宏基因組測序技術在感染性病原體檢測中的應用進展

韓心遠，高小娟 綜述 熊丹，張秀明 審校

1.安徽理工大學醫學院，安徽 淮南 232001；2.深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室，廣東 深圳 518001

感染性疾病是全球十大死亡原因之一，多數感染由細菌、病毒、真菌和支原體等引起。其中以流感為代表的流行性病毒感染可在相對較短的時間內在人群中呈指數級傳播[1]。然而目前超過50%的中樞神經系統感染者和40%~50%重癥肺炎膿毒癥患者無法得到確切的診斷[2-3]。此外，新發感染性疾病的不斷出現以及臨床上抗生素濫用、誤用等問題都給臨床病原診斷提出了更高的要求。宏基因組測序技術(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是對待測樣本中的全部核酸成分進行“鳥槍法”大規模平行測序，再將測序數據進行生物信息學分析，以獲取樣本中完整的核酸序列信息的技術。現如今，該技術被越來越多地應用于臨床，在感染性病原檢測、病原生物學特征中展現了獨特的技術優勢和廣闊的應用前景。本文將對宏基因組測序技術在感染性疾病病原體檢測中的應用進行闡述，旨在進一步揭示宏基因組測序在感染性疾病診治中的重要作用和應用價值。

1 宏基因組測序技術

宏基因組測序是一種直接從患者標本中進行泛核酸檢測的方法，該方法可對樣品中所有的核酸進行放大和并行測序，允許無差別檢測所有微生物(如細菌、病毒、寄生蟲和真菌)、抗體、毒力因子及宿主生物標志物等[4]。mNGS 技術的實驗流程分為濕實驗和干實驗，其中濕實驗包括核酸提取、文庫構建、上機測序。干實驗包括生信分析與報告解讀，不同的臨床樣本在核酸提取之前需要進行不同的預處理，比如組織塊的研磨、痰液液化、體液離心等以提高病原體檢出率。文庫構建是將基因組DNA片段化并在片段末端連接寡核苷酸接頭的過程，文庫質量直接影響測序數據質量。單樣本的文庫構建完成后通常需要進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，混合后進行上機測序。測序完成后，下機數據進入生信分析流程。該流程包括去除人源序列、處理微生物序列及相關元數據、檢測候選目標微生物，實現檢測與數據的轉換[5]。最后，檢驗人員根據自動化系統產生的初步結果并結合相關臨床指標、樣本類型、病原體種類等因素進行綜合分析進而完成報告的審核與發放。

mNGS在感染性疾病的診斷中相較于傳統檢測技術有諸多優勢，如：(1)無需病原體培養，可直接對臨床標本進行檢測；(2)檢測通量高，在一次檢測中可獲得標本中病原微生物的全部遺傳信息；(3)敏感度高，豐度較低的微生物也可檢出；(4)通過宏基因組測序可分析病原體多樣性、種群結構、進化關系等，解讀其與環境、宿主之間的相互聯系。現mNGS已憑借其技術優勢應用于包括呼吸系統感染、中樞神經系統感染及血液系統感染[6-9]等在內的多種感染性疾病的診治中。目前絕大多數醫院未建立宏基因組測序平臺，而是借助第三方服務。從臨床需求來看，醫院自建平臺和第三方提供檢測服務都在發展。2020 年底我國相繼出臺了《中國宏基因組學第二代測序技術檢測感染病原體的臨床應用專家共識》[10]和《高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規范化專家共識》[11]，其中就mNGS的臨床應用范圍、樣本采集、報告解讀、診斷效能以及質量保證等方面進行了證據總結和意見推薦，以促進mNGS在感染性疾病領域的普及和規范化發展。

2 宏基因組測序在感染性疾病中的應用

2.1 細菌性感染 細菌性感染是臨床上感染性疾病中最常見的類型之一，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及肺炎鏈球菌感染等。目前通過傳統的實驗室診斷技術可培養鑒定的菌種有限，多重感染不易識別，致使疑難細菌感染患者難以得到及時有效的治療。隨著抗生素的廣泛使用，臨床細菌性感染的病原體構成越來越復雜。臨床上通過細菌培養來鑒定細菌性感染存在一定的局限性：(1)細菌培養受限于標本中活菌的豐度，培養的時間普遍較長，陽性率普遍較低；(2)不同細菌的生長條件不同，部分細菌培養成功率低，甚至不能培養；(3)難以鑒定多重感染，易發生漏檢。宏基因組測序在診斷細菌性感染方面可有效做到以下幾點：(1)宏基因組測序有更高的陽性檢出率。GENG 等[12]將63 例血培養陰性的危重癥患者的血液進行mNGS 檢測，比較其與傳統檢測方法的診斷效果，結果發現mNGS陽性率為41.3%，并診斷出16例混合感染，表明mNGS對血培養無法診斷的危重患者具有較好的適用性。在一項中樞系統感染的前瞻性隊列研究報道中，研究者將230份腦脊液標本分別進行mNGS和常規培養。結果顯示經驗治療組mNGS的檢出率明顯高于培養組(34.45%vs 7.56%)[7]。SUN等[13]證實mNGS 的敏感性明顯高于其他常規結核試驗的敏感性。且工作特征曲線分析顯示mNGS 的曲線下面積(AUC)值最高，為0.79。(2)宏基因組測序技術可“無偏倚”地檢測目標樣本中幾乎所有的核酸信息，以此來探究樣本的菌群結構。DEI-CAS等[14]利用mNGS發現銀屑病患者的腸道菌群中厚壁菌門與擬桿菌門比例增加，這一比例會導致丁酸鹽產量下降，低水平的丁酸鹽可能影響黏膜層的完整性，損害腸道上皮。KRISHNA 等[15]用mNGS 分析結核病患者的痰液微生物群，門水平分析顯示：結核病患者痰液中厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著高于健康對照；屬水平分析顯示：鏈球菌屬，奈瑟菌屬和韋榮氏球菌屬是結核桿菌的優勢屬，表明痰液菌群的特征可能為肺結核的致病提供重要的見解。(3)細菌的藥敏試驗需要對病原菌進行分離，操作復雜且耗時，無法了解苛養菌的耐藥信息。宏基因組測序技術既可以對病原微生物進行鑒定，也可以通過比對抗性基因數據庫分析其耐藥表型。有研究者通過mNGS 發現氨基酸取代GyrA S83F 和多個RNA 家族外排泵的表達是導致甲型副傷寒沙門菌對喹諾酮類藥物以及頭孢曲松耐藥的原因[16]。SOMMER等[17]采用mNGS對2名健康人的唾液和糞便中的抗性基因進行研究，結果分離出290 個抗生素耐藥基因，并篩選出13 種抗生素的表型抗性文庫。憑借mNGS 對抗菌素耐藥性機制的解析預測病原體耐藥性，可方便臨床醫生為患者定制更優的治療方案。由此可見，無論是在病原菌陽性檢出率、多重感染的鑒定以及細菌耐藥鑒定等方面，mNGS 相比于傳統培養技術均表現出更佳的優勢。

2.2 病毒性感染 病毒是臨床上感染性疾病中常見的病原體之一。其種類多、變異快，傳播途徑多樣可引起人體多部位感染。臨床實驗室對于病毒感染的檢測，目前主要以免疫法、PCR等為主，但這些方法具有一定的局限性：(1)免疫法操作簡單，價格便宜，但結果受限于已有的抗體種類，能夠檢測的病毒種類有限。(2)近年來已有多種多重PCR 的病原體檢測方案，但所涉及的病原體種類也有限，因此一些少見或突變的病毒易被漏檢。研究顯示宏基因組測序技術無論是在病毒檢出率、血清分型以及耐藥性檢測等方面都優于常規檢測方法[18]。在病毒性感染檢測方面，宏基因組測序可有效做到以下幾點：(1)可有效檢出未知及罕見的病原體類型。MAI 等[19]利用mNGS 首次在尿液中鑒定出日本腦炎病毒，表明尿液可作為檢測日本腦炎病毒的一種有價值的診斷標本。HOFFMANN 等[20]通過mNGS 確定了一種新的斑紋松鼠博爾納病毒(VSBV-1)為致命人類腦炎的來源。(2)可在沒有病毒靶標富集的情況下診斷合并感染，從而更及時地在疫情爆發早期對可疑感染患者病情進行鑒別診斷以及對患者進行分類。MOSTAFA等[21]對50例感染嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)的 COVID-19 患者的鼻咽拭子進行mNGS 測序，結果檢測出與肺部疾病惡化有關且豐度較高的流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌以及偏肺病毒，表明SARS-CoV-2 可以增加與肺炎有關的條件致病菌的感染能力。LI 等[22]使用mNGS 在 22 例埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)感染患者的血液樣本中檢測到15 例與出血熱相關的惡性瘧原蟲的合并感染，其他合并感染包括乙型肝炎病毒、人類皰疹病毒4型等。表明mNGS可在EBOV爆發時期對病患感染情況分類提供有力的依據。(3)通過宏基因組測序鑒定病毒基因組可追蹤病毒與感染性疾病之間的聯系。于紅美[23]對腹瀉嬰幼兒糞便樣品中的病毒顆粒進行宏基因組測序、經數據質量篩選、聚類及組裝后生成63 448 條序列，宏基因組分類顯示與病毒相關的2 911條中有29條與輪狀病毒有關。相對于傳統病毒檢測方法，mNGS不僅可解決其在病毒合并感染、罕見及新型病毒檢測上的困難，也有效彌補其在追蹤病毒來源問題上的不足。

2.3 其他感染 除了細菌、病毒外，mNGS 同樣運用到其他種類的感染性病原體如真菌、支原體、衣原體、立克次體、寄生蟲等[5，24-26]。ZHANG 等[27]報道了一例重癥肺炎患者，通過核酸檢測確診為巨細胞病毒和甲型流感病毒感染，在接受抗病毒以及經驗性抗真菌治療后反應不佳，通過mNGS測序在患者支氣管肺泡灌洗液中發現了三種真菌，分別是耶氏肺孢子菌、曲霉和米根霉。進而調整治療方案，患者病情明顯好轉。YANG 等[28]利用 mNGS 和常規檢測手段檢測 106 例疑似肺部真菌感染患者的組織標本和肺泡灌洗液，比較二者在診斷肺部真菌感染的表現，結果顯示mNGS的診斷敏感性顯著高于常規檢查(常規檢查vs活檢-mNGS：44.4% vs 80.0%；常規試驗vs BALF-mNGS：44.4% vs 84.4%)。XIAO等[29]報道一例腎囊腫患者在術后出現感染反應，手術部位引流液和血液的細菌培養均顯示陰性，術后17 d，mNGS的檢測結果顯示人型支原體感染，隨即改變用藥方案，患者痊愈。mNGS 可縮短鸚鵡熱衣原體的診斷時間和病程，克服了鸚鵡熱衣原體分離培養率低及血清學檢測易受交叉反應干擾等問題[24]。宏基因組測序在寄生蟲方面研究較少，未來的研究方向包括寄生蟲的基因組特征以及寄生蟲對腸道微生態環境的影響等[30]。

3 宏基因測序技術中的挑戰

盡管已明確宏基因組測序技術在感染性疾病的病原體診斷中具有明顯優勢，但在實際檢測工作中還存在一些技術與監管方面的問題。(1)高背景人源宿主核酸的干擾：mNGS 可檢測臨床樣本中所有的核酸序列，宿主基因組信息在不同的臨床檢測樣本中都有不同程度的占比，因此mNGS分析產生的巨大數據集中只有一部分可以用于病原體的鑒定，影響檢測的靈敏度[31-33]。(2)樣本、試劑以及實驗環境的污染：在常用的DNA 提取試劑盒和其他實驗室試劑中，外源DNA普遍存在，影響結果判讀，特別是微生物載量低的樣本。為了減少潛在的污染，現已有多種處理方式，如：γ或UV輻射、DNase處理、限制性酶切等[34-35]。(3)測序成本高。序列數據的產生方面成本已有很大降低，但是相比傳統的檢測方法，用于宏基因組測序的儀器和試劑價格均較高。(4)病原體基因組數據庫不完善，有的生物信息數據庫未能囊括所有病原微生物，有可能導致漏檢[36]。目前常用的數據庫有提供細菌、古菌以及真菌基因組的SILVA數據庫和RDP數據庫，提供病毒序列最全面的NCBI-NT 數據庫等。實驗室可結合患者臨床特征選擇合適的分析數據庫以提高微生物鑒定的特異性和敏感性。(5)質量控制與評價的指南缺乏：mNGS 技術流程包含多個步驟，因此需要科學嚴謹的質量控制與評價方案來保證其質量的穩定從而滿足臨床需求。

隨著高通量測序技術的不斷進步，mNGS 對感染病原體的診斷方面越來越有重要的參考價值。綜合以上關于mNGS 優劣所述，在以下幾種情況推薦使用mNGS對感染性疾病進行診斷：(1)多次傳統微生物檢測查陰性，但又有明顯感染癥狀的患者可使用mNGS進行檢測，以克服部分病原菌難培養、罕見及新型病毒檢測難的障礙。(2)針對多重感染情況，結合實際情況可優先考慮使用mNGS。(3)針對疑難重癥，感染原因未知及診斷復雜的情況下，利用mNGS可全面解讀病原微生物構成，分析患者主要病因。(4)臨床醫生如需了解病原體的豐度、多樣性、功能結構及進化關系等以解讀病原體與宿主和環境間的關系時，推薦使用mNGS。

4 小結

綜上，相比傳統的檢測手段，mNGS有無可替代的優勢，但mNGS 無法擺脫其技術本身的局限性，無法解決所有與病原體檢測相關的問題。同時，這一行業發展仍處于發展初期，提供檢測服務的第三方企業較多，應加緊制定規范化、系統化的標準，以利于市場整體的發展和臨床診療的正確實施[37]。臨床醫生應抱著科學嚴謹的態度，以合理的方式將mNGS 應用于病原微生物的檢測。未來，隨著mNGS 相關質量標準確立、自動化程度逐漸提升、成本進一步降低，mNGS 的臨床應用會更加成熟與廣泛。在感染性疾病病原體的檢測、細菌耐藥基因的檢測、病原微生物毒力基因的檢測、菌株分型、微生物進化等方面會有更加突出的貢獻。