黑果腺肋花楸分級提取物成分分析及抗氧化活性比較

楊麗婷，趙珊，李明玉，楊薇潼，鄭志強，符群,

1. 東北林業大學（哈爾濱 150040）；2. 黑龍江省植物資源利用重點實驗室（哈爾濱 150040）；3. 軍事科學院系統工程研究院軍需工程技術研究所（北京 100010）

21世紀以來，世界人口年齡結構發生改變，老年人口比例不斷增大，人口老齡化成為多數國家都面臨的難題[1]；與此同時，不健康的生活方式和社會飛速發展帶來的環境污染、電離輻射等影響，使疾病的年輕化程度也逐漸增加[2-3]。機體自然氧化和受到外界干擾均會產生活性氧，其在高濃度時對細胞組織具有損傷作用，從而可誘導多種疾病發生。抗氧化劑能夠清除活性氧，進而可以緩解甚至避免氧化應激相關疾病，保護細胞功能和生物系統[4]。因此，隨著人們健康保健意識加強，抗氧化研究被社會廣泛關注。

黑果腺肋花楸又名黑澀石楠、黑果花楸，原產于北美，由20世紀90年代引入我國[5]。它是集食用、藥用、景觀、生態、經濟五大價值于一體的小型漿果[6]，我國在2018年將其列入新食品原料名錄[7]。其果實中含有大量的多酚、多糖、黃酮等活性物質[8]，具有抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血糖血脂[12]等多重功效。作為清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑[13]，原花青素在花楸果中的含量在已知植物果實中居于前位。

將對黑果花楸果實分級提取后的五相提取物進行主要活性成分分析，測定其多酚、黃酮、多糖、原花青素含量，并以VC為對照，分別評價此五相提取物對DPPH·、ABTS+·以及·OH這3種自由基的清除能力，旨在為黑果花楸果實相關功能性產品的開發提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富康源1號（遼寧省鞍山市岫巖縣黑果腺肋花楸繁育基地）。

沒食子酸標準品（≥98%）、蘆丁標準品（≥98%）、葡萄糖標準品（≥99.5%）、兒茶素標準品（≥98%）、DPPH（≥98%）、abts、抗壞血酸（≥98%）、石油醚（沸程40～60 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、福林酚試劑、香草醛等（分析純）。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RT-6000酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；BSA224S-CW電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花楸果分級提取物的制備

1.3.1.1 粗提物的制備

花楸全果經清洗、粉碎打漿，低溫烘干后粉碎，過孔徑0.25 mm篩，備用。粗提物的制備采用超聲波輔助有機溶劑浸提法，45 ℃條件下，用體積分數80%的乙醇按料液比1∶20（g/mL）、超聲波380 W輔助提取60 min，取上清液，旋轉蒸發去除有機溶劑，得粗提物，即乙醇提取物（H-1）。

1.3.1.2 分級萃取

將乙醇提取物H-1，用10倍體積蒸餾水溶解，按溶劑極性由小到大順序（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）依次進行萃取（多次萃取至每種溶劑萃取至接近澄清無色時，換下一種溶劑萃取，每次均按體積比1∶1加入溶劑）。得石油醚提取物（H-2）、乙酸乙醇提取物（H-3）、正丁醇提取物（H-4）和水提取物（H-5），將各提取物冷凍干燥備用。

1.3.2 分級提取物活性成分的含量測定

分別對各級提取物，以比色法測定多酚、黃酮、多糖、原花青素成分含量。

1.3.2.1 多酚標準曲線的繪制及含量的測定

多酚標準曲線的繪制。采用Folin-Ciocalteu法，參考張文婷等[14]的方法和GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[15]并略作修改。取0，0.1，0.2，0.8，1.6，2.0 mL 1 mg/mL沒食子酸標準溶液定容至25 mL，各取0.5 mL，依次加入2.5 mL質量分數10%的福林酚試劑，7 mL質量分數7.5%飽和Na2CO3溶液，室溫避光反應30 min，測定760 nm處吸光度。得沒食子酸標準曲線y=0.010 9x+0.005 2，R2=0.999 2。

含量的測定。取供試品同標準曲線繪制操作，測得的樣液吸光度代入沒食子酸標準曲線方程可得出樣液中多酚含量。樣品中多酚（以沒食子酸計）的含量X（%），按式（1）計算。

式中：X1為樣品中多酚含量，%；C1為樣液中多酚質量濃度，μg/mL；V1為樣液體積，mL；N1為稀釋倍數；M1為樣品質量，g。

1.3.2.2 黃酮標準曲線的繪制及含量的測定

黃酮標準曲線的繪制。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，參照周慧恒等[16]的方法。取0，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL 0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，依次加8 mL水、1.0 mL質量體積比50 g/L NaNO2溶液，反應10 min，加入1.0 mL質量體積比100 g/L的Al(NO3)3溶液，反應10 min，加入4.0 mL質量體積比200 g/L的NaOH溶液，并加水定容至25 mL，反應15 min，測定510 nm處吸光度。得蘆丁標準曲線y=0.012x+0.000 6，R2= 0.999 6。

含量的測定。取供試品同標準曲線繪制操作，測得的樣液吸光度，代入蘆丁標準曲線方程得出樣液中黃酮的含量。樣品中黃酮（以蘆丁計）的含量X（%），按式（2）計算。式中：X2為樣品中黃酮含量，%；C2為樣液中黃酮質量濃度，μg/mL；V2為樣液體積，mL；N2為稀釋倍數；M2為樣品質量，g。

1.3.2.3 多糖標準曲線的繪制及含量的測定

多糖標準曲線的繪制。采用硫酸-苯酚法，參照錢驊等[17]的方法。取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 0.106 5 mg/mL葡萄糖標準液并定容至1 mL后，依次加入1 mL質量分數5%的苯酚溶液，5 mL濃H2SO4溶液，搖勻室溫反應30 min，測定490 nm處吸光度。得葡萄糖標準曲線y=0.050 8x+0.002 8，R2=0.999 1。

含量的測定。取供試品同標準曲線繪制操作，測得的樣液吸光度，代入葡萄糖標準曲線方程可得出樣液中多糖的含量。樣品中多糖（以葡萄糖計）含量X（%），按式（3）計算。

式中：X3為樣品中多糖的含量，%；C3為樣液中多糖的質量濃度，μg/mL；V3為樣液體積，mL；N3為稀釋倍數；M3為樣品質量，g。

1.3.2.4 原花青素標準曲線的繪制及含量的測定

原花青素標準曲線的繪制。采用濃鹽酸-香草醛法，參照紀秀鳳等[18]的方法。取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 1 mg/mL兒茶素標準溶液并定容至1 mL后，依次加入6 mL質量體積比5 mg/mL香草醛-甲醇溶液和3 mL濃HCl溶液，30 ℃水浴避光反應1 h，測定500 nm處吸光度。得兒茶素標準曲線y=0.004 9x+ 0.002 6，R2=0.999 8。

含量的測定。取供試品按標準曲線繪制同操作，測得的樣液吸光度，代入兒茶素標準曲線方程可得出樣液中原花青素的含量。樣品中原花青素（兒茶素計）含量X（%），按式（4）計算。

式中：X4為樣品中原花青素含量，%；C4為樣液中原花青素質量濃度，μg/mL；V4為樣液體積，mL；N4為稀釋倍數；M4為樣品質量，g。

1.3.3 分級提取物體外抗氧化活性的測定

將分級提取物和VC標準品分別配制成適宜的不同濃度梯度，通過對DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率測定，對分級提取物的體外抗氧化活性進行評價。

1.3.3.1 DPPH·的清除能力

參照黎英等[19]的方法，并稍作修改。取3支試管，1號試管為2.0 mL待測液+2.0 mL DPPH-乙醇工作液，記為A1i；2號試管（樣品對照）為2.0 mL待測液+2.0 mL無水乙醇，記為A10；3號試管（空白對照）為2.0 mL無水乙醇+2.0 mL DPPH-乙醇溶液，記為A1j。避光反應30 min，離心后取上清液，以無水乙醇為參比并以VC做對照，測定517 nm處吸光度，按式（5）計算。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力

參照張乃珣等[20]的方法，并稍作修改。取3支試管，1號試管：0.1 mL待測液+1.9 mL ABTS工作液，記為A2i；2號試管（樣品對照）：0.1 mL待測液+1.9 mL無水乙醇，記為A2j；3號試管（空白對照）：0.1 mL無水乙醇+1.9 mL ABTS工作液，記為A20。搖勻避光反應6 min，以無水乙醇為參比并以VC做對照，測定734 nm處吸光度，按式（6）計算。

1.3.3.3 ·OH 清除能力

參照李瑞光等[21]的方法，并稍作修改。取3支試管，1號試管為1 mL待測液+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸-乙醇溶液+1 mL H2O2，記為A3i；2號試管（樣品對照）為1 mL待測液+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸-乙醇溶液+1 mL無水乙醇，記為A3j；3號試管（空白對照）為1 mL無水乙醇+1 mL FeSO4+1 mL水楊酸-乙醇溶液+1 mL H2O2，記為A30。搖勻避光反應6 min，以無水乙醇為參比并以VC作為對照，測定510 nm處吸光度，按式（7）計算。

1.4 試驗結果統計分析

試驗均平行3次，數據取平均值±標準偏差表示，試驗數據統計分析采用Excel 2016軟件和SPSS 26.0軟件，采用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 分級提取物活性成分含量的測定

為研究不同極性的花楸果有機溶劑提取物中標志性活性成分含量與其抗氧化活性關系，采用不同極性有機溶劑對花楸果依次進行萃取，并對不同極性提取物中的標志性活性成分含量進行測定。其中，不同極性提取物中活性成分含量如圖1所示。結果表明，多酚含量為H-1＞H-3＞H-4＞H-5＞H-2；黃酮含量為H-4＞H-3＞H-1＞H-2＞H-5；多糖含量為H-5＞H-4＞H-1＞H-3＞H-2；原花青素含量為H-4＞H-1＞H-3＞H-5＞H-2。總體來看，正丁醇提取效果最佳，各活性成分含量均較高，石油醚相提取效果最差，各活性成分含量均為最低。這可能與各活性成分的極性大小及有機溶劑的極性大小存在一定關系，具體原因尚有待驗證。

圖1 5種分級提取物活性成分含量

2.2 分級提取物體外抗氧化活性評價

2.2.1 DPPH·清除能力評價

DPPH法是廣泛應用于評價天然物質抗氧化效果的方法之一，在含氫天然抗氧化物質存在下，DPPH被還原為DPPH-H，從而導致溶液發生褪色[22]。圖2、3為分級提取物對DPPH自由基清除能力結果。由圖2和圖3可知，以VC為陽性對照，在0～10 mg/mL質量濃度范圍內，花楸果的分級提取物均對DPPH自由基具有較好清除能力，且清除率均隨著分級提取物質量濃度的增加而增加。清除DPPH自由基的IC50分別為：H-1 0.191 0±0.016 8 mg/mL、H-2 2.785 7±0.328 0 mg/mL、H-3 0.177 3±0.017 0 mg/mL、H-4 0.127 7± 0.011 2 mg/mL、H-5 1.152 3±0.158 9 mg/mL、VC對照組0.017 0±0.001 0 mg/mL。IC50隨著清除能力升高而降低，因此分級提取物對DPPH自由基清除能力的大小順序為VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

圖2 分級提取物對DPPH自由基的清除作用

圖3 石油醚提取物對DPPH自由基的清除作用

2.2.2 ABTS+·清除能力評價

ABTS+·被氧化可形成穩定的藍綠色自由基，加入具有抗氧化能力的樣品時，溶液會發生褪色[23]。圖4和圖5為分級提取物對ABTS+·的清除結果。以VC為陽性對照，在質量濃度0～20 mg/mL范圍內，花楸果分級提取物對ABTS自由基清除能力均隨著分級提取物質量濃度的增加而提高。清除ABTS自由基的IC50分別為H-1 0.618 3±0.064 7 mg/mL、H-2 3.093 7±0.222 9 mg/mL、H-3 0.298 7±0.020 0 mg/mL、H-4 0.179 7± 0.004 0 mg/mL、H-5 1.590 7±0.156 3 mg/mL、VC對照組0.066 7±0.004 0 mg/mL。依據分級提取物的IC50，得分級提取物對ABTS自由基清除能力的大小順序依次為VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

圖4 H-4、H-3、H-1對ABTS自由基的清除作用

圖5 H-5、H-2對ABTS自由基的清除作用

2.2.3 ·OH 清除能力評價

·OH是對生物體危害最大的一種自由基，可使蛋白質、核酸等物質發生氧化和損傷，導致細胞壞死或突變，被廣泛應用于測定樣品的抗氧化能力[24]。分級提取物對羥自由基的清除結果如圖6和圖7所示。以VC為陽性對照，在質量濃度0～40 mg/mL范圍內，花楸果的分級提取物均對羥自由基具有一定清除能力，且清除率隨著分級提取物質量濃度增加而增加，基本呈正相關趨勢。分級提取物清除·OH的IC50分別為H-1 6.054 0±0.005 7 mg/mL、H-2 7.131 0±1.108 7 mg/mL、H-3 4.587 7±0.288 7 mg/mL、H-4 0.994 7± 0.035 5 mg/mL、H-5 7.117 0±0.246 0 mg/mL、VC對照組0.227 0±0.007 5 mg/mL。因此分級提取物對羥基清除能力的大小順序為VC＞H-4＞H-3＞H-1＞H-5＞H-2。

圖6 分級提取物對羥自由基的清除作用

圖7 H-2對羥自由基的清除作用

3 結論

5種黑果腺肋花楸果實不同極性的提取物對DPPH、ABTS、羥自由基均體現出一定的清除能力，且不同極性部位的抗氧化活性差別較大，但其抗氧化能力均低于VC，這與宋健剛[25]研究結果不太一致，可能是試驗所用提取方法及有機溶劑不同導致。正丁醇提取物具有較好的體外抗氧化能力，對3種自由基的清除能力均為最強，其次是乙酸乙酯提取物和乙醇提取物，水提取物略低，石油醚提取物清除效果最弱。分級提取物的體外抗氧化活性可能與多酚、黃酮、多糖、原花青素的含量有關，正丁醇提取物中活性成分含量均較高，其體外抗氧化活性最優，這與高凝軒等[26]、劉靜等[27]、滕飛[28]、劉玉婷等[29]的研究結果基本一致。

從研究結果來看，乙醇提取物中多酚含量為5種提取物中最高，為174.970 0±1.047 2 mg/g，但其抗氧化能力僅居第3位；水相提取物中多糖含量最高為172.924 0±2.009 0 mg/g，但其自由基清除能力位列第4位；乙酸乙酯提取物各個活性成分含量均居于中位，尤其是原花青素含量（29.450 0±0.014 2 mg/g）和黃酮含量（15.796 0±0.025 9 mg/g）較為靠前，其自由基清除能力位于第2位，而正丁醇提取物中黃酮（17.700 0±0.029 1 mg/g）及原花青素含量（57.958 0± 0.242 2 mg/g）位于首位，正丁醇提取物的體外抗氧化能力亦為最強。因此，正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物可能是黑果腺肋花楸果實抗氧化的主要活性部分，且黑果腺肋花楸果實提取物抗氧化能力應為多種活性成分共同作用的結果，且可能與原花青素含量和黃酮含量相關性較強。試驗尚未對花楸果分級提取物抗氧化能力與活性單體成分的含量進行相關性分析，會在后續研究進行細化補充。

綜上，黑果腺肋花楸果實不同極性提取物中體現出活性成分分布的顯著差異，黑果腺類花楸果實正丁醇提取物及乙酸乙酯提取物活性成分含量相對較高，抗氧化作用相對較強，因此可將2種提取物作為研究重點，進一步分離篩選其抗氧化活性的主要成分。本研究在促進林下經濟發展、滿足林區經濟轉型發展內涵[30]的同時，指導了有別于傳統加工的產業模式探索，更好地為黑果腺肋花楸作為天然抗氧化劑應用于食品藥品研發、按需加工、延長產業鏈、實現全果的高附加值開發提供理論基礎。