超聲彈性成像參數在浸潤性乳腺癌診斷中的應用及其與組織NKD1、HER-2表達量的關系

連俊，李苗，伍玉容，梁汝娜

安康市中心醫院超聲科，陜西 安康 725000

浸潤性乳腺癌是發生于乳腺導管上皮及末端導管上皮組織的惡性腫瘤，以乳房腫塊、乳頭疼痛、內陷為常見癥狀。目前多采用超聲等影像學手段進行檢查，但對于微小病變易出現漏診現象。有研究指出，采用超聲彈性成像檢測組織硬度來反映其結構變化，可用于判斷正常組織及病變組織的差別，以達到診斷的目的，或可提高診斷準確度[1]。超聲彈性成像技術的基本原理是對不同硬度組織加以刺激后，會產生不同程度的形變，故可通過觀察組織硬度變化來對腫瘤性質進行鑒別。研究顯示，浸潤性乳腺癌的發生發展過程受多種因素影響，且Wnt 信號通路被認為與多種惡性腫瘤的發生有關[2]。相關報道指出，多種惡性腫瘤均存在Wnt信號通路的異常激活，而裸角質膜同源蛋白(naked cuticle drosophila1，NKD1)是該通路重要的負向調控因子[3]。人表皮生長因子受體-2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)是一種與乳腺癌發生緊密相關的原癌基因，也是該疾病重要的預后和預測性分子標志物。但目前尚無報道明確指出超聲彈性成像參數與浸潤性乳腺癌患者癌組織NKD1、HER-2 表達的關系。本研究旨在探究超聲彈性成像參數在浸潤性乳腺癌診斷中的應用價值及其與癌組織NKD1、HER-2表達量的關系，為該疾病的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年2 月至2021 年6 月安康市中心醫院收治的90 例浸潤性乳腺癌患者作為乳腺癌組，以同期收治的68例乳腺良性腫瘤患者作為對照組。(1)納入標準：①乳腺癌組患者符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2015版)》[4]關于浸潤性乳腺癌的診斷標準，且經病理學檢查確診；②對照組患者符合《乳腺增生與良性腫瘤現代診斷治療學》[5]關于乳腺良性腫瘤的診斷標準；③于術前行超聲檢查；④為單側原發性乳腺腫瘤；⑤患者均知情本研究的研究內容，且已簽署同意書。(2)排除標準：①合并嚴重器質性疾病患者；②術前已接受放化療及生物治療等抗腫瘤治療者；③合并其他惡性腫瘤疾病患者；④既往有胸部手術史者；⑤存在超聲檢查禁忌證者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。乳腺癌組患者年齡31~65 歲，平均(49.68±5.33)歲；產次0~3 次，平均(1.28±0.20)次；腫塊最大徑0.9~5.1 cm，平均(1.86±0.35)cm；已出現淋巴結轉移35例。對照組患者年齡29~64歲，平均(49.31±5.46)歲；病理學檢查結果(術中采樣)：乳房纖維腺瘤27例、乳腺內乳頭狀瘤18 例、乳腺囊性增生病12 例、脂肪瘤11 例；產次0~3 次，平均(1.31±0.22)次；腫塊最大徑0.4~3.6 cm，平均(1.39±0.26)cm。兩組患者的年齡、產次比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 超聲彈性成像 患者均于術前應用西門子Acuson S2000 型彩色多普勒超聲診斷儀進行檢查，探頭型號為14L5，頻率為7~14 MH，患者取平臥位，雙上肢自然放置于頭兩側，先行常規超聲檢查，明確病灶形態、大小、邊界等，然后將探頭調整至輕微接觸病灶表面皮膚，啟動彈性成像模式，應用實時雙幅模式顯示病灶的彈性圖及灰階圖，將取樣框調整至病灶的兩倍，采用Color2 彩色顯示法，藍色為硬，紅色為軟，控制質控量化參數≥60，能夠清晰顯示腫塊邊界后按凍結鍵，啟動Area Rati自動測量AR。硬度評分：1分，病灶與周圍組織均呈均勻粉色；2分，病灶呈紫色混雜少量綠色；3分，病灶呈綠色混雜少量黃色；4分，病灶呈紅色混雜少量黃色；5分，病灶呈紅色混雜少量黃色。

1.2.2 NKD1表達量檢測 術中取少量癌組織及癌旁組織(距癌組織5 cm，且經快速病理學檢查證實為非癌組織)，用干凈的剪刀將組織于冰上剪碎，在液氮中研磨，然后放入離心管中，在加入裂解混合液后于冰中放置3 h(每20 mg組織加入150 μL裂解混合液)，應用海門LX200 型離心機將裂解后的樣本進行離心處理，速率為12 000 r/min，離心40 min，吸取上清液進行蛋白濃度測量，用裂解混合液調整樣品濃度，將樣品溶液加入緩沖液混勻后，煮5 min使蛋白變性，取出待冷卻的樣品進行點樣，以每孔中點樣量30 μL 進行上樣，避免產生氣泡，然后進行電泳、轉膜、封閉、孵育、DAB顯色處理，進行電泳時，壓縮膠部分用60~90 V電壓壓縮25~35 min，分離膠部分用100~140 V電壓分離30~50 min，應用Image lab 軟件對蛋白印跡的灰度值進行分析，以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值來反映目的蛋白的相對表達。

1.2.3 HER-2 mRNA表達量檢測 應用Trizol法提取總RNA，采用分管光度法測定RNA 含量及純度。將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，應用Primer 5.0軟件合成HER-2 引物及內參β-action 引物，采用PCR法擴增后進行電泳分離，應用GENE TOOL 軟件進行半定量分析，以HER-2/β-action表示HER-2 mRNA表達量。

1.3 觀察指標 (1)比較兩組患者的AR 值及硬度評分，并分析其對浸潤性乳腺癌的診斷價值。(2)比較乳腺癌組患者的癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量。(3)比較不同AR值及硬度評分患者的癌組織NKD1、HER-2表達量，并分析其與彈性評分及AR值的相關性。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0 統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態分布，以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線分析超聲彈性成像參數對浸潤性乳腺癌的診斷價值，并采用Z檢驗比較兩組間曲線下面積(area under curve，AUC)差異；采用Pearson檢驗分析癌組織NKD1、HER-2 表達量與彈性評分及AR值的相關性。均以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的AR值及硬度評分比較 乳腺癌組患者的AR值大于對照組，硬度評分高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。患者超聲二維圖像及彈性成像圖像見圖1。

圖1 46歲女性右乳內上象限包塊的超聲二維圖像及彈性成像圖像

表1 兩組患者的AR值及硬度評分比較()

表1 兩組患者的AR值及硬度評分比較()

組別 例數AR值 硬度評分(分)乳腺癌組對照組t值P值90 68 1.53±0.25 1.39±0.21 3.729 0.001 4.32±0.37 2.85±0.22 29.093 0.001

2.2 超聲彈性成像參數對浸潤性乳腺癌的診斷價值 超聲彈性成像參數聯合檢測診斷浸潤性乳腺癌的 AUC 大于 AR 值單獨檢測(Z=2.819，P<0.05)，見表2、圖2。

表2 超聲彈性成像參數對浸潤性乳腺癌的診斷價值

圖2 超聲彈性成像參數診斷浸潤性乳腺癌的ROC曲線分析

2.3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較 癌組織NKD1 表達量低于癌旁組織，HER-2 mRNA 表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較()

表3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較()

例數90 90項目癌組織癌旁組織t值P值NKD1 0.56±0.11 0.64±0.12 4.662 0.001 HER-2 mRNA 0.63±0.13 0.45±0.08 11.187 0.001

2.4 不同硬度評分及不同AR值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較 硬度評分≥3.97 分患者癌組織 NKD1 表達量低于<3.97 分患者，HER-2 mRNA 表達量高于<3.97 分患者，差異有統計學意義(P<0.05)；AR 值≥1.48 患者癌組織 NKD1 表達量低于<1.48 患者，HER-2 mRNA表達量高于<1.48患者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同硬度評分及不同AR 值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較()

表4 不同硬度評分及不同AR 值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較()

項目 例數分類NKD1HER-2 mRNA硬度評分73 17 AR值≥3.97<3.97 t值P值≥1.48<1.48 t值P值69 21 0.54±0.10 0.65±0.13 3.850 0.001 0.53±0.11 0.66±0.13 4.542 0.001 0.65±0.12 0.54±0.10 3.503 0.001 0.65±0.13 0.56±0.09 2.958 0.004

2.5 癌組織NKD1、HER-2表達量與硬度評分及AR 值的相關性 癌組織NKD1 表達量與硬度評分及AR 值呈負相關(P<0.05)，HER-2 mRNA 表達量與 AR值呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 癌組織NKD1、HER-2表達量與硬度評分及AR值的相關性

3 討論

浸潤性乳腺癌已成為全球最常見的癌癥，嚴重威脅了女性的身體健康。目前多采用超聲等方法診斷，主要依據腫塊的形態、內部結構等來進行判斷，但在臨床工作中發現，較多浸潤性乳腺癌微小病灶發病早期惡性征象并不明顯，會影響到最終診斷。相關研究指出，超聲彈性成像可用于鑒別腫瘤性質，以輔助診斷疾病良惡性[6-7]。超聲彈性成像是依據不同病變組織及正常組織的組織硬度不同來進行判斷的，施加外力后，癌組織及正常組織彈性形變不同，通過組織內部位移信號不同，計算出腫塊的變形程度，可以以此判斷病灶良惡性[8]。本研究發現，乳腺癌組的AR值大于對照組，硬度評分高于對照組，說明浸潤性乳腺癌患者存在病灶硬度增高的現象，其原因在于，惡性腫瘤多呈浸潤性生長，與周圍組織黏連而導致活動度降低，因此相應區域的組織硬度增加。另外，本研究發現，超聲彈性成像參數聯合檢測對浸潤性乳腺癌具有較高的診斷價值。另外，本研究發現，AR值診斷浸潤性乳腺癌的截點值分別為3.97 分，略高于徐志花等[9]研究，這可能與良性組患者出現病灶部位膠原化有關。患者病灶膠原化，會出現纖維增生，使得彈性對比度增加，進而導致彈性分級增高。

NKD1 是一種由470 個氨基酸組成的蛋白，廣泛表達于多種重要器官的細胞質中，是Wnt信號通路的抑制性蛋白[10-11]。HER-2是人類表皮生長因子受體家族成員，在胎盤、胚胎上皮組織及多種腫瘤細胞中呈高表達，研究顯示，HER-2 可以作為乳腺癌診斷和評估的獨立危險因素[12-13]。相關報道指出，NKD1過表達可介導Wnt/PCP信號途徑，通過調控黏附蛋白活性及上皮細胞的極性來維持細胞極性，而起到腫瘤抑制作用[14-17]。表明NKD1 表達或與腫瘤的發生發展過程相關。本研究結果顯示，癌組織NKD1 表達量低于癌旁組織，HER-2 mRNA 表達量高于癌旁組織，進一步證實了浸潤性乳腺癌患者癌組織存在NKD1、HER-2 mRNA表達異常的現象，這主要與NKD1、HER-2均能介導腫瘤發生過程有關。本研究上述研究結果顯示，超聲硬度評分及AR 值可用于評價病灶性質，而浸潤性乳腺癌的發生與NKD1、HER-2表達存在密切關聯，提示NKD1、HER-2 表達或與超聲彈性指標存在某種聯系，為驗證上述猜想，本研究進行了相關分析，結果發現，癌組織NKD1表達量與硬度評分及AR值呈負相關，HER-2 mRNA表達量與AR值呈正相關。其具體機制尚不可知，筆者認為，可能與癌組織浸潤等有關。

綜上所述，超聲彈性成像參數聯合檢測對浸潤性乳腺癌具有診斷價值，且與癌組織NKD1、HER-2 mRNA表達量相關。