微生物發酵法脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝優化

陽暉，陳明月，龔乃霞，曹沁倩，張川雨，李昌滿

長江師范學院現代農業與生物工程學院（重慶 408100）

蘿卜紅色素是一種天然色素。它具有安全、無毒的特點，同時還兼具一定的營養價值和藥理作用[1]。但是由于蘿卜在咀嚼或加工過程中內源酶水解硫代葡萄糖苷產生異味，因此現有工藝制備的蘿卜紅色素常帶有異味[2-3]。這種異味成為限制其在食品工業中應用的主要因素，研究蘿卜紅色素的高效脫異味技術迫在眉睫[4]。

基于上述難點，各國研究者對蘿卜紅色素的脫臭工藝進行深入研究。陳亞平等[5]經過酸、酶制劑、穩定劑、調節劑和樹脂處理等過程制得一種產率高、色素保留完全的脫味蘿卜紅色素。陳文田等[6-7]采用酸化有機介質法高效地去除蘿卜色素中的異味。湯川千代樹等[8]研發一種特殊的專用脫臭技術進行除味來獲得可以進行商業化生產的脫味蘿卜紅色素。Rodriguez- Saona等[9]采用一種特殊的設備成功地吸附了蘿卜色素中的異味。除上述方法外，去除異味的方法還包括超臨界二氧化碳萃取法[10-12]、吸附法[13-16]、酶解法[17-19]、沉淀法[20]和膜分離法[21-22]等。但這些方法都存在一些不足。如理化脫味法脫味范圍都較小，脫味率低，脫味后會影響蘿卜紅色素的提取率和穩定性，脫臭效果并不理想。而生物學脫味法可分為酶解法和微生物脫味法，但添加酶制劑成本較高，且不能從根本上脫除異味[23-24]。微生物脫異味效果較好，還有具有操作簡單、成本低廉、不污染環境等優點，是脫除蘿卜色素異味的理想選擇[25]。

試驗選取果酒酵母為發酵菌種，對胭脂蘿卜紅色素中異味進行脫除，并優化脫味工藝，以期獲得一種脫味效果好、色價高、可用于工業化生產的脫除蘿卜紅色素異味的工藝，為擴大蘿卜紅色素的適用范圍奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂蘿卜（涪陵農貿市場）；葡萄酒、果酒專用酵母RW（安琪酵母股份有限公司）；檸檬酸、濃鹽酸（濰坊英軒實業有限公司）；酒石酸（食品級，滕州市香凝生物工程有限責任公司）；乙酸鈉（重慶傅藝化學試劑有限公司）；氯化鉀（成都市科龍化工試劑）。

CX-12000組織破碎機（東莞市南城長協電子制品廠）；H30FK802-136高壓滅菌鍋（東莞市星辰電器貿易有限公司）；ZWY-2102C恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；SB-4200 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RV 10 B S25真空旋轉蒸發儀（廣州市深華生物技術有限公司）；CS101-2ABN電熱鼓風干燥箱（重慶市永生實驗儀器廠）；ZD-F20真空冷凍干燥器（南京載智自動化設備有限公司）；PHS-3C pH計（上海虹益儀器儀表有限公司）；V-1800可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫臭蘿卜紅色素制取的工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 勻漿

將胭脂蘿卜丁、蒸餾水按料液比1∶1（W/W）進行勻漿，備用。

1.2.2.2 調pH、滅菌

用5%檸檬酸將蘿卜勻漿調節pH后，在121 ℃，滅菌30 min。

1.2.2.3 制備菌懸液、接種、發酵

將果酒酵母菌粉和加入10倍無菌水混勻，在30 ℃，活化10～20 min，制備成菌懸液。按一定接種量接種加入到胭脂蘿卜發酵液中，在轉速160 r/min搖床中發酵。

1.2.2.4 超聲提取

在超聲溫度30 ℃、超聲時間40 min、超聲功率400 W條件下進行蘿卜紅色素提取[26]。

1.2.2.5 測定紅色素含量

在最大吸收波長530 nm處測定蘿卜紅色素的含量[27]。

1.2.2.6 旋蒸、凍干

將蘿卜紅色素提取液在轉速120 r/min、溫度35 ℃條件下進行旋轉蒸發，濃縮至黏稠。將濃縮液進行真空冷凍干燥至恒重，得到脫臭型蘿卜紅色素。

1.2.3 單因素試驗

固定酵母菌的接種量1%、初始pH 4.5、發酵溫度26 ℃、發酵時間36 h，考察發酵時間（12，24，36，48和60 h）、發酵液初始 pH（3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、發酵溫度（22，24，26，28和30 ℃）以及酵母菌的接種量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗

根據單因素試驗的結果，選取接種量、發酵時間、發酵溫度、發酵pH對蘿卜紅色素有重要影響的因素，以感官評分為響應值，采用Design Expert 12軟件設計響應面試驗，優化脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝。響應面設計的水平因素見表1。

表1 響應面試驗水平因素表

1.2.5 質量指標測定

1.2.5.1 感官評價

由20名食品專業學生按照表2進行感官評價。

表2 蘿卜紅色素異味的感官評分標準

根據張梓涵等[27]的方法，對蘿卜紅色素的提取量進行測定。量取20 mL蘿卜發酵液B，平均分成2份，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液（pH 1緩沖液：稱取1.86 g氯化鉀、980 mL蒸餾水，攪拌均勻，用濃鹽酸進行pH矯正；pH 4.5緩沖液：稱取32.82 g乙酸銨、960 mL蒸餾水，攪拌均勻，用濃鹽酸進行pH矯正）定容至50 mL，靜置后在最大吸收波長530 nm處測定其吸光度，根據公式計算其色素提取量并進行比較。計算方式見式（1）。

式中：C為色素提取量，mg/g；A0是pH 1.0時色素在530 nm處的吸光度；A1是pH 4.5時色素在530 nm處的吸光度；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數；M為天竺葵素的相對分子量，取值648.5；ε為消光系數，取值30 200）；m為胭脂蘿卜的質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖1所示，發酵溫度極大地影響脫異味的效果。這是由于蘿卜紅色素的主要異味物質來源是蘿卜中硫代葡萄糖苷化合物的分解代謝產物，如3-丁烯-1-異硫氰酸酯、3-（甲硫基）-丙基異硫氰酸酯和4-（甲硫基）-3-丁烯基異硫氰酸酯等[28]。在適宜的發酵溫度范圍內，酵母菌在代謝過程中，減少了這些異味物質的產生，因此降低了蘿卜紅色素中的異味。隨著溫度逐漸升高，蘿卜紅色素的異味呈先減少后增加趨勢，發酵溫度26 ℃時，感官評價分數最高。在一定范圍內，發酵溫度對蘿卜紅色素提取率的影響不大（P＜0.05）。發酵溫度為24 ℃時，蘿卜紅色素的提取量最高，為0.026 mg/g。僅比對照組相差0.000 4 mg/g。綜上所述，從資源利用度方面綜合考慮，選擇溫度24，26和28 ℃進行響應面優化試驗。

圖1 發酵溫度對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量影響

2.1.2 發酵時間對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖2所示，發酵時間12 h時，紅色素提取量比對照組的提取量略有增加，為0.028 8 mg/g，其原因是在這個階段處于發酵的初始階段，不但不會引起紅色素的降解，反而有利于紅色素從蘿卜細胞中的溶出。發酵時間36 h時，感官評分達到最高值，為7.5分。發酵時間超過36 h，感官評分逐漸降低，發酵液中出現新異味，這可能是酵母過度發酵，產生新的發酵產物所致。另外，低糖濃度及其降解副產物會降低花青素穩定性，并形成棕色聚合物；高糖濃度可能會降低水分活性，從而對花青素的活性有保護作用[29]。綜上所述，選擇發酵時間24，36和48 h進行響應面優化試驗。

圖2 發酵時間對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.1.3 發酵液初始pH對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖3所示，當發酵液初始pH 4.5時，感官評定分數和紅色素提取量均達到最高，分別為8分和0.027 3 mg/g。這可能是發酵pH影響了胭脂蘿卜中硫苷酶的活性，黑芥子酶的最適pH為6，研究發現pH下降至3左右時其活性降低70%[11]。發酵液處于低pH時黑芥子酶受到抑制作用和對硫苷的分解，從而影響了蘿卜色素中異味物質的產生。同時，當pH超過4.5時，紅色素的提取量逐漸降低，這可能是花青素結構由穩定的醌式結構逐漸變成無色的不穩定的擬堿式或者查爾酮式形式，導致蘿卜紅色素溶解度下降所致[30]。綜上所述，選擇發酵液初始pH 4.5進行響應面優化試驗。

圖3 發酵液初始pH對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.1.4 接種量對胭脂蘿卜紅色素異味和提取量的影響

如圖4所示，當酵母菌接種量不斷提高時，蘿卜紅色素異味先減少后增加。接種量1%時，感官評價分數最高，為8分。接種量超過1%時，感官評分逐漸降低。這可能是隨酵母菌接種量增大，發酵速率變快，代謝加強，菌種之間競爭激烈，代謝路徑發生改變，影響硫苷分解后的代謝產物種類、含量，增加異味物質的種類和含量；同時，可能酵母菌利用蘿卜中的糖類物質，生產一些新的異味物質。菌種量1.2%時，紅色素提取量最高，為0.023 9 mg/g。綜上所述，選擇接種量0.8%，1.0%和1.2%進行響應面優化試驗。

圖4 接種量對胭脂蘿卜紅色素異味和紅色素提取量的影響

2.2 微生物發酵法脫除胭脂蘿卜紅色素異味的工藝優化

2.2.1 響應面試驗設計及結果

響應面試驗安排及結果見表3。

表3 響應面試驗安排與結果

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

通過Design-Expert 12軟件對回歸模型進行分析，得出擬合回歸方程：感官評分=7.85+0.050A-0.003 333B-0.20C+0.036D-0.30AB-0.12AC-0.36AD-0.25BC-0.056BD-0.13CD-1.08A2-92B2-1.16C2-1.31D2。

由表4可知，對回歸模型進行顯著性檢驗和方差分析。該模型P＜0.01，說明該模型極顯著。失擬項P值為0.106 9＞0.05不顯著，確定系數R2=0.990 5，模型變異系數為2.1%，遠小于10%。說明該模型擬合度較好、可信度高、相關性好，可用于有效預測蘿卜紅色素異味的感官評分變化情況，進而有效驗證工藝的準確性。模型中C、AB、AD、BC、A2、B2、C2、D2均極顯著（P＜0.01），BC顯著（P＜0.05）。從表4中F值可知，各因素對蘿卜紅色素異味的影響順序為：發酵時間（C）＞接種量（A）＞發酵液pH（D）＞發酵溫度（B）。

表4 響應面回歸方程方差分析

接表4

2.2.3 交互作用分析

圖6 接種量和發酵液初始pH的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

圖5～圖7中響應面坡度均較陡峭，等高線呈橢圓形，說明發酵時間與菌種接種量、發酵pH與接種量以及發酵溫度和發酵時間的交互作用均顯著，對感官評分的影響較大。這與方差分析結果一致。

圖5 接種量和發酵時間的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

圖7 發酵時間和發酵溫度的交互作用對胭脂蘿卜紅色素脫臭效果的影響

2.2.4 驗證試驗結果

根據響應面模型預測微生物發酵法脫除蘿卜紅色素異味的最佳工藝參數：菌種接種量1.005%、發酵時間36.071 h、發酵溫度為25.821 ℃、發酵液初始pH 4.507，按此工藝參數制備的蘿卜紅色素的感官評分可達7.854分。考慮到實際操作的簡便性，將試驗方案適當調整為酵母菌接種量1%、發酵時間36 h、發酵溫度25.5 ℃、發酵液初始pH 4.5。按此工藝進行3次平行試驗，感官評分為7.82±3分，與預測值7.854分接近，說明該模型適合紅色素脫臭工藝條件的預測。

2.3 質量評價

2.3.1 感官指標

胭脂蘿卜紅色素異味的感官指標：無胭脂蘿卜異味，酵母發酵味淡；脫臭蘿卜紅色素的色澤鮮艷，與未脫臭的蘿卜紅色素相比較，無明顯差異。

2.3.2 紅色素提取量

在最優脫異味工藝條件下制備的紅色素的提取量達到0.036 3 mg/g，而對照試驗的紅色素提取量為0.037 1 mg/g。由此可見，微生物發酵法不僅可以有效脫異味，而且對蘿卜紅色素的提取量無顯著（P＞0.05）影響。

3 結論

試驗采用果酒酵母發酵脫除胭脂蘿卜紅色素異味。通過單因素試驗和響應面優化試驗，確定脫除蘿卜紅色素異味的最優工藝參數：菌種接種量1%、發酵時間36 h、發酵溫度25.5 ℃、發酵液初始pH 4.5。在此條件下制得的蘿卜紅色素基本無胭脂蘿卜異味，酵母發酵味淡，感官評分是7.82分，紅色素提取量為0.036 3 mg/g，與未脫臭的蘿卜紅色素提取量無顯著差異（P＞0.05）。說明果酒酵母菌發酵不僅能有效脫除蘿卜紅色素中的異味，而且基本不會影響蘿卜紅色素提取量和色澤。試驗建立一種新的減少或消除胭脂蘿卜紅色素的異味方法，為擴大蘿卜紅色素的應用范圍提供技術支持，為蘿卜紅色素的工業化生產提供方法指導和理論基礎。