高效液相色譜法測定青錢柳中黃酮含量

石雪萍

江蘇經貿職業技術學院健康學院（南京 210087）

青錢柳又被稱之為金錢柳或者金錢李，是近年來發現的一種珍貴的瀕危保護樹種，它歸屬于被子植物門，雙子葉植物綱，胡桃科，高大落葉喬木，是我國特有的一種單種屬喬木的珍稀樹種，同時也是一種瀕危保護樹種[1-3]，因此青錢柳又有著“植物界大熊貓”“醫學界第三棵樹”的美譽[4]。

青錢柳樹不僅是一種具有鑒賞價值的風景樹種，其根、葉、枝還可作為藥材入藥，其樹皮可作為制造橡膠和紙的原材料，而且青錢柳還有非常高的藥用價值，樹皮和樹葉具有清熱解毒、止痛、治療癲癇的功效，無不良反應，其芽葉常被制成茶葉飲用[5-6]。青錢柳茶葉在民間歷史悠久，被廣泛飲用，并且被當成一種保健茶[7]。

青錢柳中主要的化學成分是黃酮類化合物、三萜類、甾醇、皂苷、有機酸、多糖類、氨基酸、生物堿、胡蘿卜素、維生素E和豐富的礦物質等，其中主要化學成分為黃酮類化合物[8]。黃酮類化合物和多糖類，以及一些微量元素如鐵、硒、鉻、鍺、鎂等能夠有效協調胰島素發揮降血糖的作用，調節糖代謝[9-10]。

研究表明，青錢柳具有降血糖[11-13]、降血壓[14]、降血脂[15]，以及抗氧化、抗衰老功效[16]。青錢柳中的黃酮類化合物具有多種藥用價值，如降低血糖、抗氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤活性等作用，而青錢柳中的黃酮類化合物作為一種天然化合物，其藥用價值可被用于開發新型保健品和藥品[17]。因此，青錢柳中的黃酮類化合物具有良好的發展前景。試驗通過利用HPLC方法測定青錢柳中黃酮的含量，為青錢柳產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳葉（市售）；蘆丁對照品（南京化學試劑股份有限公司）；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、95%乙醇、均為國產分析純；甲醇，色譜純（美國天地公司）；蘆丁、槲皮素、山柰酚對照品（合肥博美生物科技責任有限公司）。

1.2 試驗儀器

751分光光度計（上海精科實業有限公司）；電子不銹鋼水浴鍋（鄭州市亞榮儀器有限公司）；高速萬能攪碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；安捷倫1200液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 青錢柳總黃酮的測定方法

試驗測定總黃酮的方法為亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，其原理是利用黃酮類化合物和亞硝酸鹽結合的情況下，和鋁離子產生絡合反應，形成絡合物，該絡合物能夠在堿性環境下有顯色反應，顯紅色，在可見光區有較強的吸收峰，利用721紫外分光光度計對青錢柳葉中的總黃酮含量進行測定。

1.3.2 最大吸收波長的確定

精密稱取1.000 0 g蘆丁對照品，用體積分數60%的乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配置成質量濃度1 mg/mL的蘆丁標準品對照溶液。吸取一定量蘆丁標準品對照液，加入濃度5%的NaNO2、濃度10%的Al(NO3)3和濃度4%的NaOH溶液作為顯色劑，在不同波長下測定吸光度，結果顯示，蘆丁標準品在波長510 nm處有較強的吸收峰。因此試驗選定的檢測波長為510 nm。

1.3.3 蘆丁標準曲線的繪制

用吸量管分別精確吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL的蘆丁標準品溶液于25 mL比色管中，依次加入濃度5%的NaNO2溶液0.5 mL，搖勻，放置10 min，加入濃度10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，搖勻，放置10 min，加入濃度4%的NaOH溶液4 mL，用體積分數60%的乙醇定容至刻度線，將比色管搖勻，放置15 min，在波長510 nm下測量吸光度A，以吸光度A為橫坐標，蘆丁標準品質量濃度C（mg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=1.101 4x+ 0.000 4，線性回歸系數為R2=0.999 1。

1.3.4 原料預處理

將購得的青錢柳葉置于烘箱中進行干燥，干燥后粉碎，過0.250 mm（60目）篩，備用。

1.3.5 青錢柳黃酮提取溶劑的選擇

參考大量文獻，在預試驗基礎上，研究提取溶劑對青錢柳黃酮得率的影響。準確稱取青錢柳1 g于錐形瓶中，選用甲醇溶液和體積分數為50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液各30 mL，超聲波輔助提取45 min，對青錢柳中黃酮進行提取，過濾備用。

比色法測定按照1.3.3的方法對提取液中黃酮進行測定。測量吸光度，按照標準曲線求出樣品中黃酮的濃度，黃酮提取率按式（1）計算。

式中：V為樣液總體積，mL；C為樣品質量濃度，g/mL；m為青錢柳葉樣品質量，g。

1.3.6 青錢柳黃酮的水解

分別精確稱取兩份青錢柳葉樣品各1 g，用體積分數50%的乙醇溶液，料液比1∶30（g/mL），超聲提取1 h，將提取液過濾，將抽過濾的樣液放置于溫度90 ℃水浴鍋中，進行乙醇揮發，待樣液揮發至無醇味，拿取出，將樣液置于分液漏斗中，加入石油醚進行3～4次萃取，棄去石油醚層，將料液蒸發至干。加入甲醇-25%鹽酸（4∶1，V/V）在80 ℃回流提取1 h進行水解[18]，空白對照，水解后取樣0.22 μm膜過濾，待做HPLC檢測。

1.3.7 HPLC測定青錢柳中黃酮含量

1.3.7.1 色譜條件

采用Zorbax Eclipse C18柱，流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液（55∶45），檢測波長275 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量5 μL。

1.3.7.2 混合標準品的配置

分別精確稱取蘆丁對照標準品177.5 mg，槲皮素對照標準品145.625 mg，山柰酚標準品8.75 mg，加入體積分數70%的甲醇溶液，定容至25 mL容量瓶中，分別配置成各種對照標準品，分別精確量取取蘆丁、槲皮素、山柰酚標準對照液1 mL，用體積分數70%的甲醇溶液定容至25 mL，配置成蘆丁質量濃度0.284 mg/mL，槲皮素質量濃度0.233 mg/mL，山柰質量酚濃度0.014 mg/mL的混合標準品溶液。

1.3.7.3 標準曲線的繪制

將混合標準品的進樣量依次設置成0，2，5，8和10 μL，進行測定，以峰面積y對進樣量x進行回歸計算。

蘆丁的標準曲線為y=328.59x-6.203 9，線性回歸系數為R2=0.999 4；槲皮素的標準曲線為y=532.77x- 12.045，線性回歸系數為R2=0.999 3；山柰酚的標準曲線為y=102.57x+2.085 2，線性回歸系數為R2=0.999 5。

1.3.7.4 黃酮苷的測定

按照1.3.7.1的色譜條件，將青錢柳總黃酮及水解后的樣品分別配置成質量濃度10 mg/mL溶液，并做3組平行樣品，進行HPLC法測定。

2 結果與討論

2.1 青錢柳總黃酮的提取試驗結果

不同試劑提取青錢柳黃酮，試驗結果見表1。

表1 不同提取溶劑下青錢柳黃酮提取得率

由表1可以看出，乙醇的提取效果比甲醇好，并且乙醇體積分數50%時的提取率最高。

2.2 對照品和樣品的高效液相色譜結果

對照品和樣品的高效液相色譜結果分別見圖2～圖4。

圖1 混合標準品色譜圖

圖2 未水解青錢柳總黃酮樣品的色譜圖

圖3 青錢柳總黃酮水解樣品色譜圖

黃酮水解后，用HPLC色譜法測定黃酮苷的含量。由圖2～圖4可以看出，蘆丁、槲皮素、山柰酚在1.3.7.1色譜條件下可以完全分離開來。其中，高效液相色譜圖中的1號化合物為蘆丁，2號化合物為槲皮素，3號化合物為山柰酚。根據3種黃酮（苷）的標準曲線，計算出青錢柳總黃酮水解前樣品中蘆丁、槲皮素、山柰酚的含量依次為5.99，0.62和0.18 mg/g，青錢柳水解后樣品中蘆丁、槲皮素、山柰酚的含量依次為0，1.15和0.28 mg/g。對比水解前后樣品中含量的變化，發現蘆丁完全消失，槲皮素和山柰酚的含量增加，山柰酚的含量的增加則說明青錢柳黃酮水解前的樣品中存在以山柰酚為苷元的黃酮苷類。對青錢柳黃酮的種類及水解后苷元的鑒定及檢測有待進一步研究。

3 結論

青錢柳中黃酮化合物含量豐富。采用HPLC色譜法測定青錢柳中黃酮及水解產物黃酮苷的含量。對比水解前后樣品中蘆丁、槲皮素、山柰酚黃酮含量的變化，蘆丁的含量減少，槲皮素和山柰酚的含量的增加，說明蘆丁發生了水解。而山柰酚的含量的增加則說明了青錢柳水解前的樣品中存在一些黃酮，含有山柰酚苷元。對黃酮的水解條件及山柰酚的水解苷元需要進行進一步的研究。