可見光促進的香豆素類衍生物的綠色仿生催化合成及分光光度法定量分析

張帝，夏天，羅永祥，王兮

湖南大學化學化工學院，長沙 410082

目前本科基礎有機化學實驗教學內容主要由教科書中經典的有機反應組成，重點操作包含加熱回流、趁熱過濾、重結晶、薄層色譜、柱色譜、蒸餾等操作。然而有機化學是一門快速發展的學科，近年來有機合成的機理研究和合成技術已有很大進步，但這些新興的技術在基礎實驗教學中的推廣普及較為滯后，尤其較少涉及光促進的反應。現代有機合成已普遍采用旋轉蒸發、核磁共振等手段進行合成和表征，這些方法應當成為化學專業學生的基本技能。本實驗從自由基環合反應中獲得靈感，將光促進的自由基型香豆素合成方法設計為本科教學實驗，增加了光反應、Schlenk技術、流動相技術等操作練習，使本科教學與科技前沿接軌。

1 實驗背景

1.1 香豆素合成方法的比較

香豆素是香豆酸的內酯，其衍生物廣泛分布在自然界中。香豆素衍生物具有很好的生物活性，大量存在于抗腫瘤、抗菌、抗凝血等藥物中[1]。其中，含有香豆素骨架的分子(+)-calanolide A是一種高效的HIV-1逆轉錄酶抑制劑，已被美國FDA批準進入三期臨床實驗(圖1)。此外，香豆素類化合物還被廣泛應用于生物熒光探針領域[2–4]，具有重要的研究價值和廣闊的市場前景。

圖1 含有香豆素骨架的功能分子

目前已有的香豆素合成方法包括：Perkin反應、Knoevengle反應、Wittig反應、Pechmann反應等(圖2)[5]，這些方法在工業合成上得到了應用，但也存在一些局限性，例如：反應條件劇烈、副反應多、官能團兼容性不好等。

圖2 香豆素結構的傳統合成方法

本方案將前沿的有機合成方法和技術應用到本科實驗教學中[6]。反應使用了廉價的起始原料E型肉桂酸和光敏催化劑維生素B2，在405 nm的可見光照射下，利用常壓氧氣作為氧化劑，反應條件溫和，官能團兼容性好，且綠色環保，一定程度彌補了傳統合成方法的不足[7–18]。反應涉及《基礎有機化學》教材中的烯烴順反異構等知識點，也包含光促進反應、自由基環化、仿生催化、碳氫鍵直接官能團化等有機化學前沿知識。

1.2 香豆素類化合物的分析方法

目前香豆素的定量檢測方法主要有氣相和液相色譜法等，這些方法有檢測限低、分辨率高、靈敏度高等優點，但儀器相對比較昂貴。此外，氣相色譜法因儀器本身的特點無法適用于高沸點或熱穩定性差的香豆素類衍生物的定量分析，液相色譜儀則有儀器本身和HPLC級的溶劑耗材價格相對比較昂貴等特點。基于此，本方案設計了一種操作簡單且兼具準確性和高靈敏度的香豆素類化合物的定量分析方法。該方法利用香豆素在堿性條件下與鹽酸羥胺反應開環生成苯酚酰基羥胺[9]，進一步與三氯化鐵絡合生成深紅色的配合物，對該配合物使用分光光度法定量分析[10]。

2 實驗內容

2.1 實驗原理

可見光促進下氧氣參與的E型肉桂酸C(sp2)―H鍵氧化環內酯化反應見圖3。可能的反應機理見圖4。

圖3 反應示意圖

第一步為E型肉桂酸的碳碳雙鍵的順反異構反應形成Z型肉桂酸。在光敏催化劑存在下，可見光促進烯烴雙鍵斷開，形成雙自由基中間體I1，此時的碳碳單鍵可以自由旋轉，重構碳碳雙鍵形成Z型烯烴。本項目針對反應基于計算化學手段得到R = CH3的E型到Z型烯烴轉化的能量差為6.7 kJ·mol-1(圖5)，該計算過程可在普通筆記本電腦上完成。

圖5 烯烴順反異構

第二步為經由自由基過程的C(sp2)―H鍵氧化環內酯化。如圖4中機理所示，光敏催化劑維生素B2攫取羧酸的質子形成RFH+和羧酸負離子I2，再被可見光激發到具有強氧化性的激發RFH+*，RFH+*將羧酸單電子氧化成羧基自由基I3時得到RFH*。所得到的羧基自由基發生對芳環的自由基加成，得到中間體I4，I4經由HAT (Hydrogen Atom Transfer)過程得到香豆素最終產物。在HAT過程中RFH*得到氫原子形成RFH2，最后經由氧氣氧化回到光敏催化劑的初始狀態RF完成催化循環。

本方案中香豆素類衍生物的定量分析是基于香豆素在堿性條件下與鹽酸羥胺反應開環再與三氯化鐵配位形成有深紅色的配合物的反應特性，以及分光光度法對一系列濃度梯度的該配合物作標準曲線，擬合出吸光度與產物濃度的定量關系(圖6)。

圖6 異羥肟酸鐵顯色反應

2.2 試劑或材料

實驗中所用主要試劑見表1。

表1 化學試劑信息

市售的分析純甲醇和乙腈含有少量的水、氧氣以及雜質，為了使反應有更好的重復性，甲醇和乙腈根據溶劑處理手冊重蒸純化處理[18]。

薄層色譜的高錳酸鉀顯色劑配制方法：將1.5 g高錳酸鉀和5.0 g碳酸氫鈉溶解于400 mL水中，攪拌均勻。

三氯化鐵溶液配制方法：5 g無水氯化鐵，溶解于10 mL濃鹽酸，再加入90 mL去離子水稀釋。

其他儀器和耗材：移液管(0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL)，容量瓶，磁力攪拌器，聚四氟乙烯攪拌磁子，薄層層析板，薄層層析板專用玻璃缸，稱量紙，藥匙，量筒，層析柱，毛細管，試管，錐形瓶，磨口圓底燒瓶，試劑瓶，注射器(2 mL)，滴管，乳膠氣球等。

2.3 儀器和表征方法

反應在Schlenk體系中進行。1H NMR和13C NMR用JEOL JNM-ECZ400S/L1核磁共振儀測定(400 MHz，室溫，溶劑為氘代氯仿)，化學位移基準(δ)由氘代氯仿的參考值給出：δ7.26 (1H NMR)，δ77.16(13C NMR)。405 nm LED光反應器(自制，光宏1.0 W 405 nm LED燈珠20粒，如圖7)。TLC顯色紫外燈(254 nm，ZF-I型三用紫外分析儀，上海光豪)。旋轉蒸發儀(德國海道夫，Hei-VAP Core ML/G3)。紫外-可見光分光光度計(日本島津，UV-1900I)。

圖7 實驗裝置

2.4 實驗步驟與方法

用分析天平稱取E型肉桂酸(75.0 mg, 0.500 mmol, 1.0 equiv)，維生素B2 (10.0 mg, 0.0250 mmol,5% (x))，無水硫酸鎂(0.300 g, 2.50 mmol, 5.0 equiv)，加入到干燥的Schlenk反應管中。將反應管抽真空，再充入氧氣，反復3次，保障反應在氧氣氛下進行，然后插上一個常壓氧氣球。用注射器向Schlenk管中加入無水甲醇(2 mL)和無水乙腈(2 mL)。將Schlenk反應管置入光反應器中，在405 nm可見光照射下通風攪拌6 h，期間用薄層色譜法監測反應進度。反應結束后，過濾除去不溶物，用乙酸乙酯(15 mL)洗滌沉淀，合并濾液和洗滌液，用旋轉蒸發儀除去溶劑，柱層析(V石油醚:V乙酸乙酯=8 : 1)得到最終產物(圖8)。產物溶解于氘代氯仿，利用核磁氫譜和碳譜表征。

圖8 (a) 光促進的反應過程；(b) 旋轉蒸發儀移除溶劑；(c) 薄層色譜點板情況(堿性高錳酸鉀顯色)

配制標準溶液：利用萬分之一分析天平稱量和100 mL的容量瓶定容，配制香豆素的乙醇標準溶液(0.05 mol·L-1)，鹽酸羥胺的乙醇溶液(0.5 mol·L-1)，稀鹽酸溶液(1.0 mol·L-1)，氫氧化鉀的水溶液(6.0 mol·L-1)，三氯化鐵的水溶液(5.0% (w))。本文中標準曲線對應的香豆素乙醇標準溶液配制時的實際稱量質量為0.7291 g。

用移液管分別向6支試管中精確加入鹽酸羥胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氫氧化鉀水溶液(0.200 mL)，然后用移液管分別往上述6支試管中精確加入香豆素乙醇標準溶液(0.500 mL，0.600 mL，0.700 mL，0.800 mL，0.900 mL，1.000 mL)，加熱至沸騰5 min。冷卻后，用移液管加入稀鹽酸溶液(2.000 mL)和氯化鐵的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，振蕩搖晃使其均勻。在最佳吸收波長處(450 nm)，先進行空白實驗掃描基線，然后分別測量各樣品的吸光度值，繪制標準曲線。

配制待測溶液：用容量瓶定容，將產物精確配制成乙醇溶液(10 mL)。

用移液管向測試樣品的試管中精確加入鹽酸羥胺的乙醇溶液(1.000 mL)和氫氧化鉀水溶液(0.200 mL)，然后精確加入待測的香豆素乙醇溶液(1.000 mL)，加熱至沸騰約5 min。冷卻后，用移液管加入稀鹽酸溶液(2.000 mL)和氯化鐵的水溶液(0.300 mL)，后定容至10 mL，搖晃均勻。測量其吸光度值，代入標準曲線擬合出的方程，計算待測產物中的香豆素含量。

3 實驗結果

3.1 產率

為滿足本科實驗教學要求，需要將原始文獻中所報道的反應規模0.1 mmol放大至0.5 mmol，且保證反應產率和反應重復性以及控制反應時間。本方案中分別從光的輻射強度、溫度、催化劑、反應氣體氛圍、溶劑等方面進行了一系列優化(表2)，經不同實驗人員多次重復，反應產率穩定在75% ± 2%，無明顯副反應。

表2 反應條件優化

3.2 結構表征結果

測得目標產物的核磁共振氫譜和碳譜(圖9)，與已知文獻譜圖[5]比對，確定其結構。核磁數據如下：

圖9 核磁共振氫譜(上)與碳譜(下)

3.3 標準曲線法定量分析結果

對6組不同濃度的樣品每組平行測量3次其吸光度，取平均值得到平均吸光度(表3)，進行線性擬合(圖10)，線性方程為y= 0.0264x+ 0.0703，相關系數r= 0.999，符合非常好的線性關系。

圖10 香豆素含量與吸光度之間的線性關系

表3 異羥肟酸鐵在不同濃度下的吸光度

3.4 條件優化思路

自制的405 nm可見光光反應器，使用了雙排LED燈珠相對照射，(每個燈珠1 W，20個燈珠，共20 W)，相較于普通臺燈反應效率(產率45%)有明顯提升，且反應器內裝有風扇通風，保證了反應體系溫度不會因長時間燈光照射而過熱，使體系接近環境溫度，且無光泄露污染，完全滿足實驗教學安全性要求。

反應需要充足的氧氣源，對比15 mL的Schlenk管中充入氧氣后封管反應，因氧氣量不夠，導致產率下降。外加常壓氧氣氣球，一方面可以補充氧氣源，另一方面可以穩定反應體系內的壓力。

3.5 拓展與放大(連續流動相反應，Continuous Flow Synthesis)

本方案中在Schlenk反應管中的反應規模為0.5 mmol，分離收率為78%，可以作為半微量實驗應用于本科實驗教學中。但如果直接在Schlenk反應瓶中將反應規模放大10倍到5.0 mmol，因為光對溶液的輻射面積和穿透性均有限，造成分離收率急劇下降到25%。本方案利用前沿的連續流動相技術，結合本反應需要光照以及氧氣參與等特點，設計了一套簡單、廉價、實用的連續流動相的光輻射氣體反應裝置(圖11)。其部件包括：光反應器、石英螺旋管、可控流速的蠕動泵、氣球等。將螺旋管置于光反應器內，增大光照面積、提高光輻射效率，蠕動泵可帶動封閉體系內溶液循環流動，并增加溶液與氧氣的接觸。因為有機溶劑持續流動造成體系內壓力變化，氧氣氣球同時也可以起到緩沖作用穩定體系內壓力。利用這套裝置可將反應規模放大到5.0 mmol，使用10% (x)的光敏催化劑，控制流速為41.5 mL·min-1，反應24 h，以72%的分離收率得到最終目標產物，且無其他副反應，該連續流動相方案可以作為學生實驗中的另一種選擇方案進行大規模反應嘗試。

圖11 連續流動相光反應裝置示意圖

本裝置在提高反應實用性的同時，為本科實驗教學提供了更多樣化的選擇，讓學生對反應的合成應用和工業生產有了更進一步的認識。反應裝置的搭建也讓學生從多角度思考影響反應效率的因素，提高學生多方面動手和思維能力，體驗化學實驗的趣味性。

4 結語

本項目包括有機合成反應，產物純化和表征，定量分析三個部分。合成反應具有安全高效，條件溫和，起始原料廉價易得，無明顯副反應，操作簡單，環境友好，重復性好等優點。其作為一項本科教學實驗項目，可以很好地起到鞏固有機化學基礎知識和訓練有機實驗操作的作用，同時多學科交叉，有利于學生對多學科知識的融會貫通。由于剩余原料肉桂酸和香豆素的Rf值相差很大，因此純化過程簡單。利用分光光度法定量分析化合物確定其純度是本科分析化學教學的重要內容。異羥肟酸鐵的顯色反應一般被應用于定性鑒定酯類化合物，本方案將該特異性反應結合分光光度法應用于香豆素產物的定量表征。實驗操作涉及移液、定容、絡合物顯色，紫外-可見分光光度計的使用，以及連續流動相光輻射氣體反應裝置的搭建等一系列操作。

本方案通過學科交叉的綜合性實驗，對學生的基礎知識和實驗技能進行了全面系統的訓練。既培養學生了解化學前沿知識也注重學生基礎知識的鞏固。本實驗歷時約10 h，具有內容涵蓋廣泛、安全、重復性好等特點，非常適合于本科實驗教學[19–21]。可采用分組合作完成實驗的模式，提高學生團隊精神和協作能力。