不同類型脂質體穩定性的比較研究

王寅，劉雪梅，徐葉，趙利，白春清

江西科技師范大學生命科學學院（南昌 330013）

薏苡仁油（Coix seed oil，CSO）是薏苡仁或薏苡仁加工副產物麩皮中提取出的油脂或脂溶性功能成分混合物[1]。CSO中有薏苡仁酯、薏苡仁素、生育酚等功能成分，其中薏苡仁酯是CSO中不飽和脂肪酸2，3-丁二醇的總稱，對抑制癌細胞增殖、促進其凋亡具有積極作用。β-胡蘿卜素是一種脂溶性的天然色素，具有一定的抗氧化活性[1]，但在光、熱等條件下極不穩定。為增強β-胡蘿卜素-薏苡仁油體系的穩定性，此次試驗采用脂質體包埋技術將其包裹。

脂質體是由脂質雙分子層構成的封閉囊泡[2]，具有類似細胞膜結構，能夠包埋水溶性、油溶性以及兩親性活性物質，在活性物質包埋方面應用廣泛[3]。但因膜材自身組成易于氧化，外界胃腸道消化穩定性欠佳等問題，脂質體并不適用于直接口服食用[4-5]。聚合物具有較好的生物相容性和生物可降解性。研究表明采用聚合物對其表面進行修飾，可解決脂質體的上述缺陷。殼聚糖作為唯一的聚陽離子多糖[6]，因其具有較好的抗菌性、生物相容性、生物降解性、低毒性、價格低廉等優點，是應用最廣泛、最有前途的脂質體表面修飾聚合物[7-8]。果膠是從高等植物細胞壁中層提取的具有生物相容性陰離子多糖類聚合物[9-10]，因無毒無害且具有凝膠特性，在食品和藥品中發揮越來越重要的角色。有研究表明，利用聚合物間的異電性，采用改進的制備技術，可在脂質體表面進行雙層甚至多層修飾以提高穩定性。Liu等[11]利用層層自組裝技術制備了殼聚糖和海藻酸鹽雙層修飾的脂質體，結果發現與單層修飾脂質體、常規脂質體相比，雙層修飾脂質體具有更高的物化穩定性和體外消化穩定性。課題組前期也曾采用聚電解質絡合技術，利于果膠、殼聚糖的異電性構建了果膠、殼聚糖雙層修飾脂質體，對其工藝要求、結構特性及形成機制、消化利用情況等進行了系統研究[12]，但其作為新型載體在常規食品加工或貯藏條件下的穩定性未進行評價。

因此，此次試驗以粒徑、電位為主要指標對常規脂質體、殼聚糖單層修飾脂質體和果膠-殼聚糖雙層修飾脂質體三種不同類型脂質體的溫度穩定性、凍融穩定性及pH穩定性進行深入研究，為聚合物修飾脂質體的開發以及脂質體的工業化應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（Solarbio公司）；果膠（Sigma-Aldrich公司）；蛋黃卵磷脂（上海藍季科技發展有限公司）；薏苡仁油（廣州合誠三先生物科技公司）；膽固醇（天津市大茂化學試劑廠）；上述所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

N-1100旋轉真空蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）；Nicomp 380微粒粒度分析儀（上海奧法美嘉公司）；ZetaCAD Zeta電位測定儀[儀思奇（北京）科技發展有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 常規脂質體的制備

采用乙醇注入法制備常規脂質體，將蛋黃卵磷脂、膽固醇（質量比5∶1）及6 mg薏苡仁油完全溶解于10 mL的無水乙醇中，得到油相。準確量取25 mL磷酸鹽緩沖液，于磁力攪拌器加熱至45 ℃得水相，然后用滴管分數次將油相滴入水相中，繼續恒溫攪拌20 min。接著將其于45 ℃真空旋轉蒸發除去乙醇形成薄膜，至溶液無氣泡產生，繼續蒸發15 min，測定體積并補加蒸餾水至25 mL，得到常規脂質體。

1.3.2 殼聚糖修飾脂質體的制備

將常規脂質體按照體積比1∶ 1緩慢滴入至殼聚糖乙酸溶液（0.2%wt）中，滴完后繼續攪拌20 min，得到殼聚糖修飾脂質體（制備過程中保持室溫磁力攪拌狀態）。

1.3.3 果膠-殼聚糖修飾脂質體的制備

將羧甲基殼聚糖修飾脂質體按照體積比1∶1緩慢滴入果膠磷酸鹽溶液（0.06%）中，滴完后繼續攪拌20 min得到果膠-殼聚糖修飾脂質體（制備過程中保持室溫磁力攪拌狀態）。

1.3.4 溫度穩定性考察

將上述3種樣品分裝于小試管中（每支試管3 mL），分別于60，70，80，90和100 ℃加熱30 min，水浴加熱完成后取出，并立即放入冷水中，冷卻至室溫。另取上述3種樣品，分別置于80 ℃水浴加熱5，15，30，45和60 min后，立即放入冷水中冷卻，分別測定3種脂質體的電位、粒徑大小及分布，考察產品的溫度穩定性。

1.3.5 冷凍穩定性考察

將上述3種樣品，按每支試管10 mL，分裝于小試管中，放冰箱冷凍24 h后，用冷水解凍后，繼續放入冰箱冷凍，測定樣品分別經過1～5次循環冷凍后的電位、粒徑大小及分布，考察產品的冷凍穩定性。

1.4 數據處理

試驗數據通過SPSS 23.0軟件進行顯著性差異分析，用Microsoft Excel 2010處理并繪制圖表，小寫字母（a，b，c，d和e）表示同一脂質體在不同條件下的差異性，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 溫度穩定性研究

熱處理是幾乎所有液態食品走向市場前必須經歷的關鍵加工工序。熱處理可破壞病原微生物、降低腐敗微生物數量，達到延長食品保質期的目的。但在熱處理過程中，也會對食品的感官產生影響，如降低液態食品的穩定性，產生聚集、沉淀等現象，產生不良風味，從而影響消費者的感官可接受度。此次試驗以粒徑、電位為主要指標，系統研究了3種脂質體不同加熱溫度、加熱時間下的穩定性，為脂質體的工業化生產提供參考。

比較新鮮制備的3種脂質發現，常規脂質體經聚合物修飾后，粒徑大小和表面電荷都發生一定程度的改變。推測可能是由于殼聚糖在醋酸溶液中帶大量正電荷，當其與帶負電的脂質體接觸時，通過靜電吸附作用發生結合，在脂質體表面形成一層保護層，在增大其粒徑的同時，中和脂質體表面原有的負電荷，使其帶一定量的正電荷[13]。果膠再次修飾后的P-C-L的平均粒徑為306.25±0.8 nm，電位值為28.41±0.61 mV，這可能是帶負電荷的果膠通過靜電相互作用與殼聚糖發生絡合，一方面中和了C-L上的部分正電荷，降低了粒子的帶電性，另一方面由于相互結合使殼聚糖層致密，而使其粒徑略微降低[14-15]。

同種脂質體不同溫度加熱處理的比較分析結果顯示，隨著加熱溫度的升高，3種脂質體的平均粒徑均有不同程度的增加。其中：L經60～80 ℃加熱處理后，粒徑變化不大，不同處理溫度間不存在顯著性差異；但經90～100 ℃加熱處理后粒徑有所升高。對于C-L樣品，60，70和80 ℃加熱處理組間不存在顯著性差異，≥90 ℃加熱處理可使其粒徑有所增加，且加熱溫度越高，粒徑增大幅度越大。而不同溫度加熱處理對P-C-L的粒徑影響較大，≤70 ℃加熱處理對其粒徑影響較小，而高溫加熱（≥80 ℃）將引起P-C-L粒徑增大，且粒徑大小與溫度高低呈正相關。綜上，3種脂質體的粒徑熱穩定性為L＞C-L＞P-C-L。課題組前期研究發現，修飾脂質體的形成機制主要為靜電相互作用及氫鍵相互作用，皆為非共價相互作用，修飾層與脂質體間及修飾層間結合力較弱。較高溫度的處理可能會破壞修飾層間及修飾層與脂質體間的相互作用，使修飾層較為松散，而引起粒徑增大[16]。

Zeta電位的絕對值和懸著液的穩定程度密切相關，一般來說，Zeta電位絕對值越大，微粒間排斥力越大，可有效抵抗粒子間的聚集，提高體系的穩定性；相反，體系的Zeta電位數值越低，粒子之間的吸引力越大，粒子間容易出現聚集，甚至產生沉淀現象，體系穩定性較小[17]。

圖2為不同溫度加熱30 min后樣品的Zeta電位值變化情況。結果顯示，經不同溫度處理3種脂質體的電位值雖有起伏，但差異不大，即加熱并未改變粒子的表面電位大小。

圖2 脂質體經不同溫度加熱30 min后的平均電位

為進一步評價脂質體的熱穩定性，此次試驗考察了80 ℃水浴加熱不同時間（5，15，30，45和60 min）對3種脂質體穩定性的影響。結果表明，L和C-L的平均粒徑在整個加熱時間范圍內變化不大，相同樣品在不同時間不存在顯著性差異。加熱處理會使P-C-L粒徑顯著提高。圖3顯示，加熱5 min后其粒徑比未加熱前增大75 nm，但在加熱30 min內樣品的粒徑間差異不顯著。當加熱時間延長至45 min時，粒徑有所降低，而更長時間的加熱（60 min）可能引起P-C-L修飾層松散程度較為嚴重，而導致平均粒徑大幅度升高。

圖3 脂質體經80 ℃加熱不同時間后的平均粒徑

從圖4可以看出，隨著加熱時間的延長，3種脂質體的Zeta電位均出現一定的起伏，但差異性不大，與新制備的樣品相比也基本無差異。綜合粒徑結果可得知，L和C-L的80 ℃熱穩定性較好，但熱處理會引起修飾層松緊性改變而導致P-C-L粒徑整體增大，但并未引起P-C-L粒子間的聚集及結構的改變。

圖4 脂質體經80 ℃加熱不同時間后的平均電位

2.2 冷凍穩定性

從圖5可發現，凍融處理會引起脂質體粒徑增大。經過第1次凍融后，L和C-L的粒徑與新鮮樣品差異不大，但P-C-L的平均粒徑顯著增大，其外觀則從澄清的淡黃色液體變為黃色懸濁液，并出現明顯的沉淀聚集物。隨著凍融次數的增加，所有樣品的粒徑都有所增大，其中以C-L樣品增速最為緩慢，經過5次凍融處理后，粒徑增大87 nm；對于常規脂質體，2～4次凍融處理后樣品間不存在顯著性差異，經過5次凍融處理后平均粒徑增至（324±1.7）nm，比新制備樣品增大177 nm；而P-C-L隨著凍融處理次數的增加，聚集沉淀程度加劇，甚至高達21 μm，不適于進行粒徑的測定，因此圖5未顯示。

圖5 脂質體樣品在反復凍融下的平均粒徑

電位結果如圖6所示。經過一次凍融處理后，C-L和P-C-L的電位值顯著降低，反復多次凍融對C-L的電位值影響較小，P-C-L的電位雖有波動，但不存在顯著性差異。對于修飾脂質體，聚合物間以及聚合物與脂質體間的相互作用源于靜電相互作用、氫鍵相互作用，都屬于非共價相互作用，結合力較弱。外加試驗所采用的冷凍過程為慢速凍結，冰晶形成過程較慢，在冰峰由外向內遷移過程中破壞了修飾層間以及修飾層與脂質體表面的相互作用，導致修飾層脫落，影響了粒子的界面電位[18]。

圖6 脂質體樣品在反復凍融下的平均電位

2.3 pH穩定性

經測定發現新制備的常規脂質體pH接近中性，而兩種修飾脂質體的pH呈酸性。調整體系pH后，3種脂質體樣品的平均粒徑和電位值如圖7和圖8所示。常規脂質體的平均粒徑受pH的影響較小，而pH變化對C-L及P-C-L的粒徑大小影響較大，C-L的粒徑在pH 7時快速增加到893.9±10.4 nm。P-C-L的平均粒徑在不同pH條件下差異顯著，其中以pH 7時粒徑最大（P＜ 0.05）。在整個pH區間，L的粒徑的變化較小。有研究表明脂質體結構受pH變化的影響較小，幾乎不會被破壞，這可能是由于脂質體中的磷脂和膽固醇自身的結構特性以及它們之間通過氫鍵結合的方式，在一定程度上維持了脂質體結構的穩定性，pH的改變對其結構基本不造成破壞[16]。

圖7 脂質體樣品在不同pH下的平均粒徑

圖8 脂質體樣品在不同pH下的平均電位

而對于修飾脂質體而言，C-L的形成主要是利用殼聚糖分子中帶正電荷的氨基與磷脂分子中帶負電的磷酸基團之間的靜電相互作用產生；而P-C-L則再由帶負電果膠分子中的羧基與帶正電殼聚糖中的氨基通過氫鍵及靜電相互作用實現[19]。殼聚糖作為一種陽離子的多糖，在低pH條件下易溶解，且帶正電荷，但當pH大于5時，則溶解性下降，甚至沉淀析出；果膠作為一種陰離子多糖，分子中的羧基電離后帶一定量的負電荷，在堿性環境下具有較高的溶解度，但在酸性條件下易于析出，pH的改變會影響二者的帶電性和溶解性，從而影響二者以及殼聚糖與脂質體間的相互作用，進而影響修飾脂質體的修飾層的緊密度及粒徑大小。調節pH后，常規脂質體的表面帶電狀態發生了變化，加劇了脂質體體系的不穩定，常規脂質體樣品的表面電荷絕對值變小，兩種修飾脂質體樣品的平均粒徑和Zeta電位也劇烈變化。尤其是在pH 5以后，修飾脂質體的粒徑明顯升高，可能是調節pH后，在pH 7的條件下殼聚糖和果膠的之間的靜電相互作用會因為殼聚糖的溶解度下降甚至沉淀析出而變弱，使修飾脂質體相互粘結聚集，粒徑變大。而在pH 3的條件下，P-C-L粒徑增大，可能與果膠的溶解度下降有關。

3種脂質體在pH 7條件下的貯藏穩定性結果如圖9和圖10所示。可以看出，隨著貯藏時間的增加，3種脂質體的粒徑均有不同程度的增大。L的粒徑在37 ℃ pH 7的條件下1～3 d內無明顯增加，但在第6天增幅明顯，并出現顯著性差異；在6～15 d內粒徑有一定程度的改變，但隨著貯藏時間的增加，粒徑并沒有顯著性差異。推測可能是儲藏期間，在較高溫度下，磷脂分子的動能增大，脂質體膜的流動性增強，體系發生了粒子的聚集或融合現象，導致粒徑增大。C-L的粒徑隨著時間的延長呈現顯著性升高現象，并伴隨電位持續性降低，說明在37 ℃ pH 7的條件下C-L的穩定性較差。P-C-L的粒徑在6～9 d時顯著增大，但在＞9 d時，未表現出顯著性差異。圖10顯示，在整個貯藏期，3種脂質體的電位雖有波動，但差異性不顯著，且呈整體下降趨勢，分析原因可能是3種脂質體中的主要膜材磷脂易于氧化，37 ℃下產生的酸性氧化產物吸附在粒子表面，提高了其電負性。有研究報道殼聚糖具有抗氧化活性，且殼聚糖修飾可以提高脂質體的貯藏穩定性[20]，但因試驗是在pH 7環境條件下，殼聚糖溶解性低引起的P-C-L及C-L失穩，導致其對體系的維穩方面未表現出明顯優勢。3種脂質體在不同pH條件下的貯藏穩定性有待進一步驗證。

圖1 脂質體經不同溫度加熱處理30 min后的平均粒徑

圖9 脂質體樣品在37 ℃，pH 7下貯藏15 d的平均粒徑

圖10 脂質體樣品在37 ℃，pH 7下貯藏15 d的平均電位

3 結論

此次試驗以平均粒徑及Zeta電位為主要評價指標對常規脂質體、殼聚糖修飾脂質體和果膠-殼聚糖多層修飾脂質體的溫度穩定性、凍融穩定性以及pH穩定性進行了系統考察。結果表明：常規脂質、殼聚糖修飾脂質體具有較好的熱穩定性，能耐80 ℃長時間加熱，而果膠-殼聚糖修飾脂質體的耐受溫度較低，高溫加熱易引起粒徑變大，但未改變其結構特性；殼聚糖修飾脂質體具有最佳的凍融穩定性，其次為常規脂質體；常規脂質體的pH穩定性優于修飾脂質體，pH的改變會影響聚合物的溶解度，從而改變其聚合物修飾的粒徑大小及界面電位，修飾脂質體在37 ℃ pH 7的條件下貯藏穩定性較差。