UPLC法測定糕點中β-胡蘿卜素的含量

范芳芳，李媛，魏寧果，鄒力

陜西省產品質量監督檢驗研究院（西安 710048）

β-胡蘿卜素屬于類胡蘿卜素中的一種異構體，可溶于脂類和非極性溶劑中。由于特殊的共軛雙鍵多烯結構，被稱為“最有希望的抗氧化劑之一”[1]。其形態為暗紅色晶體，具有良好的著色功能[2]。一分子的β-胡蘿卜素在加氧酶的作用下可分解為兩分子的維生素A，又被稱為維生素A源[3]。由于其獨特的結構和性能β-胡蘿卜素被廣泛應用于食品、化妝品及醫藥等領域[4]。自從β-胡蘿卜素被第23版美國藥典收載，世界范圍內多個國家和地區已批準使用胡蘿卜素，我國則在GB 2760—2011《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中就已經許可使用[5]。但人體攝入過量的β-胡蘿卜素會導致皮膚發黃，攝入大量的β-胡蘿卜素會使維生素A與相應受體結合受阻[6]。我國現行標準GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定β-胡蘿卜素在糕點中的允許使用限量為1.0 g/kg[7]。因此，建立糕點中β-胡蘿卜素的標準分析體系對于我國的食品安全監管具有極其重要意義。

β-胡蘿卜素的提取工藝主要有溶劑提取法[8]、超聲波提取法[9-10]、微波提取法[11]、酶解輔助萃取法[12]和超臨界流體CO2萃取法[13]。檢測方法主要有分光光度法[14]和高效液相色譜法[15]。溶劑提取工藝具有容易操作、適用范圍廣泛且易于實現工業化等優點[16]而被普遍應用。高效液相色譜的檢測方法較分光光度法具有定量好、穩定性強的優點，因此食品檢測實驗室常用溶劑提取與高效液相結合的方法對食品中的β-胡蘿卜素進行定量分析。傳統的提取溶劑一般為石油醚、二氯甲烷、丙酮等，但二氯甲烷、丙酮對人體危害較大，石油醚易揮發且會將自身雜質帶入實驗結果中。試驗將相對危害較小、穩定性較好的正己烷作為提取溶劑，應用于糕點中β-胡蘿卜素的提取。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與設備

LC-30AD超高效液相色譜儀、LC-SPD紫外檢測器、LabSolutions系統（日本島津公司）；Agilent Proshell SB-C18色譜柱（型號100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司）；水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀儀器儀表有限公司，型號為WE-3）；臺式高速冷凍離心機（湘潭湘儀儀器有限公司，型號為H1750R）；多樣品渦旋混合器（廣州得泰儀器科技有限公司，型號為MultiVortex圓盤形排列，12位）；精確度為0.000 1 g的電子天平（德國賽多利斯公司，型號為BSA224S）；氮吹儀（廣州得泰儀器科技有限公司，型號為FV-64）；0.2 μm GHP有機過濾膜（美國Waters公司）。

1.1.2 材料與試劑

L（+）抗壞血酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；α-淀粉酶（≥3 700活力單位/g）；氫氧化鉀（分析純，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心）；甲醇、乙腈、無水乙醇（色譜純，德國霍尼韋爾公司）；正己烷（色譜純，賽默飛世爾科技）；β-胡蘿卜素標準品（北京振翔科技有限公司）。

1.2 標準儲備液制備

標準儲備液配制（500 μg/mL）：稱取0.050 0 gβ-胡蘿卜素標準品，以正己烷溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中（現配現用）。

1.3 標準工作液的配制

從β-胡蘿卜素標準中間液中分別準確移取0.004，0.008，0.016，0.040和0.080 mL于5個10 mL棕色容量瓶。用正己烷定容至刻度，得到質量濃度為0.2，0.4，0.8，2.0和4.0 μg/mL的系列標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 皂化

稱取5.0 g經均質處理的試樣于50 mL具塞離心管中，加入0.4 gα-淀粉酶，加10 mL 45～50 ℃超純水，蓋上瓶蓋，渦旋混勻，置于恒溫水浴箱內避光振蕩30 min，溫度設為55 ℃。再加入0.4 g抗壞血酸，12 mL無水乙醇，渦旋30 s，加入6 mL（50 g/100 g）KOH溶液，繼續渦旋30 s，然后再次置于恒溫水浴箱內振蕩30 min，溫度設為60 ℃。

1.4.2 提取

向快速冷卻后的上述皂化液中加入20 mL正己烷，渦旋提取3 min，在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min，轉移上清液于50 mL離心管，加入25 mL水輕微晃動30次，進一步洗去雜質，在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min。

1.4.3 富集

取所有上層有機相至50 mL離心管，于40 ℃氮吹至干，殘渣用1 mL正己烷復溶，待測液過0.22 μm有機濾膜，供超高效液相色譜儀分析使用。

1.5 儀器分析條件

色譜柱Agilent Proshell SB-C18（100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm）；流動相為乙腈-甲醇體系（乙腈∶甲醇=85∶15）等度洗脫；流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量4 μL，檢測波長450 nm。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

采用乙腈-甲醇流動相體系考察3根色譜柱對β-胡蘿卜素分離的影響，包括Agilent Proshell SB-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）、Silversil C18色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）和CAPCELL PAK CR150（150 mm×2 mm，5 μm）結果見圖1～圖3。

圖1 色譜柱CAPCELL PAK CR150的色譜圖

圖3 色譜柱Silversil C18的色譜圖

不同色譜柱對于β-胡蘿卜素的保留情況各不相同。CAPCELL PAK CR150色譜柱的分離是由十八烷基引起的疏水性磺酸基引起的強陽離子交換模式進行，該柱子可以滿足除強極性、小分子類化合物外的大部分化合物的分離需求。由圖1可以看出，極性較弱的β-胡蘿卜能夠被充分分離，且峰型較好。POROSHELL SB-C18色譜柱具有小粒徑填料，能夠高效、高分離、快速實現化合物的保留。由圖2可以看出，β-胡蘿卜素能夠被快速分離，且峰型尖銳平滑分離度高。Silversil C18色譜柱采用低壓設計，大幅降低色譜柱壓對儀器造成的長時間潛在影響，其優點是延長色譜柱的使用壽命，但該填料對脂溶性物質β-胡蘿卜素的保留效果不如前2個柱子。其分離效果見圖3，目標峰出現前拖尾現象，且出峰時間較長。因此，CAPCELL PAK CR150和POROSHELL SB-C18可以滿足糕點樣品中β-胡蘿卜素的測定要求。但是綜合出峰時間及造價這2個因素，試驗選擇POROSHELL SB-C18色譜柱進行后續試驗。

圖2 色譜柱POROSHELL SB-C18的色譜圖

2.2 有機提取溶劑的選擇

由于β-胡蘿卜素屬于非極性類胡蘿卜素，因此常用的提取試劑為正己烷、丙酮、石油醚及二氯甲烷等非極性有機溶劑。試驗以添加了β-胡蘿卜素的樣品為原料對比不同溶劑的提取效率，結果見圖4。結果表明，石油醚的提取效率最高，這與GB 5009.83—2016《食品安全國家標準 食品中胡蘿卜的測定》所選提取試劑一致，其次為正己烷的提取率，二者均能滿足定量分析的要求。考慮到石油醚容易揮發，長期使用人體吸入較多，且自身雜質的帶入可能會影響試驗結果，因此試驗采用正己烷作為提取溶劑。

圖4 不同溶劑的提取含量圖

2.3 檢測波長的選擇

采用3D檢測模式，對β-胡蘿卜素標準品進行掃描（見圖5）。選擇450 nm為最佳吸收波長。

圖5 β-胡蘿卜素的光譜圖

2.4 流速的選擇

一般而言，流速越大，出峰時間越短。試驗在確定Agilent Proshell SB-C18為試驗色譜柱且相同進樣量的條件下加大流速，分別進行0.4，0.5，0.8，1.0和1.2 mL/min 5個流速的對比篩選。結果發現流速為0.5 mL/min時，試驗既能提高測定效率又能保證有效分離。且流速越大，系統壓力較高，長期使用對儀器損害較大。故流速確定為0.5 mL/min。

2.5 皂化與未皂化

對比進行皂化反應與不進行皂化反應的試驗，結果如圖6所示。

圖6 皂化試驗提取對比圖

同一樣品在其他條件相同的情況下，經過皂化反應的試驗β-胡蘿卜素提取結果為294 μg/kg，未皂化反應的試驗β-胡蘿卜素的提取結果為177 μg/kg。這是由于β-胡蘿卜素被包括在蛋白質、淀粉等大分子顆粒里面，皂化反應使目標物與這些大分子有機顆粒分離，為提高提取效率提供保障。

2.6 方法驗證與試驗

2.6.1 標準曲線

繪制β-胡蘿卜素標準曲線，觀察線性效果，如表1所示。

表1 β-胡蘿卜素的標準曲線測試數據

2.6.2 檢出限

分別精密量取標準儲備液適量，用正己烷逐步定量稀釋，進樣分析，按S/N≥3確定β-胡蘿卜素的檢出限，得出β-胡蘿卜素的檢出限為0.72 μg/100 g。將分析物分別加入空白樣品中，加入含量為方法檢出限（加入標準工作液質量濃度為0.036 μg/mL，體積為1 mL）含量，進行平行試驗，連續11次重復性測試，結果見表2。

表2 β-胡蘿卜素的檢出限測試數據

根據GB/T 32465—2015中7.5.4的要求，11次重復性測試的偏差均在方法檢出限±20%范圍內，即該方法的檢出限可達到標準要求。

2.6.3 精密度

將0.72，2.16和10 000.00 μg/100 g三個質量分數對應的分析物（方法檢出限的質量分數、3倍方法檢出限即定量限濃度及標準限量時的質量分數）加入空白樣品中，分別進行7次重復性測試，計算β-胡蘿卜素的精密度，如表3所示。

表3 β-胡蘿卜素的精密度測試數據

試驗室內變異系數符合GB/T 27404—2008中表F.2的參考范圍，故方法精密度達到要求。

2.6.4 回收率

向空白樣品中分別進行三次不同質量分數的加標試驗。質量分數一：2.8 μg/100 g，加標溶液質量濃度1 μg/mL，體積為0.14 mL；質量分數二：28.0 μg/100 g，所需加標溶液質量濃度10 μg/mL，體積為0.14 mL；質量分數三：10 000.0 μg/100 g，所需加標溶液質量濃度為500 μg/mL，體積為1 mL。計算加標回收率，如表4所示。

表4 β-胡蘿卜素的實際樣品加標測試數據

該試驗加標回收率符合GB/T 27404—2008中表F.2的參考范圍，方法加標回收率達到要求。

2.7 實際樣品的測定

應用上述方法，對市售的10批糕點樣品中β-胡蘿卜素含量行測定，結果測得β-胡蘿卜素含量為3 000～ 4 000 μg/100 g。

3 結論

建立正己烷溶劑提取與超高效液相色譜結合測定糕點中β-胡蘿卜素定量分析方法。通過對色譜柱、流速、提取溶劑優化，實現糕點中β-胡蘿卜素的準確高效提取。與傳統的提取方法相比，該方法從流動相到提取試劑，只采用甲醇、乙腈、乙醇和正己烷4種有機試劑，并大大減少有機溶劑的使用量。操作中去掉分液漏斗等裝置，減少反復置換容器帶來的損失。該方法具有綠色環保、環境友好、簡便、快速等優點，可應用于實際樣品的大批量測定。