿梭和釋放過程發揮重要作用，最新研究發現E120R能阻斷IRF3的活性，進而抑制IFN-β的產生。這些結果表明，ASFV的免疫抑制和免疫逃逸效果是多種策略共同調控的結果，深入研究ASFV調控IFN信號通路的方式和策略，對于揭示ASFV免疫逃逸分子機制有著重要意義。

3.2 ASFV調節炎癥反應

機體內多數炎癥反應的發生與NF-κB信號通路相關，白細胞介素等炎癥因子的轉錄被NF-κB轉錄因子激活。ASFV的A238L蛋白具有與NF-κB抑制劑類似的蛋白重復序列，被認為是I-κBα的同源物，并作為NF-κB依賴基因轉錄的抑制因子參與宿主炎癥反應調控。在ASFV感染早期，A238L蛋白穿梭于細胞質和細胞核，通過CBP/p300轉錄共激活因子途徑抑制TNF-α的產生和激活，阻斷炎癥相關信號通路；通過蛋白激酶C-θ介導的p300氨基末端反式激活域上調進一步抑制NFATc2、NF-κB和c-Jun的激活。另外，A238L還能夠抑制鈣調神經磷酸酶的活性，并抑制NFAT依賴途徑中的環氧合酶2基因轉錄，是十分有效的抗炎癥反應蛋白。

白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-18(IL-18) 是被激活的炎癥小體中產生的一類關鍵促炎細胞因子。活化的Caspase-1在兩個位點分別切割它們的蛋白前體(pro-IL-1β和pro-IL-18)使其轉化為相應的活性形式，進而激活APCs等天然免疫細胞。在高致病性ASFV Georgia 2007分離株感染早期瞬時表達的蛋白L83L可特異性地結合IL-1β而非IL-18或IL-1α，從而抑制相應的細胞因子介導抗病毒反應，這是ASFV免疫應逃避的一種有效機制。MGF505-7R與IKKα相互作用以抑制NF-κB 信號通路，并與NLRP3結合來抑制炎癥小體的形成，從而減少了IL-1β的產生。然而，即使ASFV通過多種途徑抑制炎癥反應，但是強毒株無論在體外和體內都會顯著誘導炎癥/趨化因子等細胞因子的分泌，這類細胞因子風暴導致了感染豬的急性發病和死亡。這表明ASFV對宿主炎癥反應的調控和自身毒力基因的表達可能不是協調一致的，其中的動態變化及相互關聯需要更多的研究來闡明。

3.3 ASFV調節細胞凋亡

細胞凋亡是一個主動的過程，在此過程中細胞經歷著自我毀滅，以響應各種各樣的刺激。在病毒感染早期主動誘導細胞死亡會嚴重限制病毒的產生，減少或消除子代病毒在宿主中的傳播。然而，許多動物病毒已經進化出逃避或延遲早期細胞凋亡的策略，利于產出子代病毒。ASFV侵入宿主細胞過程中的脫殼是觸發凋亡所必須的，病毒內膜與晚期內體膜融合過程引起的膜擾動可能啟動凋亡信號通路導致細胞死亡。在感染后期，ASFV則主動誘導凋亡以抑制炎癥信號的產生，進而阻止免疫反應對子代病毒的清除。

在ASFV感染的細胞中，DNA斷裂、caspase-3激活以及細胞色素C(cytochrome C，CytC)從線粒體釋放出來是誘導宿主細胞凋亡的特征。已有研究證明，ASFV感染通過內質網應激誘導caspase-9激活，與線粒體凋亡信號通路和caspase-12活性相關：內質網應激使得細胞內Ca濃度急劇升高，導致內質網伴侶鈣黏連蛋白和鈣網蛋白的激活，并增加線粒體外膜的通透性，造成CytC釋放。ASFV感染Vero細胞也會誘導DNA修復酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)的裂解，PARP是一種被caspase-3和caspase-7特異性裂解的核蛋白，說明這是ASFV誘導細胞凋亡的下一步活化途徑。

關于ASFV編碼蛋白調控宿主細胞凋亡的研究發現：ASFV編碼的EP153R蛋白一種非必需蛋白，在病毒生命周期的早期和晚期都有表達，可能通過p53途徑抑制細胞凋亡；IAP是細胞凋亡抑制劑家族成員，能夠保證宿主細胞的存活，ASFV編碼IAP同源蛋白A224L可特異性阻斷細胞凋亡。細胞的Bcl-2家族蛋白有促凋亡作用，ASFV編碼的A179L是 Bcl-2蛋白的同系物，可與Bcl-2家族蛋白結合從而發揮抑制細胞凋亡的作用，防止哺乳動物細胞程序性死亡。蛋白磷酸酶1激活劑DP71L是ASFV晚期表達的蛋白，可促進eIF2α的去磷酸化，從而抑制感染細胞的凋亡，促進病毒增殖。此外，ASFV的238基因編碼兩種形式的蛋白，一種是32 ku的蛋白，主要在感染的后期聚集在細胞核中；另一種是28 ku的蛋白，主要存在于細胞質中；A238L蛋白具有干擾NF-κB活化的功能，在ASFV感染的早期，其誘導低活性的NF-κB 抑制機體的免疫應答，而在AFSV感染晚期誘導高濃度的NF-κB引起宿主細胞凋亡，出現典型的膜起泡特征，導致大量包含子代病毒的囊泡形成。因此受調控的細胞凋亡也是病毒傳播子代的一個非常有效的機制，同時能夠限制感染引起的炎癥和免疫反應強度，在病毒免疫逃逸機制中十分重要。

3.4 ASFV調節自噬

自噬是某些細胞的組分發生的有序降解和再循環使用，是細胞自身的一種防御保護措施。細胞自噬可以清除DNA病毒等抗原物質，然而很多病毒進化出了相應的抵御策略，如HSV-1的ICP34.5通過靶向結合自噬蛋白Beclin-1來阻止自噬發生。ASFV編碼的A179L不但是一種Bcl-2同源蛋白，能與促凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用抑制細胞凋亡，它也是一種ICP34.5的同源物，可通過其BH3結構域與Beclin-1相互作用來抑制自噬。另外， ASFV編碼蛋白E199L能通過與宿主的一種還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductases，PYCR)相互作用，在Vero 和 HEK-293T 細胞中誘導完整的自噬過程。實際上，抑制自噬在多種病毒感染宿主模型中結果各不相同，大多數RNA病毒會誘導宿主細胞自噬，而且自噬可能會促進病毒的復制。ASFV可能通過至少兩種機制抑制自噬小體的形成：利用Ba71v毒株構建179敲除株(Ba71vΔ179)，感染細胞后檢測結果表明，179并不是抑制自噬小體的必須基因；ASFV的DP71L蛋白能抑制內質網應激反應，阻止PP1/蛋白磷酸酶1激活，雖然也與ICP34.5有一定的序列同源性，但該途徑與Beclin-1無關。因此，ASFV 感染、復制與自噬的復雜關系有待深入研究。

3.5 ASFV調節細胞免疫

巨噬細胞上MHC-I類和MHC-II類分子的表達會影響抗原遞呈和保護性T細胞免疫反應的發展。序列分析顯示，ASFV蛋白EP153R與CD94、CD69和Ly94A等宿主細胞蛋白同源，其存在一個C型動物凝集素樣結構域，具有結合MHC類分子的功能。進一步研究發現，EP153R抑制了MHC-I類抗原的表面表達，但并未影響MHC-I類抗原的合成、糖基化和降解。ASFV感染下調了巨噬細胞組織蛋白酶的表達，損害了抗原消化和處理能力，而SLA-DMA和SLA-DMB的抑制也阻礙了MHC-II類分子的成熟。因此，ASFV通過阻礙抗原遞呈延遲了T細胞的活化。另外，ASFV的402基因編碼的CD2v蛋白是宿主T細胞表面黏附受體CD2的類似物，在ASFV感染的后期表達，具有細胞黏附、增強病毒毒力和免疫反應調節的作用。當ASFV感染巨噬細胞時，抑制了其他細胞的增殖以及非感染淋巴細胞對促分裂原的反應，而當402基因缺失時，這種抑制效果被破壞。因此，CD2v不但參與病毒的細胞內轉運以及紅細胞吸附，還參與抑制淋巴細胞增殖，調節T細胞介導的細胞免疫反應。

4 小結與展望

ASFV侵入巨噬細胞后迅速脫去衣殼并將含有遺傳物質的病毒核心釋放至胞質，這一過程中，PAMPs激活各類PRRs引起干擾素、炎癥、自噬和凋亡等天然免疫信號通路激活，分泌細胞因子形成免疫應答。與此同時，ASFV通過眾多編碼蛋白調控宿主細胞的天然免疫信號通路，抑制抗病毒反應以促進自身的復制。ASFV還通過抑制抗原加工和遞呈、調控趨化因子表達等方式進一步影響宿主的淋巴細胞分化成熟，阻礙獲得性免疫的形成。

目前關于ASF疫苗已有大量研究，但對保護機制深入研究的報道罕見。Zhu等通過ASFV感染巨噬細胞的基因表達變化分析了ASFV致病和免疫逃逸的一些可能機制。Sun等通過p72蛋白T細胞表位的全景掃描初步開發ASF細胞免疫疫苗。因此，基于深度測序和轉錄組、蛋白質組的生物信息學分析研究將有助于解析ASFV免疫逃逸核心基因和關鍵抗原的信息，對于后續的免疫逃逸和疫苗研發工作至關重要。隨著對ASFV編碼蛋白及其參與免疫逃逸分子機制的逐漸了解，毒力基因缺失減毒疫苗的開發顯示出越發廣闊的前景；T細胞抗原表位的深入分析也為重組亞單位/活載體疫苗研究工作帶來曙光。針對ASFV免疫逃逸機制的研究將極大促進疫苗和治療藥物的研發。

ASF自20世紀初期發現以來，其發生和流行的范圍越來越廣，給世界養豬業帶來了巨大挑戰，至今仍無有效的商品化疫苗問世。我國是世界上最大的豬肉生產和消費國，在當前防疫形勢下，盡快開發有效疫苗進行預防控制是一項非常必要且重要的措施。然而， ASFV復雜的基因結構、多樣的蛋白表達以及強大的免疫逃逸能力，使得ASF疫苗的研制工作變得十分困難。本文對ASFV免疫逃逸相關機制最新研究進展，以及部分免疫逃逸相關蛋白的種類和功能作出概述，希望對深入研究ASFV免疫逃逸分子機制提供幫助，為ASF疫苗研發和疫病防控提供理論支持。