奶牛早孕診斷技術研究進展

魏士昊，戴天姝，王 鋒，史遠剛，馬 云，淡新剛

(寧夏大學農學院，銀川 750021)

奶牛繁殖管理的兩個重要步驟：一是在奶牛進入自愿等待期后進行繁殖；二是及早對奶牛進行早孕檢查。對奶牛配種后在第二次可能發情之前診斷是否妊娠，可以更早地做出管理決策，并減少奶牛的空懷期，從而縮短產犢間隔，以提高奶牛在利用年限內的繁殖效率，進而提高奶牛場經濟效益。因此，奶牛早孕診斷是十分必要和有意義的。如果對奶牛非妊娠的診斷不準確(即假陰性)，管理者為減少下一次配種的間隔時間而使用前列腺素(prostaglandin，PG)或其類似物來誘導同期發情或排卵，則會增加醫源性妊娠失敗率，由此造成的胚胎丟失會帶來巨大的經濟損失。由于只能對未懷孕的奶牛實施管理干預，所以通過早孕檢測準確識別未懷孕的奶牛以避免醫源性妊娠損失是至關重要的。此外，生產中對奶牛妊娠的不準確診斷(即假陽性率)，會使奶牛錯失再次授精機會，并增加后續配種的間隔時間，從而降低早孕檢測的有用性和成本效益。目前奶牛繁殖技術實踐中，早期妊娠診斷技術有待提高，亟待開發出新型、有效的奶牛早孕診斷技術。本文綜述了近年來奶牛早孕診斷技術的最新研究結果，以期為開發和應用切實可靠的奶牛早孕診斷新技術提供參考。

1 直腸診斷(palpation per rectum, PPR)

奶牛PPR技術最早出現在19世紀，是較古老的直接診斷奶牛妊娠的方法。奶牛PPR主要是配種后18 d由技術熟練的繁殖技術人員觸摸卵巢黃體進行初步妊娠篩選。在此基礎上，建立了“胎膜滑動”(fetal membrane slip，FMS)技術，在奶牛配種后29 d壓迫孕角讓胎膜囊在手指間滑動以感覺胎囊的存在。但有人認為，在妊娠早期經FMS進行早孕檢查會增加奶牛醫源性妊娠丟失的風險。然而，Romano等發現，用FMS技術在奶牛配種后34 d進行奶牛早孕診斷并不影響奶牛胚胎或胎兒存活率，并認為這是一種安全的技術。此外，Bond等對1 216頭奶牛配種后37 d進行隨機試驗，觀察到學生觸診組和獸醫對照組之間的妊娠丟失沒有差異，進一步證明該方法診斷奶牛早期妊娠的安全性。

PPR技術在國內外應用較為廣泛，此方法進行妊娠診斷也較安全，不需要儀器設備或實驗室操作，并且結果可立即做出判斷。然而，繁殖技術人員的技術熟練程度顯著影響了應用PPR技術檢測的特異性和可靠性，并且該技術很難在更早時間(配種后21 d)內進行準確的妊娠診斷。

2 彩色多普勒超聲(color Doppler ultrasonography, CDUS)診斷

CDUS技術已經在人類的妊娠檢查和疾病探查中廣泛應用，然而CDUS技術在動物上的應用相對滯后。黃體是血管化程度最高的器官之一，其功能與流向黃體的血流量密切相關。發育中牛黃體的血流由卵巢動脈直接分支的螺旋動脈供應；排卵后，來自內膜的血管侵入卵泡的腔內，形成一個網絡，供應黃體細胞；新生黃體血管可將黃體類固醇輸送到體循環中，并為低密度脂蛋白提供循環底物，而低密度脂蛋白則被黃體細胞用于孕酮(progesterone，P4)的生物合成。由此可知，黃體的血流面積(blood flow area，BFA)和血流速度與整個發情周期(包括黃體溶解期)中血漿P4濃度密切相關。

近些年，研究人員開展了CDUS技術在奶牛早孕診斷方面的應用研究。CDUS是根據多普勒效應原理，利用探頭探測配種后奶牛黃體血管大小、血流變化并經分析處理后以彩色圖像顯示出來，以此來進行實時、可視化判斷奶牛妊娠狀況。研究發現，不但在懷孕動物中檢測到流向黃體血液比未懷孕的多，而且客觀分析黃體血流與主觀分析值之間存在很強的相關性。進而人們對黃體血流在CDUS中所描繪的彩色圖像進行評分分級，分為1～4級， 2級(包括2級)以上確定為妊娠。另外，Lasheen等研究發現，使用CDUS技術的診斷結果與作為黃體功能指標的血漿P4濃度評估結果相似，并且使用此方法沒有假陰性。這些結果充分證明CDUS技術在奶牛妊娠診斷中的可行性和可靠性。

Honnens等研究奶牛妊娠前3周子宮血流的變化，發現懷孕的奶牛在受精后第2周就可以檢測到子宮血液供應的變化，但此時檢測的結果還不足以用來確定奶牛是否妊娠。Hassan等研究妊娠與非妊娠牛在受精后前3周的黃體大小(luteal size，LS)、P4濃度和黃體血流量(luteal blood flow，LBF)是否存在差異，結果表明，妊娠母牛在第7～21天的平均LBF均顯著高于未妊娠母牛，且LBF診斷結果相比LS和P4的診斷結果更為敏感。Kanazawa等通過測定奶牛LBF來預測胚胎移植后母牛妊娠情況，發現妊娠第14天的黃體內最大管徑處血流面積可作為妊娠診斷的預測指標，其敏感性(85.3%)和特異性(91.7%)均較高。Samir和Kandiel等利用CDUS對妊娠母牛進行黃體血流檢測，發現在第17天進行妊娠診斷就有較高的準確性(80.4%)，在21 d進行妊娠診斷準確性高達96.4%。此外，研究者們相繼進行了應用CDUS技術對奶牛配種后不同時期進行早孕診斷的研究，其結果略有不同，但均顯示出較高敏感性、特異性(表1)。

表1 CDUS技術在奶牛早孕診斷中的應用Table 1 Application of CDUS technology in early pregnancy diagnosis of dairy cows %

CDUS進行奶牛早孕診斷可以做到實時可視化，且在奶牛配種后17 d就可以進行診斷，在配后21 d進行診斷準確率可達96.4%。CDUS還可監測胎盤、胎兒兩者異常風險妊娠。盡管CDUS技術在奶牛早孕診斷中已經顯示出明顯的優勢，但是，CDUS診斷標準目前尚不統一，缺乏對結果的客觀分析。因此，需要明確CDUS診斷標準、開發對結果處理的客觀分析系統，促進CDUS技術在奶牛早孕診斷中的應用。

3 中紅外(mid-infrared,MIR)光譜診斷

有研究發現，妊娠奶牛會改變生理功能之間的營養分配，并且隨著妊娠階段的不同而變化，尤其是乳脂和乳蛋白質含量會增加。分子選擇性吸收一些特定波長的紅外線，會造成分子的振動和轉動能級的躍遷，通過檢測紅外線被吸收的情況可得到物質的紅外吸收光譜。紅外光譜有很高的特征性，每種物質都有其特定的紅外光譜。因而，MIR光譜可用于牛奶成分的檢測，進而間接判斷奶牛是否妊娠。此外，利用MIR光譜進行預測的范圍很廣，不局限于牛奶的主要成分，除脂肪和蛋白質含量外，也可以預測牛奶的微量成分(如礦物質和P4)。

Delhez等對8 064頭奶牛在配種后不同階段采集的乳汁進行MIR光譜分析，無論是直接使用光譜數據還是采用光譜差值分析都不足以檢測奶牛的妊娠狀況；然而，使用懷孕150 d后MIR記錄的數據，并通過數學建模能夠呈現出良好的擬合精度。Ho和Pryce對7 040頭奶牛的16 628份光譜和產奶記錄數據進行分析，并對包含不同解釋變量的3個模型進行了檢驗，結果表明，3個模型預測奶牛首次授精后妊娠的準確率分別為0.48、0.69和0.76。由此可知，直接對授精后不同階段收集的牛奶MIR光譜數據進行差異分析，還不能檢測奶牛的早期妊娠狀態，仍需進一步開發更為有效的MIR光譜分析預測妊娠的數據處理模型。盡管有關MIR光譜用來進行奶牛早孕診斷尚處于探索階段，但此方法無疑為奶牛早孕篩查提供了新的見解和方法。

4 干擾素誘導基因(interferon-stimulated genes, ISGs)表達檢測

奶牛妊娠后14～16 d的胚胎單核細胞產生干擾素τ(interferon-tau, IFNT)，IFNT是由172個氨基酸組成的多肽，IFNT也被稱為妊娠識別分子。IFNT對子宮內膜的局部作用是抑制雌激素受體α的表達，這會抑制子宮內膜細胞中催產素受體的表達，從而通過抑制PG釋放到黃體，避免黃體的溶解，以維持妊娠。IFNT還系統地影響黃體活動并調節其它細胞和組織。研究表明，IFNT在體內循環濃度較低，不易檢測，因此研究者很少把它作為奶牛早孕診斷的標志物。但IFNT可作用于子宮內膜細胞和循環外周血細胞，可誘導IFNT特異性基因的表達上調。IFNT通過15、1、2和1等激活母體和胚胎組織中的Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子信號通路(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)，進而刺激胚胎細胞、滋養層細胞、子宮內膜細胞和外周血白細胞(peripheral blood leukocytes，PBLs)，以協調“圍著床期”母胎之間的相互作用。基于此，人們建立了檢測配種后18～20 d妊娠的抗15單克隆抗體的ELISA診斷方法，通過對15的檢測進而判斷奶牛是否妊娠。

Green等通過檢測奶牛PBLs中的表達來確定人工授精(artificial insemination，AI)后18 d內妊娠情況，結果表明，AI后18 d的血液中表達量顯著增加。Ruhmann等通過對12頭 牛進行肝活檢，收集原代牛肝細胞后用IFNT誘導，結果顯示15和1表達量較高，并在此基礎上運用ELISA證明配種后18 d妊娠奶牛血清中15濃度較高。目前，應用IFNT誘導特定基因表達檢測的方法進行奶牛早孕診斷被廣泛研究，其研究結果也初步顯示出這種方法的可行性和可靠性(表2)。另外，Kikuchi等研究發現,IFNT增強了粒細胞中4和2的表達，其中4是參與細胞分化、早期胚胎發育、細胞功能和Notch信號傳導的HES超家族成員之一。2則表現出核苷二磷酸激酶活性和尿苷酸激酶活性，并與嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成和嘧啶代謝有關。因此，除了經典外，4和2可能在著床過程中作為新的發揮作用，參與母胎之間的協調，并在胎盤屏障中發揮重要的免疫調節功能。

表2 干擾素τ檢測技術應用于奶牛早孕診斷的結果Table 2 The results of interferon τ detection technology in early pregnancy diagnosis of dairy cows %

綜上，通過IFNT誘導特定基因表達檢測，15、1等可作為奶牛早孕診斷的生物標志物，最早可在14～16 d進行早孕預測。但此方法須在實驗室進行，操作較為繁瑣，時間較長。因此，需要開發類似膠體金試紙條檢測的便攜方法，有助于在實踐中推廣應用。另外，的表達還可反映胚胎的存活能力，因為胚胎釋放的IFNT濃度與的豐度之間存在正相關。研究發現，滋養外胚層的發育和擴張可能與胚胎或胎兒死亡有關，此外，表達上的變化也可能與妊娠丟失相關。因此，IFNT誘導特定基因表達檢測診斷奶牛早孕是必要的，應該繼續深入IFNT在奶牛繁殖上的研究。

5 循環核酸(circulating nucleic acids, CNAs)診斷

CNAs是在血液中循環的細胞游離的或膜包裹的DNA或RNA，CNAs可能由凋亡細胞釋放，并與組蛋白結合，可使CNAs免受核酸酶消化，在健康個體中產生平均大小約為180 bp的片段。目前CNAs研究較多的是microRNAs(miRNAs)，其由18～22個核苷酸組成，是小分子非編碼RNA的一個亞類，通過mRNA降解和翻譯抑制而成為基因表達的關鍵轉錄后調節因子。miRNAs可通過不同的機制調節基因的表達，其中包括與靶基因3′非翻譯區(UTR)的互補位點配對和抑制其翻譯成蛋白質，因此會影響動物的生理功能。miRNAs在生殖系統中有不同作用，能夠調控卵泡和黃體的發育、子宮周期、妊娠建立及胚胎發育。在牛胚胎發育早期，包括miR-496和miR-125a在內的一些miRNAs的水平差異顯著，這表明它在母體對合子的轉錄轉換中發揮了作用。此外，包括miR-27a和miR-92b在內的幾個miRNAs在胎盤發育過程中有不同的表達，它們與滋養層細胞分化和血管生成有關，參與調控胎盤形成。

研究發現，在奶牛妊娠期間胎盤、胚胎組織及子宮內膜凋亡的細胞也會釋放特異CNAs，并進入母體外周血液、乳汁、尿液中，且可以進行定量。這與某些miRNAs具有組織或發育階段特異性的事實相符合，并且CNAs在生物液中性質穩定，可承受極端的環境條件，包括極端的pH、較高的溫度、反復凍融以及循環中的RNA酶的消化，故CNAs可以作為檢測奶牛早孕的生物標志物。Schanzenbach等在奶牛妊娠第4、12、18、21天的全乳和非妊娠對照奶牛全乳中提取miRNAs，通過驗證分析，其中6個miRNAs(BTA-miR-221、BTA-miR-223、BTA-miR-93、BTA-miR-200c、BTA-miR-125b和BTA-miR-15b)表現出差異表達。盡管miRNAs在妊娠與非妊娠母牛乳中有差異表達，但是妊娠動物和情期動物還不足以完全區別。Mayer等在配種后第0、20、40天，從經產妊娠奶牛和非妊娠奶牛收集血清樣品，用定量PCR分析CNAs樣本，結果在配種后的第20天，與非妊娠牛相比，妊娠奶牛中的重復序列2和的表達顯著增加。另外，Gebremedhn等在奶牛配種后19和24 d采集奶牛血清樣品進行分析，分別鑒定出8和23個差異表達的miRNAs。因此，血液來源的miRNAs可以作為奶牛早孕狀態檢測的可行生物標志物。

通過以上可知，經定量PCR分析血清中CNAs可判斷奶牛是否妊娠，且在妊娠19 d左右就能檢測。CNAs中miRNAs具有穩定性、非侵入性、組織特異性以及檢測方法的準確性和快速性等關鍵特征，已被認為是最佳的生物標志物。然而，由于CNAs分離與測量需在實驗室進行，且陽性準確率和陰性準確率仍有待于提高，所以目前僅限于研究，并未用于實踐，亟需開發更為高效和方便快捷的循環核酸檢測技術。

6 妊娠相關糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)診斷

在奶牛和其它反芻類動物中，PAGs是成熟的妊娠標記物。發育中的胎盤雙核滋養層細胞分泌的PAGs在母體循環中被發現。PAGs是天冬氨酸蛋白酶家族的成員，除了雙核細胞分泌PAGs，來自單核絨毛上皮的單核滋養外胚層細胞(binucleate trophectoderm cells，BNCs)也可合成，其中一些細胞從胚胎更緊密地附著在子宮壁和胎盤形成開始的那一刻就分泌到母體的血液中。PAGs的可能功能包括激活潛在的生長因子、絨毛-子宮內膜邊界的細胞黏附、母體免疫系統調節和營養能力。在整個妊娠期間，BNCs侵襲子宮內膜上皮，并在整個妊娠過程中持續分泌PAGs。因此，檢測PAGs的存在可以很好地預測奶牛是否妊娠。

早期人們用放射免疫分析法測定PAGs，但由于此法輻射較高，存在一定的安全隱患，目前應用較廣的是ELISA方法診斷奶牛早孕。ELISA檢測PAGs作為奶牛早孕診斷安全性高，且陰性準確率高。Dufour等對519頭奶牛配種后28 d進行ELISA測試，其測試結果靈敏度為99.0%，特異度為95.0%。Silva等對1 079頭奶牛配種后27 d用ELISA測定血中PAGs進行妊娠診斷，結果與后期直腸超聲診斷結果一致，并且用此方法檢測有很高的陰性預測準確率。Fosgate等對1 236頭奶牛配種后28 d進行血清ELISA檢測PAGs，其敏感性為99.4%，特異性為97.4%；檢測奶中PAGs的敏感性和特異性分別為99.2%和93.4%。因此，除在血液中檢測外，在乳中也可通過檢測PAGs進行早孕測定。目前，通過檢測配種后27 d血液或乳汁中PAGs含量判斷奶牛是否妊娠的方法被廣泛研究，結果較令人滿意(表3)。此外，Han等采集牛乳后在2-DE凝膠圖像上可見600～700個蛋白質斑點，蛋白質印跡分析表明乳鐵蛋白、乳轉鐵蛋白和alpha-1 G三種蛋白均高于未妊娠奶牛；同時，發現alpha-1 G蛋白在授精后18 d顯著表達，在39 d達到高峰，并在整個妊娠過程中持續分泌，由此推測alpha-1 G蛋白也可用于奶牛早孕檢測。

表3 奶牛配種后早期應用PAGs檢測技術進行早孕診斷的結果Table 3 The results of early pregnancy diagnosis by PAGs detection technology in dairy cows after mating %

PAGs檢測法一般只能在特定條件下進行奶牛早孕診斷，檢測技術相對要求較高，雖然開發出了PAGs-ELISA試劑盒，但檢測成本也較高。PAGs檢測法在配種后較早時間進行早孕診斷準確率較高，且敏感性和特異性也較高，但很難在奶牛第一個情期內進行準確的妊娠診斷。此外，將PAGs循環濃度用來檢測奶牛妊娠時,需要確定一個更準確的閾值，因此要進行分析改進和更大樣本量的研究，以提高其檢測準確率。

7 小結與展望

如今諸多奶牛早孕診斷方法已被建立，但大多數尚停留在實驗室階段，其檢測可靠性也與現代牧場奶牛早孕診斷的需求有一定差距。其中PPR檢查法操作需要手法熟練的繁殖技術人員，且很難在配后的第一個情期內進行準確的早孕篩查；CDUS雖能夠做到實時檢測，但也需要一定的操作技術，且所用設備昂貴；已有PAGs檢測等方法雖然能達到準確、簡單的早孕檢測要求，但存在檢測時間長，不能做到實時檢測，也不能在配種后更早時間內進行檢測等缺點。IFNT誘導特定基因表達和CNAs檢測目前僅限于實驗室檢測，而且對奶牛進行早孕診斷準確率尚有待于提高，這些都需要進行理論和技術的再創新，以便開發更為準確、簡便、實用的早孕診斷技術。

研究發現，在母牛妊娠18 d時外周血單核細胞中有6、2、44、2、3、2、13等9個孕體誘導基因，并且其中6、2、44、2和3這5個妊娠標志物的發現比傳統診斷方法更早預測陽性妊娠。另外，也有研究報道，母牛妊娠后在胚胎著床過程中會使子宮內膜免疫細胞CD335 NK、CD8T數量和-15、-10的mRNA豐度增加；同時也發現配種后17 d與非妊娠母牛相比，妊娠母牛吲哚胺2,3雙加氧酶的表達上升15倍。在妊娠早期的這些免疫細胞變化可能與成功妊娠有關。因此，這些新發現的指標也可能成為奶牛早孕診斷的新生物學靶標。

此外，新型多肽kisspeptin在人妊娠期期間的變化以及在人胚胎著床、胎盤形成以及維持妊娠中的作用已成為生殖生物學的研究熱點，它是母體妊娠后胎盤所分泌的蛋白。在人妊娠不同階段，血漿或血液中的kisspeptin水平變化顯著，在人妊娠21 d與非孕對照相比，kisspeptin水平明顯升高，并且流產后kisspeptin水平顯著下降，因此認為它可能作為人早孕診斷和流產檢測的另一個重要的潛在生物標志物。假設妊娠奶牛血中kisspeptin濃度同人上的變化類似，那么檢測kisspeptin的變化將成為一種新的奶牛早孕診斷方法。然而，這些都需要將來做進一步詳細、深入的研究。