ROS與膿毒癥NLRP3活化的關系及其調控機制

韓雪妹 綜述 王日興 審校

海南醫學院第二附屬醫院急診科，海南 ?？?570311

機體防御外來侵害的首要防線是固有免疫，炎性反應是最早的固有免疫反應之一，它能對抗進入人體引起疾病的外來微生物。大多數外來微生物在其細胞壁或細胞表面表達各種病原體相關分子模式(pathogen related molecular patterns，PAMP)，此外，機體在受刺激時，細胞可釋放稱為危險相關分子模式(danger related molecular patterns，DAMP)的危險信號，以識別緊急情況并通知免疫系統。PAMP和DAMP被固有免疫模式識別受體(pattern recogniition receptor，PRR)識別，從而引起一系列的免疫反應。炎癥反應的發生不僅需要各種吞噬細胞通過PRR 識別PAMPs 和DAMPs，還需要細胞分泌多種促炎細胞因子，觸發下游炎性反應途徑，以消除微生物感染并修復受損的組織。然而，機體內過度的炎癥反應可導致膿毒癥，膿毒癥為宿主對感染所引起的免疫反應失調導致的危及生命的器官功能障礙[1]，早期由于缺乏治療經驗，膿毒癥患者的病死率極高，在開展“拯救膿毒癥運動”后，膿毒癥的治療方案也更為規范化，在加強抗感染、液體復蘇、器官支持等綜合治療后[2]，膿毒癥患者的病情得到好轉，早期死亡率大大降低。不幸的是，盡管目前對膿毒癥的理解及治療有了極大地提高，但是與膿毒癥相關的疾病的死亡率未能明顯降低[3]。2020 年，一項關于我國重癥醫學科住院患者的研究表明，膿毒癥的發病率為20.6%，病死率為35.5%，其中嚴重膿毒癥病死率高達50%及以上[4]。雖然膿毒癥患者病死率很高，但是目前尚無可針對性藥物用于臨床治療。

炎性體是一種蛋白復合物，在機體免疫系統中起著重要作用[5]。炎性體的組成主要包括模式識別受體、凋亡相關斑點樣蛋白和半胱氨酸蛋白酶1[6]。其中組成炎性體的模式識別受體最常見的是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)，也稱為 NOD 樣受體(NOD like receotors，NLRs)。炎性體被激活后可促進各種炎性因子的釋放，從而參與炎癥反應。其中NLRP3炎性體與膿毒癥發生、發展的關系最密切[7]，目前對其研究也最為深入。

1 NLRP3炎性體

NLRP3 炎性體是存在于胞質內的多種蛋白復合體，下面將分別介紹其組成蛋白。(1)核心蛋白核苷酸結合寡聚化結構域樣蛋白3(nucleotide-binding oligomerisation domain-like protein 3，NLRP3)：主要由三部分構成，包括氨基末端的嘧啶結構域(pyrimidine domain,PYD)、中心核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide bingding and oligomerization domain，NOD)和碳端富含亮氨酸的重復結構域(leucine rich repeat，LRR)。NLRP3 的嘧啶結構域與ASC 的嘧啶結構域相互作用，引發炎性體組裝。正常情況下，NOD 結構域與LRR 結構域結合并處于抑制狀態，當LRR 結構域識別各種刺激后(PAMPs 和DAMPs)可使NLRP3 發生寡聚化[8]。(2)連接蛋白含半胱氨酸蛋白酶募集結構域凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-like protein containing a caspase ectuitment domain，ASC)：主要由兩部分組成，包括碳末端的半胱氨酸蛋白水解酶募集結構域(caspase activation and recruitment domain，CARD)氨基末端嘧啶結構域(PYD)。NLRP3 與ASC 的嘧啶結構域相互結合引發炎性體的組裝后，ASC 與Caspase-1 的半胱氨酸蛋白水解酶募集結構域相互結合，至此，NLRP3 完成炎性體的組裝，促進NLRP3 炎癥小體的激活[9]。(3)效應蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶前體(cysteine aspartate specific protease-1 precursor，pro-caspase-1)：當NLRP3 炎性體完成組裝后，效應蛋白pro-caspase-1 通過自身酶解作用形成具有生物活性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteine aspartate specific protease-1，Caspase-1)，后者再將白介素 1β (interleukin 1β，IL-1β)和白介素 18 (interleukin 18，IL-18)的前體剪切成熟并分泌，促進炎癥反應的發生、發展[10]。

2 NLRP3炎性體的啟動及激活

迄今為止，研究已經證明了NLRP3炎性體可被多種多種物質激活，病原體包括：各種細菌、真菌、病毒；內源性物質包括ATP、ROS(reactive oxygen sepsis)；外源性刺激物包括石棉、尼古丁等[11]。這些結構上不同的分子觸發NLRP3 寡聚化和炎性體激活的機制目前尚不清楚，但效果非常強烈。如果激活的NLRP3炎性體持續上調未被下調，則NLRP3炎性體將持續誘導炎癥反應并導致多種疾病，包括膿毒癥、阿爾茨海默病、與低溫蛋白相關的周期性綜合征、糖尿病和多種自身炎癥性疾病等[12-13]。NLRP3炎性體的激活主要受雙信號模型調控[14]。啟動信號是由Toll樣受體識別微生物成分或內源性細胞因子，激活核轉錄因子(nuclear transcription factor，NF-κB)，導致pro-IL-1β的表達增加以及NLRP3 mRNA表達上調并啟動NLRP3炎性體。激活信號由各種PAMPs 和DAMPs 組成，使得核心蛋白NLRP3 活化，從而啟動炎性體的組裝，NLRP3 炎性體被激活。雖然目前對NLRP3 炎性體活化的具體調控機制研究仍不完全，但是目前較為認可的調控機制模型通常包括以下三種。(1)NLRP3炎性體活化的離子通道模型：K+外流、Na+內流是細胞內維持電解質平衡的常見現象，研究發現，胞內K+是NLRP3 炎性體激活的觸發因素，細胞發揮作用所需要的ATP與細胞表面的P2X7 受體結合后[15]，可導致相關的離子通道開放，pannexin-1孔形成并允許K+從細胞內大量外流。胞質內鉀離子的耗竭激活NLRP3炎性體后介導IL-1β的成熟和釋放，此外K+外流還導致Ca2+非依賴性磷脂酶A2的激活，從而促進IL-1β成熟[16]。(2)NLRP3 炎性體活化的溶酶體破裂模型：各種PAMPs 和DAMPs 被細胞吞噬后，通過某些直接或間接的作用，將導致細胞內溶酶體破裂，組織蛋白酶B從胞質內釋放出來，最近的研究表明，細胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)誘導組織蛋白酶B的激活，有助于NLRP3炎性體的激活，并加速Caspase-1 依賴性pro-IL-1β剪切成熟過程[17]。(3)NLRP3炎性體活化的活性氧模型：多種內源性與外源性的物質，如細菌、病毒和胞外的ATP等可介導NLRP3炎性體的活化，并且這些NLRP3炎性體激活劑均會觸發ROS的產生，或協同ROS共同發揮活化作用[18-19]。所以目前的研究認為NLRP3激活的關鍵因素之一是ROS，ROS的生成減少及清除增多均會明顯降低Caspase-1 活性，IL-1β分泌減少[20]。同時還發現線粒體自噬缺失的細胞，活性氧的產生也會增加，NLRP3 炎性體的活化也會增強[21]。下面將重點闡述NLRP3炎性體活化的活性氧模型。

3 活性氧介導的NLRP3炎癥體的活化

眾所周知，ROS是機體氧化還原反應的一種正常代謝產物，1961 年，Jensen 首先證明線粒體可產生ROS，而后隨著研究的不斷深入，才證實線粒體是ROS 的主要來源[22]。ROS 可以雙向調節細胞的凋亡和增殖，并激活轉錄因子，以進行信號轉導。但是，ROS 和線粒體在NLRP3 炎癥小體激活中的作用仍有爭議。ROS 被認為是NLRP3 炎性體激活的常見信號，因為大多數NLRP3 激動劑均會誘導ROS 的產生。已有的研究表明，NLRP3炎性體的配體之一硫氧還原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)對ROS 敏感，其受體蛋白為氧化還原酶硫氧還原蛋白(thioredoxin，TRX)。在正常條件下，機體內的TXNIP 與TRX 結合形成復合物并處于靜息狀態。當炎癥發生時，各種PAMPs 和DAMPs 刺激引起ROS濃度增加，復合物TXNIP-TRX解離，TXNIP與核心蛋白NLRP3 的LRR 結構域結合，可使NLRP3 發生寡聚化，激活NLRP3 炎性體[19]，促進炎癥反應的發生。線粒體呼吸鏈中的NADPH氧化酶最初被認為是ROS產生的來源[23]。NADPH氧化酶4(NOX4)可調節肉堿棕櫚酰轉移酶1A (Carnitine palmitoyl transferase1A，CPT1A)并導致脂肪酸氧化增加，這有助于NLRP3 炎性體活化[24]。最近的一項研究表明，在創傷性腦損傷模型中，NADPH 氧化酶2(NOX2)的缺失降低了NLRP3 炎性體的表達，并擾亂了缺血性卒中后小鼠大腦皮層中NLRP3-TXNIP的相互作用，但這一現象并不出現于該模型的臍靜脈內皮中，這表明ROS 在NLRP3炎性體激活中具有組織特異性作用[25]。然而，一些研究發現NLRP3炎性體活化在小鼠和人類細胞中都不受NADPH 氧化酶的遺傳或藥理學抑制的影響[26]。線粒體 ROS (mitochondria ROS，mtROS)在 NLRP3 炎性體激活中的作用最初是從一項研究中提出的，該研究表明通過線粒體呼吸鏈產生的mtROS 可以激活NLRP3 炎癥小體[27]。同樣，NAKAHIRA 等[28]發現，由功能失調的線粒體產生的mtROS 是NLRP3 炎性體激活所必需的，并且線粒體DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)以NLRP3 和mtROS 依賴性方式釋放到細胞質中。SHIMADA等[29]后來發現，雖然mtDNA與NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)相互作用，但氧化的mtDNA 才是NLRP3 炎性體激活所特別需要的。同樣，ZHONG 等[30]的研究也指出，由各種刺激因素誘導合成的氧化型mtDNA是NLRP3炎性體激活所必需的。綜上所述，這些研究表明在NLRP3 炎性體激活過程中，線粒體功能障礙、mtROS 和mtDNA起重要作用。然而，也有研究質疑mtROS和線粒體功能障礙在NLRP3 炎癥小體激活中的作用[31-32]。值得注意的是，在這些研究中大多數都使用高濃度的化學抑制劑來抑制mtROS 的產生和線粒體功能，這很容易導致實驗誤差。并且至少有一項研究報告指出，ROS抑制劑還阻斷了NLRP3炎性體激活的啟動信號[31]。除了 mtROS 和 mtDNA 的產生外，NLRP3 炎性體可與線粒體的各種分子相互作用(包括線粒體抗病毒信號蛋白、線粒體融合蛋白2 和心磷脂)，促進其活化。例如MAVS 在病毒感染的情況下將核心蛋白NLRP3 募集到ASC，后者泛素化并促進NLRP3 寡聚化，促進了NLRP3 炎性體活化[33]。NLRP3 還被證明在病毒感染期間與線粒體線粒體融合蛋白2 直接相關[34]。心磷脂是線粒體內膜的一種脂質，直接與NLRP3 的LRR 結構域結合，若干擾心磷脂表達，不利于NLRP3 炎性體激活[35]。此外，線粒體自噬也參與NLRP3炎性體的活化，當線粒體自噬功能出現異常時，大量的線粒體活性氧累積，導致線粒體損傷，在沒有其他炎性體激活劑的情況下活化NLRP3 炎性體[18-36]，這與線粒體功能紊亂有關，為活性氧的間接作用。線粒體活性氧作為NLRP3炎性體活化的關鍵因素之一，在膿毒癥的調控中具有重要意義，針對線粒體活性氧活化NLRP3炎性體的調控機制進行研究，對各類感染性疾病，尤其是膿毒癥的治療提供治療思路。

4 展望

炎癥是機體對于刺激的一種防御反應，在有些情況下，炎癥發生時產生的過量的炎癥介質破壞機體的免疫功能，從而引起多器官功能障礙，即出現膿毒癥，研究炎癥反應的關鍵環節并進行拮抗是目前研究的方向。NLRP3 炎性體作為目前研究最為廣泛的炎性體，對于機體的炎癥調控至關重要。雖然目前對NLRP3炎性小體的激活調節機制并沒有研究透徹，但是眾多研究表明，NLRP3炎性體活化的關鍵因素之一是活性氧，而活性氧的主要來源是線粒體。線粒體通過產生ROS 或通過與NLRP3 炎性體的成分相互作用參與NLRP3 炎性體激活及下游的炎癥級聯反應。研究ROS 介導的膿毒癥NLRP3 炎性體的激活、調控機制，為膿毒癥治療提供新理論、新方法、新的治療靶點，有利于開發新的治療性抗炎藥。