ceRNA在缺血性腦卒中中的研究進展

王鵬宇 綜述 楊錫彤，陳華秋，王光明，張元元 審校

1.大理大學臨床醫學院，云南 大理 671000；2.大理大學第一附屬醫院基因檢測中心，云南 大理 671000；3.大理大學臨床醫學院內科教研室，云南 大理 671000

腦卒中是由腦血管突然破裂或者阻塞而造成的急性局灶性損傷引起的中樞神經系統功能缺損。卒中是全球范圍內第二死亡原因，也是第三大致殘原因。根據最新全球疾病負擔研究顯示，全球最高的卒中年齡標準化發病率在東亞地區[1]。卒中在我國是致死和致殘的首位因素。最新《中國腦卒中防治報告2019》表明：我國卒中死亡人數高達190余萬/年，其中發病逐漸年輕化，且發病類型絕大多數為缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)[2]。缺血在神經系統中往往會引起組織缺氧、細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激、自噬等一系列的病理生理過程[3]。隨著社會老齡化加重及腦血管病風險因素的增加，我國卒中負擔的增長呈現出爆發態勢，因此我國卒中防治急需采取更有效的方法。目前許多研究發現競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)在IS 發揮著重要的作用。因此，從ceRNA角度研究IS致病機制具有重要意義。

1 ceRNA概述

ceRNA 假說在 2011 年的《Cell》雜志首次提出，PANDOLFI 等[4]發現信使RNA、假基因和長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)通過微小RNA應答元件(microRNA response elements，MREs)調控編碼基因與非編碼基因之間的“對話”來形成龐大的調控網絡。ceRNA通過MREs發揮海綿吸附作用競爭結合或共享微小RNA(microRNA，miRNA)調控miRNA 下游靶基因的表達，是基因表達重要的轉錄后調節因子[5]。這種新型ceRNA調控網絡的中心環節在于調節miRNA的表達實現調控miRNA靶基因的表達水平，其調控模型對于傳統的miRNA調控機制更為精細和復雜，在很大程度上豐富人類基因組的功能。ceRNA 調控參與多種疾病的病理生理過程，其調控模式廣泛存在于神經系統疾病，可為揭示IS發病的分子機制以及開展新的治療方法提供基礎。研究發現ceRNA 調控網絡與缺血性腦卒中發病有著密切的關聯[6]。目前在卒中研究ceRNA 分子最多的是lncRNA，其次為環狀RNA(circular RNA，circRNA)。

2 LncRNA介導的ceRNA在缺血性腦卒中的發病機制

LncRNA 是一種由RNA 聚合酶在轉錄過程中產生的長單鏈非編碼RNA，長度超過200 個核苷酸單位，在轉錄、轉錄后表達、表觀遺傳、結合miRNA、信號轉導等多個層面進行基因表達的調控。LncRNA在中樞神經系統中具有高度特異性的表達，有效地調控中樞神經系統的發育和中樞神經疾病的進展。在IS 發生后，異常表達的lncRNA 參與了IS 發生后的神經細胞損傷及功能缺損的多個病理過程[7]。IS 后lncRNA表達的改變引起下游分子表達及功能發生轉變，對卒中的疾病進展及預后形成有利或有害的影響。探索lncRNA 介導的ceRNA 在IS 后的分子機制，有助于全面了解IS的病理機制及損傷后的分子調控網絡。

2.1 ceRNA 與氧化應激 氧化應激是氧化反應超過抗氧化反應的一種失衡狀態，腦組織與其他器官相比最容易因活性氧(reactive oxygen species，ROS)增多而受到損傷，尤在IS后的損傷與ROS水平高度相關[8]。氧化應激反應中，另一關鍵分子超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內存在的一種抗氧化的金屬酶，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。研究表明，IS 患者較健康人lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反義轉錄本1 (OIP5 antisense RNA 1，OIP5-AS1)水平顯著降低，miR-186-5p 水平顯著增高。OIP5-AS1作為分子海綿作用于miR-186-5p調節C1q/TNF 相關蛋白 3 (C1q and TNF related 3，CTRP3)的表達。IS發生后下調的OIP5-AS1通過ceRNA網絡間接使SOD、谷胱甘肽過氧化物酶的水平明顯下降，從而導致IS 的氧化應激反應加重[9]。lncRNA 核仁小分子RNA宿主基因14(small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14)在大腦中動脈閉塞小鼠模型中上調，SNHG14 利用分子海綿功能抑制miR-199b 表達使水通道蛋白4 (aquaporin 4，AQP4)表達水平上調，加劇IS的氧化反應。但當上調miR-199b 表達可以促進細胞的存活和提高SOD 的活性增強抗氧化作用，而過表達的AQP4 能消除上調miR-199b 水平所發揮的神經保護作用；因此，在腦卒中SNHG14 作為ceRNA 分子提高AQP4分子水平，加劇了氧化應激反應[10]。LncRNA 鋅指結構反義轉錄本1 (ZNFX1 antisense RNA 1，ZFAS1)在IS患者表達減少，并負向調控miR-582-3p以致一氧化氮合酶3 表達下降，沉默一氧化氮合酶3基因使得SOD2 水平降低而ROS 水平增高，從而使氧化應激反應加重[11]。另有研究發現，LncRNA 橫紋肌肉瘤相關轉錄物-2 (rhabdomyosarcoma 2 associated transcript，RMST)在IS患者血清表達增加，而miR-377表達減少，實驗表明RMST作為ceRNA分子競爭結合miR-377 調控腦信號蛋白3A 的表達。當在神經細胞中敲除RMST后，通過上調miR-377 表達間接降低腦信號蛋白3A水平，可減輕缺血、缺氧引起的氧化應激反應對細胞的損傷[12]。綜上所述，多個ceRNA分子參與調控IS 氧化應激反應中SOD、ROS 等關鍵分子的表達水平，進而對神經細胞或腦組織造成損傷。這些ceRNA 分子給揭示IS 病理過程的分子機制提供新思路。

2.2 ceRNA 與炎癥反應 炎癥反應是IS 病理生理過程和影響預后的主要因素，IS 因血流停滯、血管內白細胞活化及缺血的內皮細胞或腦實質細胞釋放炎癥因子等多種因素引起神經炎癥反應[13]。炎癥反應在IS是一把“雙刃劍”：一是在急性期過度炎癥反應造成二次機體損傷；另一方面炎性細胞原位分化為抗炎細胞，在慢性缺血期發揮清除細胞碎片、組織修復的功能。最新研究發現，lncRNA X染色體失活特異轉錄本(X-inactive specifc transcript，XIST)在IS實驗中表達升高。在機制上XIST作為miR-362的ceRNA分子對其負性調控，從而解除對靶基因Rho 相關蛋白激酶2(Rho associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2)的抑制作用。實驗敲除XIST后ROCK2 基因表達降低，使得白細胞介素6 (interleukin 6，IL-6)、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等炎癥因子水平顯著下降，從而減輕炎癥反應和神經損傷[14]。IL-1β、TNF的水平同樣受SNHG14/miR-199b/AQP4 的ceRNA 調控軸調節。因此，在IS 發生后上調表達的SNHG14通過ceRNA 途徑使炎癥因子釋放增加從而加重炎癥反應[10]。炎癥反應NF-κB 信號通路的研究顯示IS 實驗中lncRNA SNHG15表達上調，SNHG15海綿吸附miR-302a-3p 分子，從而使信號傳導與轉錄激活因子1 (signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)表達增加，進而激活NF-κB信號通路。過表達的SNHG15顯著增加IS后神經元細胞凋亡、炎癥因子的釋放和增強小膠質細胞氧化應激反應；當敲除SNHG15 或者上調miR-302a-3p可以減輕神經損傷和降低炎癥因子水平，達到神經保護的作用[6]。另一研究表明，其通過SNHG8/miR-425-5p/沉默調節蛋白1(sirtuin 1，SIRT1)網絡調控NF-κB通路。實驗表明過表達的SNHG8可降低miR-425-5p的表達而提高SIRT1表達，進而抑制NF-κB信號通路活化，降低小膠質細胞的活化和內皮細胞的損傷，從而減輕IS后的炎癥反應和血腦屏障的損傷[15]。IS發生后過度的炎癥反應會加重甚至造成二次損傷，而在早期降低小膠質細胞的活化，減少炎癥因子的釋放，有助于減輕腦水腫及神經細胞的損傷[16]。以上研究表明，及早控制IS的炎癥反應對疾病的進展及恢復具有一定價值。同時為進一步探究ceRNA 分子作為IS 的分子標志物或減輕炎癥反應的治療靶點帶來新方向。

2.3 ceRNA 與細胞凋亡 細胞凋亡是維持機體內環境穩態的一種自主有序的細胞死亡。IS 后引起缺血組織Ca2+超載、產生大量ROS，以及興奮毒性作用最終導致細胞凋亡[17]。細胞凋亡主要發生在缺血半暗區。隨著時間延長，缺血半暗區的細胞凋亡發生增加，缺血中心范圍進一步擴大從而造成神經功能缺損加重。研究表明新興ceRNA 調控網絡在IS 中細胞凋亡過程發揮著重要作用[18]。研究發現，IS 患者較健康人 lncRNA OIP5-AS1 水平顯著降低，miR-186-5p 水平顯著增高。在實驗中OIP5-AS1作為分子海綿作用于 miR-186-5p 來調節 CTRP3 的表達，使 IS 后炎癥因子增多、氧化應激反應加重，從而加速神經元細胞的凋亡[9]。在實驗中lncRNA SNHG6 的表達增高，SNHG6作為miR-181c-5p的ceRNA分子對其負性調節，而miR-181c-5p 對靶向的BCL-2 蛋白家族編碼基因BCL2 樣蛋白 11 (BCL2 like 11，BCL2L11)起抑制作用。實驗中SNHG6 表達降低時，可以減少IS 的梗死面積并改善美國衛生院卒中量表評分，但當過表達BIM 則增強Caspase-3 的活力及促進細胞凋亡[19]。BCL2 樣蛋白 13(BCL2 like 13，BCL2L13)基因在 IS 實驗中表達上調，其通過lncRNA叉頭框D3反義轉錄本1(FOXD3 antisense RNA 1，FOXD3-AS1)/miR-765/BCL2L13調控軸調控凋亡蛋白表達。FOXD3-AS1在IS中過表達，通過ceRNA網絡上調凋亡蛋白水平從而加速神經元細胞凋亡[20]。細胞凋亡進程中最重要的終末剪切酶是Caspase-3。在IS 中lncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)作為 miR-205-3p 靶向蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase gene，PTEN)的 ceRNA 分子，通過調控 Caspase-3 的活性控制神經細胞的凋亡。實驗中MALAT1表達降低，經ceRNA 網絡使得PTEN 基因低表達來降低Caspase-3 活性，從而減少IS 神經細胞凋亡[21]。有研究發現，在 IS 中 PTEN 基因也受 lncRNA H19/miR-19a-3p調控軸調控。IS 實驗中經此調控軸使PTEN 基因高表達時，活化磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B 信號通路來加重IS 的損傷[18]。因此，PTEN基因在IS中通過ceRNA網絡介導神經細胞凋亡的過程是復雜交錯的，但降低PTEN基因表達可以改善IS 的損傷。綜上，通過ceRNA分子調控凋亡蛋白水平或者Caspase-3活性可為IS的治療帶來新策略。

2.4 ceRNA與血管生成 血管生成可促進側支循環的形成，有助于恢復IS 缺血區的血供，及早恢復血供可以減少腦缺血的梗死面積[22]。缺血性腦損傷后血管生成在臨床實踐發揮著重要的作用，其中血管內皮生長因子是促血管生成的關鍵分子。研究發現，MALAT1 在IS 患者血清及氧糖剝奪的腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)實驗中均高表達。MALAT1 高表達通過抑制miR-205-5p的表達來提高血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)表達水平，促進BMEC 增殖及血管生成[23]，有助于IS中側支循環的建立。VEGFA 基因表達也受母源性表達基因8 (maternally expressed 8，MEG8)/miR-130a-5p/VEGFA 的調控，經此ceRNA 網絡使VEGFA 基因表達增加，促進血管生成并減輕腦缺血情況[24]。另有研究，lncRNA核旁斑裝配轉錄本1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)表達上調而 miR-377 表達降低，miR-377 具有抑制血管生成及VEGFA 基因表達的功能。在IS 后NEAT1作為ceRNA分子調控miR-377/VEGFA 軸，使VEGFA 表達增加發揮促血管生成作用[25]。缺氧誘導因子在缺氧環境中也是促血管生成的關鍵分子。研究表明，lncRNA SNHG1具有ceRNA分子功能并在IS中高表達且抑制miR-18a 的表達，間接激活缺氧誘導因 子 1 α (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α)/VEGF 信號通路，促進 BMEC 的存活[26]，對血管生成起到重要作用。VEGFA、HIF-1α基因的高表達，可以促進血管內皮細胞的增殖、遷移及形成新生血管，以致恢復缺血區血供和提高缺血區神經細胞的存活。

2.5 ceRNA 與細胞自噬 自噬在真核細胞是一種高度保守的細胞內自我降解過程，其在溶酶體降解清除胞內錯誤折疊的蛋白質和功能失調的細胞器[27]。細胞自噬也是一種維持自身穩態的適應性分解代謝過程，但是過度自噬會加速細胞的死亡導致疾病進一步惡化。最新研究發現，lncRNA 鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶ⅡD (CAMK2D-associated transcript 2，C2dat2) 負 性 調 控 miR-30d-5p 的 表 達 ，miR-30d-5p 靶向沉默DNA 損傷誘導轉錄子4 (DNA damage inducible transcript 4，DDIT4)。C2dat2 在 IS模型中高表達，經ceRNA 網絡使DDIT4 基因表達升高來抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路磷酸化，從而促進神經元細胞的自噬和凋亡，導致神經細胞損傷[28]。LncRNA MEG3 在實驗中上調表達，過表達MEG3 使得miR-378 低表達而上調生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2，GRB2) 的表達。GRB2的高表達抑制蛋白激酶B/mTOR信號通路的激活，促進細胞自噬，以致IS 后神經功能障礙[29]。自噬反應中，自噬相關基因7 (autophagy related 7，ATG7)是關鍵啟動子，在自噬激活過程中起到重要作用。當在IS患者中lncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 opposite strand/antisense transcript 1，KCNQ1OT1)顯著高表達。研究證實，過表達的KCNQ1OT1作為分子海綿使miR-200a 表達降低，從而調控轉錄因子FOXO3 的高表達。FOXO3 直接靶向ATG7 啟動子區域正向調控ATG7表達，激活依賴ATG7的自噬過程導致IS 后的損傷[30]。之前研究表明，lncRNA MALAT1與自噬相關基因Beclin1 在神經元細胞中競爭結合miR-30a，抑制miR-30a的表達，進而上調Beclin1的表達。當下調MALAT1 可通過調節miR-30a 抑制依賴Beclin1的自噬反應，從而降低缺血性腦卒中神經元細胞的死亡率[31]。在IS后神經細胞的過度自噬，引起缺血半暗帶的神經細胞死亡增加，加劇神經損傷和功能障礙。

3 circRNA介導的ceRNA在缺血性腦卒中中的作用

circRNA 是一種非編碼RNA，其參與多種生物學過程。circRNA 是共價閉合的環狀非編碼RNA，因其不具有線性RNA分子的5'和3'末端結構從而有著較強的穩定性，其也具有海綿吸附miRNA 分子的作用[32]。circRNA 已被證明在中樞神經系統中高度表達，具有神經特異性，參與缺血性腦卒中的炎癥反應、細胞凋亡、血腦屏障功能障礙等病理過程[33]。到目前為止，有研究發現circRNA 作為ceRNA 分子發揮多種生物學作用[34]。

神經干細胞可以分化為星形膠質細胞和神經元細胞，在IS的恢復過程中扮演著重要的角色。研究發現circRNA 三角形四肽重復域3 (tetratricopeptide repeat domain 3，TTC3)和 Toll 樣受體 4(toll like receptor 4，TLR4)在 IS 模型中高表達，而 miR-372-3p 表達降低。機制上TTC3 作為miR-372-3p 的ceRNA 分子提高TLR4的表達引起IS患者神經損傷及抑制神經干細胞的分化[35]。研究表明circRNA PHC3 在氧糖剝奪BMEC 中顯著上調，機制上 PHC3 作為 ceRNA 分子海綿吸附miR-455-5p 從而上調腫瘤壞死因子受體相關因子 3 (TNF receptor associated factor 3，TRAF3)的表達，促進氧糖剝奪的BMEC 的死亡[36]，此研究為IS 后保護血腦屏障功能提供基礎。circRNA在調控細胞凋亡的過程中也發揮著重要的作用，circRNA 含HECT結構域的E3 泛素蛋白連接酶1 (HECT domain E3 ubiquitin protein ligase 1，HECTD1)在IS 中顯著上調，其作為ceRNA 分子負性調控miR-133b 并解除miR-133b 對TRAF3 的抑制作用。當下調HECTD1時可通過抑制NF-κB 通路減輕神經細胞的凋亡，改善腦梗死面積和神經元的死亡，起到神經保護的作用[34]。綜上，circRNA通過ceRNA網絡在IS 多個病理過程發揮著重要作用，將有望成為IS 的診斷標志物。隨著circRNA 分子及功能的不斷挖掘，可能很大程度上完善IS 發病的分子機制。

4 展望

目前，大多數研究基于lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡闡述IS 后其參與的各種病理過程，也有報道circRNA-miRNA-mRNA 調控機制所發揮的作用，但假基因等ceRNA 分子在IS 的作用機制尚不明確。再者，已發現具有功能的ceRNA分子在IS患者中的豐度需要進一步驗證，以望挖掘潛在的IS新型標志物。最終，在缺血性腦卒中ceRNA網絡中存在著多條途徑靶向共同靶基因的現象，仍需深入研究多個ceRNA分子對共同靶基因的影響。