UPLC/MSMS快速篩查減肥類保健食品中6種違禁藥物

韓瑨烜，寇雷，李勇，萬玉煒

1. 新疆維吾爾自治區產品質量監督檢驗研究院（烏魯木齊 830011）；2. 新疆職業大學（烏魯木齊 830011）

隨著人們對纖細美學的不斷追崇[1]，越來越多的減肥類保健食品被推向市場。然而保健食品向來是違禁藥物泛濫的重災區，部分不法商法為賺取暴利，通過向產品中添加如西布曲明等具有減肥功效的非法添加物以達到快速減肥瘦脂的目的。除西布曲明外，減肥類保健食品中經常添加的違禁藥物還包括麻黃堿[2]、芬氟拉明、酚酞以及西布曲明的衍生物N-單去甲基西布曲明和N，N-雙去甲基西布曲明等，上述藥物雖然作用機理各有不同，但都可在短期內使受體達到減輕體重的作用，長期或者過量食用均會對人體造成不可逆轉的損害[3]。

目前針對保健食品中違禁藥物的檢測方法主要有薄層色譜法[4]、分光光度法[5]、液相色譜法[6]和液相色譜-質譜法[7-8]，其中薄層色譜法只能做定性篩查，存在較高的假陽性率，通常用于初篩。分光光度法干擾因素較多，定量并不準確，特異性不強。液相色譜法定性能力較弱，選擇性不強，檢出后還需要質譜進一步確認。液相色譜-質譜法具有分析速度快、選擇性強以及靈敏度高的優點，串聯質譜儀在多反應監測模式（MRM）下還可以提供化合物二級碎片離子，因而能夠對化合物進行準確的定性和定量分析[9-10]。

試驗以常見的幾種減肥類保健食品為研究對象，采用多反應監測模式下的超高效液相色譜-串聯質譜儀進行分析，通過對樣品前處理條件、液相條件以及質譜條件進行優化，旨在建立一種能夠同時對減肥類保健食品中6種典型違禁藥物進行快速篩查的試驗方法，以滿足目前實驗室多批次、多組分、快速篩查的需要，旨在為中國食品安全提供有力保障。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與材料

TSQ Quantis型超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀（配有ESI源和TraceFinder定量處理軟件，美國賽默飛世爾科技公司）；Hettich 380R型高速冷凍離心機（德國海蒂詩公司）；ME204E型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SDC-3000多管渦旋混勻儀（深圳逗點生物技術有限公司）；SB-800DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；

甲醇、乙腈（色譜純，德國MERCK公司）。

6種違禁藥物化合物信息與標準物質信息見表1。

表1 6種違禁藥物化合物信息及對照品信息

試驗用減肥類保健食品來自周邊市場抽取以及公安機關送檢。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制

標準儲備液的制備：分別精密稱取5 mg酚酞、西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中；準確吸取1.0 mL麻黃堿、芬氟拉明標準品至20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。得到各組分濃度為0.5 g/L的標準儲備液。

混合標準中間液的制備：分別從各組分標準儲備液中吸取1.0 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質量濃度為1 mg/L的混合標準中間液。

混合標準系列工作液的制備：從混合標準中間液中分別吸取2.0，1.0，0.5，0.2和0.1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇分別溶解并定容，得到質量濃度為200，100，50，20和10 μg/L的混合標準系列工作液。

1.2.2 樣品溶液制備

固體樣品（硬膠囊、片劑等）：樣品預先均質成粉狀，從中精確稱取2.00 g樣品至50 mL容量瓶中，加入1%甲酸-甲醇40 mL，振搖充分，超聲20 min，取出后恢復至室溫并用1%甲酸-甲醇定容，必要時可擴大稀釋倍數，清液經0.22 μm針頭濾器過濾后供超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀分析。

液體樣品（口服液、軟膠囊等）：準確吸取樣品2.0 mL至50 mL容量瓶中，其他處理步驟同固體樣品。

根據實際測樣的經驗，有些減肥類保健食品中違禁藥物的含量可能達到藥物級別，為避免過高濃度的組分污染質譜系統，建議測定時先選取較大的稀釋倍數，后再根據實測值對稀釋倍數進行調整。

1.2.3 液相條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：1 μL；流動相：A/B=0.1%甲酸-水/甲醇；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序：0～0.5 min，20% B；0.5～4 min，75% B；4～6 min，75% B；6～6.1 min，20% B；6.1～8 min，20% B。

1.2.4 質譜條件

離子源類型：電噴霧電離源（ESI）；正離子掃描；多反應監測模式（MRM）；離子源電壓：3 500 V；霧化器溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；6種違禁藥物液相、質譜參數詳見表2。

表2 6種違禁藥物液相、質譜參數

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的優化

考慮到多數保健食品基質干擾較小以及實驗室快速篩查的需要，重點考察了溶劑提取法的提取效果。溶劑提取法常采用甲醇或乙腈[11]作為提取溶劑，違禁藥物多為堿性化合物，加入適量甲酸有助于提高待測組分的離子化效率，故分別測試了甲醇、1%甲酸-甲醇、乙腈、1%甲酸-乙腈四種不同溶劑的提取效果。測試結果表明，四種溶劑的提取效果由高到低依次為1%甲酸-甲醇＞1%甲酸-乙腈＞甲醇＞乙腈。因此試驗選擇提取效果較好且成本較小的1%甲酸-甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取方法的優化

分別測試了渦旋提取5，10和15 min以及超聲提取10，20和30 min的提取效果，其余試驗步驟均按照1.2.2小節前處理方法重復測定兩次，取平均回收率進行對比。測試結果表明，采用渦旋提取時，提取效果隨提取時間的變化規律為15 min＞10 min＞5 min；采用超聲波提取時，提取效果隨提取時間的變化規律為30 min≈20 min＞10 min。對比兩種提取方法，超聲提取20 min時各組分平均回收率均顯著優于渦旋提取15 min，因此試驗選擇超聲波提取20 min作為提取方法。

2.2 液相與質譜條件優化

液相方面：試驗測試了0.1%甲酸/水與甲醇作為流動相組合的分離效果，結果表明，在使用該流動相組合時，各組分響應值良好，峰型呈現也較好，且儀器故障率顯著降低。色譜柱選擇適合用于藥物分析的Hypersil GOLD C18色譜柱，流速設為0.25 mL/min，分析總時長僅為8 min，各組分保留時間在2.188～5.119 min之間，分離效率得到顯著改善。各組分離子色譜圖見圖1。

圖1 6種違禁藥物定量離子的離子色譜圖

質譜方面：采用多反應監測模式（MRM），主要優化參數為各化合物的母離子、子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。優化方法：取1 μg/mL的6種違禁藥物混標溶液，采用蠕動泵進樣方式，首先進行母離子掃描（Q1 Scan），獲取待測物的母離子，然后通過子離子掃描（Q3 Scan）獲取其碎片離子，最后用MRM掃描的方式進一步優化碰撞能量、去簇電壓等質譜參數。優化后各組分譜參數見表2。

2.3 基質效應評價

基質效應（Matrix effects，ME）是指由樣品基質所引入，造成目標組分信號增強或減弱的現象[12-13]。試驗為評價不同類型保健食品基質效應的強弱，分別選取片劑、軟降囊、硬膠囊以及口服液四類保健食品的陰性樣品，按照1.2.2前處理方法制備空白基質并配制基質標準曲線，再用甲醇配制溶劑標準曲線，通過計算基質標準曲線與溶劑標準曲線線性方程的斜率之比，得到各樣品的基質效應（ME），ME越接近1，說明基質效應越弱。四類樣本中6種違禁藥物的平均基質效應計算值（ME）見表3。結果表明，6種違禁藥的平均基質效應計算值均大于0.9，測定時可以采取溶劑標準曲線。

2.4 線性范圍及檢出限、定量限

基于優化后的液相、質譜條件，采用高效液相色譜-多反應監測質譜法對6種違禁藥物混合標準工作液進行分析，并繪制標準曲線線性方程。結果表明，6種違禁藥物在0.5～100 μg/L的范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99。再以3倍基線噪聲（S/N）確定各組分的檢出限（limits of detection，SLOD），10倍基線噪聲（S/N）確定各組分的定量限（limits of quantification，SLOD）。結果表明，6種違禁藥物在該方法下檢出限為0.5～1.0 μg/kg，定量限為1.4～3.5 μg/kg。結果詳見表3。

表3 線性關系、檢出限、定量限

2.5 加標回收率與精密度

采用1.2.2小節前處理方法，選取陰性樣品進行加標回收試驗，加標質量分數為低、中、高三個水平（20，100和500 μg/kg），每個加標濃度平行測定6次，計算平均回收率和精密度（Relative standard deviations，SRSD），結果見表4。加標質量分數20 μg/kg時，回收率為78.1%～95.3%，SRSD為3.6%～8.8%；加標質量分數100 μg/kg時，回收率為86.1%～97.2%，SRSD為4.4%～7.7%；加標質量分數500 μg/kg時，回收率為90.7%～99.3%，SRSD為3.7%～8.1%。

表4 6種違禁藥物平均回收率結果（n=6）

2.6 實際樣品檢測

取市售和公安機關送檢樣品（共計50批次），采用1.2.2小節前處理方法進行測定。結果表明，50批次樣品中合計檢出含有西布曲明的樣品8批次，檢出率16%，含量差異較大，其中含量最低的為0.25 mg/kg左右，含量最高的則達到110 g/kg左右，含量超過臨床用藥劑量的數倍。其余5種違禁藥物未見檢出。

3 結論

通過優化提取溶劑、提取方法、液相色譜條件及質譜條件，建立了基于多反應監測模式下超高效液相色譜-串聯質譜法對減肥類保健食品中6種違禁藥物快速篩查方法，并對該方法的線性范圍、加標回收率、精密度、基質效應、檢出限以及定量限進行充分驗證和評價，后又將該方法應用于多種減肥類保健食品的實際樣品測定過程，并檢出含有西布曲明成分的樣品。該試驗方法具有操作簡單、成本較低、分析快速、回收率高等優點，能夠充分滿足檢測實驗室針對減肥類保健食品中違禁藥物快速篩查的需求。