辣木籽總黃酮提取工藝

侯真真，謝曉帆，李瑞婷

廣州工商學院（廣州 510850）

辣木為多年生熱帶落葉喬木，原產于熱帶和亞熱帶地區，在我國云南、廣西等地區已有種植，因其根具有辛辣味而得名。辣木籽是辣木的種子，是徑約8 mm的橢圓性球狀物體，去殼呈白色，可直接食用，富含脂肪、蛋白質、維生素、礦物質、黃酮及多酚等化合物，具有降血壓、抗氧化、抗癌等多種生物活性功能，是一種新資源食品，具有一定的研究價值。由于辣木獨特的抗菌及絮凝屬性，辣木籽也被廣泛應用于水質凈化處理。此外，辣木籽是化妝美容產品、新能源柴油的潛在優質原料之一[1]。

黃酮類化合物，又稱黃酮體、黃堿素，對防治肝病，防癌抗癌，抑制肥胖，預防基因突變，治療冠心病、心絞痛、高血壓，活血化癖也起重要藥理活性作用[2]。辣木籽中的黃酮類化合物豐富，主要以結合形式存在，具有抗腫瘤、降血糖、護肝殺蟲、減肥降脂、活血化瘀等作用[3]。近年來，辣木籽被指定為國家新資源食品開發的原材料，具有較大開發潛力和前景。因此，研究辣木籽中黃酮類化合物的提取工藝具有重要的意義。研究采用超聲波輔助提取辣木籽中黃酮類化合物，并進行工藝優化，以期為辣木籽的進一步開發利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，市售；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；蘆丁標準品（西安匯林生物科技有限公司）；六水合三氯化鋁（分析純，西隴科學化工）。

1.2 儀器與設備

MS204S電子天平（右一儀器有限公司）；UV-2450數顯紫外分光光度計（連華科技有限公司）；DL-5-B臺式高速離心機（安亭科學儀器廠）；BDA-1002超聲震蕩器（微米派科技有限公司）。

1.3 工藝流程

原生態辣木籽→去殼→干燥（60 ℃熱風烘干）→粉碎過篩（0.250 mm篩）→稱取2 g干粉→加入一定量乙醇→超聲波輔助提取→水浴→離心機過濾→取上清液→加入三氯化鋁顯色→定容→測定總黃酮含量

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品的制備

辣木籽總黃酮粗品制備：在60 ℃鼓風箱烘干一定時間至恒重，粉碎過0.180 mm分子篩，制得辣木籽粉末，將粉末置于干燥器中備用[4]。

1.4.2 蘆丁標準曲線的繪制

取蘆丁標準品烘干28 h至恒重，待用。將0.022 1 g蘆丁標準品放入50 mL容量瓶中，用40%的乙醇配制0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。吸取0.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10 mL蘆丁標準溶液加入25 mL容量瓶中，加入2.5 mL 2%三氯化鋁，再用40%的乙醇進行定容，搖勻，靜置25 min。測定提取液在400 nm波長處的吸光度，記錄結果并繪制標曲。求得回歸曲線方程：A=0.265 1C+0.002 6（0.993 8）。其中，蘆丁標準液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標。

1.4.3 試驗步驟

取2 g烘干至恒重的辣木籽粉末，加入體積分數為40%的乙醇，再經過不同的超聲波時間、水浴鍋溫度、提取次數、乙醇體積分數、料液比的條件處理，靜置15 min使其冷卻，取上層清液（使用4 000 r/min離心20 min），提取一定量待測溶液進行顯色反應。

其中，單因素設定：超聲波提取時間為20，30，40，50和60 min；料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）；水浴鍋溫度為30，40，50，60和70 ℃；乙醇體積分數為40%，50%，60%，70%和80%；離心提取次數為1，2，3，4和5次。按照設定條件分別進行試驗，提取最適宜條件，再通過3次平行試驗進行驗證。

1.4.4 響應面優化試驗

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件，將單因素試驗的最優結果與Box-Behnken中心組合試驗相結合，分別選取料液比（A）、乙醇體積分數（B）以及超聲時間（C）3個自變量，以辣木籽中總黃酮得率為響應值進行響應面優化試驗，因素與水平見表1。

表1 因素水平表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲提取時間對辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在水浴鍋溫度50 ℃，料液比1∶10（g/mL）的固定條件下，超聲提取時間分別設置為20，30，40，50和60 min，不同超聲提取時間對黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 超聲提取時間變化對辣木籽黃酮提取率的影響

由圖1可知，超聲提取時間以50 min為分界點，起初辣木籽黃酮得率不斷上升，在超過50 min時，趨勢才呈現下降。這種情況是因為當超聲時間過短時，辣木籽中的黃酮類物質溶解較少，析出率低；但隨著時間的增加，超聲波的空化作用及機械振動作用導致細胞膜破裂，因此提取率上升[4]。但當超聲時間超過50 min時可能導致辣木籽細胞內其他物質析出，影響總黃酮的純度。同時，長時間的提取也會導致少量乙醇揮發，從而降低總黃酮的得率。綜上所述，超聲提取時間為50 min時提取效果最好。

2.1.2 料液比對辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在超聲波時間為30 min，提取溫度為50 ℃的固定條件下，料液比分別設置為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL），不同料液比對黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 料液比變化對辣木籽黃酮提取率的影響

隨著乙醇用量的不斷增多，乙醇充分溶解了辣木籽中的黃酮類物質，最佳溶解狀態是料液比1∶10（g/mL）。之后再不斷增加液料比，辣木籽中黃酮類物質的得率反而出現波動式下降趨勢，可能是固液比的增多使黃酮類物質充分溶解的同時，還會導致一些其他雜質成分析出，影響黃酮物質的純度，從而使總黃酮提取率降低，因此最佳料液比為1∶10（g/mL）。

2.1.3 提取溫度對辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取劑，在料液比1∶10（g/mL），超聲時間30 min的條件下，提取溫度分別設置為30，40，50，60和70 ℃，提取溫度的變化對黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度變化對辣木籽黃酮提取率的影響

由圖3可知，在初始階段，溫度過低不利于辣木籽內部物質的析出，提取率不高。隨著溫度的升高，溶劑分子運動加劇，黃酮提取率也不斷升高，在50 ℃時達到最大值，這是由于黃酮類化合物在乙醇中的溶解度隨溫度的升高而增加，隨著溫度升高，擴散系數增大，提取劑的滲透能力也相應增強，使有效成分浸出速率增大[5]。此時辣木籽物料內部得到充分沸騰，強化了傳質過程，使提取效果達到最佳。溫度超過50 ℃時，提取率開始下降，這是由于乙醇的沸點是78 ℃，當溫度不斷升高接近至沸點時，乙醇揮發影響黃酮的提取。綜合考慮，選取50 ℃為最佳提取溫度。2.1.4 乙醇體積分數對辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，在超聲時間30 min，料液比1∶10（g/mL），提取溫度50 ℃的條件下，乙醇體積分數分別設置為40%，50%，60%，70%和80%，乙醇體積分數的變化對辣木籽中的總黃酮提取率的影響如4所示。

由圖4可知，乙醇體積分數在40%～70%的范圍內時，辣木籽總黃酮的提取率與乙醇體積分數呈正比，在體積分數為70%時提取率最高，超過70%之后，提取率隨體積分數上升而下降，可能是乙醇體積分數升高導致少量醇溶性物質析出，從而影響辣木籽中黃酮物質的溶解度[6]。因此，選取體積分數70%乙醇為提取劑。

圖4 乙醇體積分數變化對辣木籽黃酮提取率的影響

2.1.5 離心次數對辣木籽總黃酮提取率的影響

采用超聲波輔助水浴法，以40%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶10（g/mL），超聲時間30 min，提取溫度50 ℃的條件下，離心次數分別設置為1，2，3，4和5次，不同離心次數對辣木籽中的總黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 提取次數變化對辣木籽黃酮提取率的影響

從圖5可以看出，離心次數對黃酮提取率有一定影響，隨著離心次數的增加，黃酮物質析出率也不斷增加，在第5次時取到最大值[7-8]。可能是因為相對一定量的提取溶劑，其所能溶解的黃酮類化合物的量是相對應的，但隨著離心次數的增加，得到的上清液雜質較少，檢測到的黃酮物質也隨之增多。

2.2 響應面優化辣木籽總黃酮提取條件

2.2.1 響應面優化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，設置料液比、乙醇體積分數、超聲時間3個因素進行響應面設計，具體結果見表2。

表2 響應面試驗方案及結果

2.2.2 回歸方程建立及模型方差分析

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件，對表2進行擬合后，得到總黃酮含量（Y）的二次回歸方程：Y=8.64-0.99A+3.37B+0.86C-0.91AB+1.80AC+0.63BC-1.45A2- 2.57 B2-1.32 C2，檢驗結果見表3。

表3 響應面試驗方差分析及顯著性檢驗

由表3可知，失擬=0.381 4（P＞0.05）不顯著，說明該模型具有較高擬合度和可信度，使用該方程進行試驗分析是可行的。F=43.73，P＜0.01，由此可得該模型極為顯著。料液比與乙醇體積分數交互為0.028 3（P＜0.05），差異高度顯著；料液比與超聲時間交互為0.000 9（P＜0.01），差異極顯著；乙醇體積分數與超聲時間交互為0.095 9（P＜0.05），差異顯著。采用Design-Expert 8.0.6軟件建立模型，并將表3中具體數據轉化為3D曲面圖（詳見圖6～圖8）。由表2和表3可知，影響辣木籽中總黃酮得率由高到低的順序為乙醇體積分數（B）＞料液比（A）＞超聲時間（C）。

圖6 料液比與超聲時間的響應面3D模型圖

圖7 乙醇體積分數與料液比的響應面3D模型圖

圖8 乙醇體積分數與超聲時間的響應面3D模型圖

2.2.3 響應面法的可靠性驗證

采用Design-Expert 8.0.6軟件建立模型，通過響應面分析并優化，預測的總黃酮提取率為8.481%，將模型預測的條件取整數：乙醇體積分數76%，料液液比為1∶15（g/mL），超聲波時間為60 min。并對最佳工藝條件進行驗證試驗，得到的辣木籽總類黃酮提取率為8.361%±0.015%，與預測值基本一致，由此可得，該響應面法優化超聲波輔助水浴提取辣木籽總黃酮的工藝較具有一定可行性。

3 結論

試驗運用響應面法優化超聲波輔助水浴法對提取辣木籽總黃酮的工藝優化進行探討。在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，結果表明，料液比、超聲波提取時間、乙醇體積分數對黃酮類化合物提取率的影響最為顯著，且由強到弱依次為乙醇體積分數＞料液比＞超聲波時間。結果表明，以體積分數76.04%的無水乙醇為提取溶液，固液比為1∶15（g/mL），超聲波提取時間為60 min時，辣木籽中的黃酮化合物得率達到最高。在上述條件下，辣木籽總類黃酮提取率可達到8.361%±0.015%，理論值為8.481%，結果與預測值基本一致，證明了模型的有效性，工藝穩定可行。