基于超分子自組裝策略定性和定量檢測(cè)奶粉中的三聚氰胺

察爽爽，牛金盆，劉川楓，嚴(yán)杰，朱敏，張?chǎng)饔?/p>

西安交通大學(xué)化學(xué)學(xué)院，西安 710049

1 引言

在2008年曝出的毒奶粉事件中，有數(shù)萬(wàn)嬰幼兒因奶粉中摻雜三聚氰胺而受到腎損傷[1,2]。三聚氰胺雖然只有低毒性，但長(zhǎng)期攝入，會(huì)形成無(wú)法溶解的三聚氰胺氰尿酸(氰尿酸又稱(chēng)三聚氰酸，可通過(guò)三聚氰胺在人體內(nèi)代謝產(chǎn)生)沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的腎結(jié)石[3–5]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22388–2008)規(guī)定的高效液相色譜法[6,7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8,9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等檢測(cè)原料乳與乳制品中三聚氰胺含量的方法優(yōu)點(diǎn)明顯：檢測(cè)限低，測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確；但缺點(diǎn)也相當(dāng)突出：樣品的前處理十分復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用高。而這一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用分光光度法測(cè)定吸光度值，快速檢測(cè)出三聚氰胺含量，原料易得，儀器造價(jià)低，該法易在實(shí)驗(yàn)室及基層普及，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1987年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主J.M.Lehn在獲獎(jiǎng)演講中首次提出“超分子化學(xué)”的概念[11]。超分子化學(xué)是研究多個(gè)分子通過(guò)非共價(jià)鍵作用形成的功能體系的科學(xué)，即通過(guò)分子間相互作用，實(shí)現(xiàn)分子間的識(shí)別和自組裝[12–14]。本實(shí)驗(yàn)將超分子自組裝的方法引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，利用三聚氰胺和氰尿酸形成的超分子對(duì)亞甲基藍(lán)的包裹作用，采用測(cè)量吸光度的方法，對(duì)奶粉中的三聚氰胺進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。操作過(guò)程簡(jiǎn)單，現(xiàn)象明顯，適合教學(xué)實(shí)驗(yàn)，除涉及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)基本操作外，加入紅外光譜、高效液相色譜等多種表征手段，使學(xué)生更好地適應(yīng)現(xiàn)代科學(xué)表征技術(shù)的發(fā)展，激發(fā)學(xué)生興趣。同時(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容可模塊化選擇進(jìn)行，滿(mǎn)足不同層次的實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

分子自組裝即利用分子識(shí)別，通過(guò)非共價(jià)作用形成具有特定排列順序的分子聚合體[3,15]。三聚氰胺與氰尿酸通過(guò)分子識(shí)別，在氫鍵誘導(dǎo)下即可實(shí)現(xiàn)自組裝形成超分子，如圖1所示[16]。

圖1 三聚氰胺與氰尿酸形成交聯(lián)超分子[16]

在該過(guò)程中，若自組裝以氫鍵為主要驅(qū)動(dòng)力，則任何破壞或者促進(jìn)氫鍵作用的化合物都會(huì)改變組分的自組裝能力[17,18]，亞甲基藍(lán)作為常見(jiàn)的指示劑，其自身的強(qiáng)極性會(huì)誘導(dǎo)三聚氰胺與氰尿酸進(jìn)行自組裝交聯(lián)(圖2)。在該體系中，亞甲基藍(lán)被包裹于超分子中，從而導(dǎo)致顏色變化明顯。而不同濃度的三聚氰胺溶液產(chǎn)生的自組裝體系對(duì)亞甲基藍(lán)的包裹情況不同，導(dǎo)致反應(yīng)離心后得到的清液中亞甲基藍(lán)的濃度不同，進(jìn)而導(dǎo)致吸光度的不同。研究不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系吸光度的變化，繪制吸光度曲線，可達(dá)到對(duì)奶粉中三聚氰胺定性定量檢測(cè)的目的。

圖2 亞甲基藍(lán)對(duì)交聯(lián)超分子形態(tài)的影響

2.2 試劑或材料

實(shí)驗(yàn)所用試劑詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑表

2.3 儀器和表征方法

實(shí)驗(yàn)所用儀器詳見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)儀器表

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟/方法

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如果用于教學(xué)，可模塊化進(jìn)行，研究三聚氰胺濃度與吸光度的關(guān)系，即進(jìn)行至2.4.3，約需要6個(gè)學(xué)時(shí)；若繼續(xù)對(duì)奶粉中三聚氰胺進(jìn)行定性和定量分析，即進(jìn)行至2.4.6，實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)延長(zhǎng)至8學(xué)時(shí)；若繼續(xù)進(jìn)行儀器表征，即進(jìn)行至2.4.11，延長(zhǎng)至12學(xué)時(shí)，可滿(mǎn)足不同層次的實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求。

2.4.1 溶液的配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品3.0000 g，用適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

氰尿酸飽和溶液的配制：稱(chēng)取稍過(guò)量氰尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，在燒杯中用適量水溶解得到飽和氰尿酸溶液。

亞甲基藍(lán)溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取亞甲基藍(lán)0.1000 g，用適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，用水定容至刻度，配制成亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

三聚氰胺溶液的稀釋?zhuān)菏褂靡埔簶寽?zhǔn)確移取一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶，稀釋成濃度分別為0.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0 mg·L-1的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4.2 亞甲基藍(lán)與奶粉清液最大吸收波長(zhǎng)的確定

分別取亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液和奶粉清液于比色皿中，以水為參比液，在波長(zhǎng)330–900 nm區(qū)間，測(cè)定其吸光度，繪制工作曲線以確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(除濁)

使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液于玻璃瓶中，加入100 μL的亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，再使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL氰尿酸飽和溶液于玻璃瓶中，反應(yīng)15 min，混勻后離心5 min。

在對(duì)照組中，移取等量同樣濃度的三聚氰胺與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻后離心5 min，以該上層清液作為參比，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 奶粉處理方法

為了定量分析奶粉中三聚氰胺的濃度，對(duì)奶粉樣品進(jìn)行處理，方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g奶粉樣品于試管中，加入100 mL 30 °C的水溶解奶粉，超聲振蕩10 min。使用離心機(jī)在4000 r·min-1的條件下離心5 min，并用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到奶粉清液。

2.4.5 奶液中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將不同質(zhì)量三聚氰胺與奶粉進(jìn)行混合溶解，對(duì)奶粉溶液進(jìn)行處理，得到含有不同濃度三聚氰胺的奶粉清液。

使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL不同濃度的三聚氰胺奶粉溶液于玻璃瓶中，加入100 μL亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL氰尿酸飽和溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min。

在對(duì)照組中，移取等量同樣濃度的三聚氰胺奶粉溶液與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min，以該上層清液作為參比，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.6 奶粉中三聚氰胺檢測(cè)

向奶粉中混有一定量的三聚氰胺，對(duì)奶粉進(jìn)行處理，使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL處理后的奶粉清液，加入100 μL亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用移液槍準(zhǔn)確移取5 mL氰尿酸飽和溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min。

在對(duì)照組中，使用移液槍移取等量奶粉清液與氰尿酸溶液，反應(yīng)15 min，混勻離心5 min，以該上層清液作為參比，測(cè)定吸光度，測(cè)定奶粉中三聚氰胺的含量，計(jì)算檢出率。

2.4.7 紅外光譜分析

將1–2 mg試樣與200 mg純KBr研細(xì)均勻，壓成透明薄片，等待測(cè)定。在電腦上進(jìn)入OPUS，運(yùn)行操作軟件，設(shè)置保存峰位、輸入樣品名稱(chēng)以及掃描波長(zhǎng)范圍，開(kāi)始測(cè)試，等待結(jié)果。

2.4.8 SEM分析(掃描電子顯微鏡)

充分干燥樣品，在硅片上粘貼導(dǎo)電膠并蘸取適量樣品涂抹于導(dǎo)電膠表面，放入噴金機(jī)中噴金，固定樣品，抽真空，設(shè)定工作電壓為15 kV，工作距離為8.2 mm，放大樣品并進(jìn)行調(diào)焦，找到清晰視野進(jìn)行拍照。

2.4.9 XPS分析(X射線光電子能譜)

充分干燥樣品，在鋁箔上粘貼雙面膠并蘸取適量樣品涂抹于雙面膠表面，壓片，使樣品固定緊實(shí)，在X射線最大功率100 W和最大束斑500 μm條件下對(duì)樣品表面進(jìn)行掃描。

2.4.10 XRF分析(X射線熒光光譜)

將制好的試樣進(jìn)行特征元素S和Cl分析，打開(kāi)分析測(cè)試儀器軟件，預(yù)熱30 min，放入分析樣品；設(shè)定相應(yīng)參數(shù)，校正儀器，分析測(cè)試樣品，并記錄測(cè)試結(jié)果。

2.4.11 反相高效液相色譜處理

將配制好的氰尿酸溶液、三聚氰胺溶液、亞甲基藍(lán)溶液、反應(yīng)后的奶粉清液與流動(dòng)相進(jìn)行脫氣過(guò)濾，在波長(zhǎng)238 nm下，選擇甲醇為流動(dòng)相，流動(dòng)相流量為1 mL·min-1，柱溫為室溫后開(kāi)始測(cè)試，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)試等待結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 紅外光譜分析

三聚氰胺、氰尿酸及不含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物紅外光譜見(jiàn)圖3，可以看出反應(yīng)產(chǎn)物的紅外特征峰(C＝O伸縮振動(dòng)：1736 cm-1；三聚氰胺NH2彎曲振動(dòng)：1663 cm-1)相較于三聚氰胺(N―H伸縮振動(dòng)：3334–3419 cm-1)和氰尿酸(C＝O伸縮振動(dòng)：1722 cm-1)的特征峰明顯向低波數(shù)區(qū)發(fā)生移動(dòng)，且峰形變寬，說(shuō)明三聚氰胺與氰尿酸反應(yīng)后產(chǎn)生了氫鍵，二者以氫鍵為驅(qū)動(dòng)力發(fā)生了自組裝。

圖3 三聚氰胺、氰尿酸及不含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物紅外光譜對(duì)比圖

比較含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物與不含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物的譜圖(圖4)，可以看出特征峰無(wú)論峰形還是位置，均無(wú)明顯變化，說(shuō)明亞甲基藍(lán)誘導(dǎo)三聚氰胺與氰尿酸進(jìn)行自組裝，仍是氫鍵作用，未有新鍵形成。

圖4 含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物與不含亞甲基藍(lán)產(chǎn)物紅外光譜對(duì)比圖

3.2 SEM分析

未加入亞甲基藍(lán)時(shí)，三聚氰胺與氰尿酸形成的寡聚物在電鏡下主要呈棒狀，隨后棒狀聚集體進(jìn)一步聚集堆疊成較大尺寸的超分子聚集體，棒狀形貌占主體(圖5)；加入亞甲基藍(lán)后，三聚氰胺與氰尿酸形成的寡聚物主要為不規(guī)則球狀，球狀進(jìn)一步聚集堆疊成大尺寸的超分子聚集體(圖6)。亞甲基藍(lán)加入前后的電鏡形貌有顯著區(qū)別，這是由于亞甲基藍(lán)占據(jù)部分氫鍵位點(diǎn)，影響了組裝的規(guī)整程度，從而改變了三聚氰胺與氰尿酸所形成寡聚物的聚集形貌。

圖5 ME與CA形成交聯(lián)超分子SEM圖

圖6 ME、MB與CA形成交聯(lián)超分子SEM圖

3.3 XPS分析

為說(shuō)明亞甲基藍(lán)在體系中的存在狀態(tài)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行XPS分析，獲得全譜如圖7所示，對(duì)XPS全譜進(jìn)行積分處理并結(jié)合各元素軌道譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)全譜中不含S、Cl元素軌道譜的成分，說(shuō)明超分子表面沒(méi)有亞甲基藍(lán)存在。

圖7 反應(yīng)產(chǎn)物XPS全譜

3.4 XRF分析

在明確表面無(wú)亞甲基藍(lán)后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了XRF分析，結(jié)果顯示在產(chǎn)物中，元素含量S : Cl =47.9% : 52.1%，說(shuō)明在該反應(yīng)體系中的確存在亞甲基藍(lán)。由于前面XPS已說(shuō)明產(chǎn)物表面并未出現(xiàn)亞甲基藍(lán)，因而在反應(yīng)產(chǎn)物中，亞甲基藍(lán)是被不規(guī)則小球(圖6)包裹而并非被吸附。

3.5 亞甲基藍(lán)吸光度曲線

如圖8，在波長(zhǎng)665 nm處，亞甲基藍(lán)有最大吸收峰，而在該波長(zhǎng)下(圖9)，奶粉清液基本無(wú)吸收，對(duì)亞甲基藍(lán)的吸收影響較少，因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程中可采用這一波長(zhǎng)為工作波長(zhǎng)。

圖8 亞甲基藍(lán)吸光度-波長(zhǎng)曲線

圖9 奶粉清液吸光度-波長(zhǎng)曲線

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系的吸光度曲線，如圖10所示。曲線與三聚氰胺濃度呈現(xiàn)極好的負(fù)相關(guān)，說(shuō)明反應(yīng)可行。

圖10 反應(yīng)液吸光度標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線

3.7 奶液中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定奶液中不同濃度三聚氰胺反應(yīng)體系的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線，曲線與三聚氰胺濃度呈現(xiàn)極好的負(fù)相關(guān)，可對(duì)奶粉中的三聚氰胺進(jìn)行定量檢測(cè)。

3.8 定性檢出限的確定

根據(jù)三聚氰胺吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，已知定量檢出限為2 mg·L-1(2–40 mg·L-1為線性關(guān)系，小于2 mg·L-1則不再出現(xiàn)線性)，現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的定性檢出限進(jìn)行探討，已知三聚氰胺濃度為0時(shí)，吸光度為0.855，標(biāo)準(zhǔn)差為0.002，根據(jù)IUPAC建議的檢出限計(jì)算公式AL=A0± 3S(其中A0代表吸光度，AL代表檢出限，S代表標(biāo)準(zhǔn)差)，檢出限對(duì)應(yīng)吸光度數(shù)值應(yīng)低于0.849。根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)，三聚氰胺濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，檢出全部為陽(yáng)性。

綜上，可確定本實(shí)驗(yàn)定性檢出限為0.10 mg·L-1(由實(shí)驗(yàn)過(guò)程中奶粉與三聚氰胺的混合比例可將濃度轉(zhuǎn)化為質(zhì)量比，即2.0 mg·kg-1)，根據(jù)2019年國(guó)家衛(wèi)生部公布的三聚氰胺添加標(biāo)準(zhǔn)(2.5 mg·kg-1)，說(shuō)明該檢測(cè)方法可基本滿(mǎn)足三聚氰胺檢測(cè)要求。

3.9 檢出率

向奶粉中混入一定量三聚氰胺，進(jìn)行預(yù)處理后，測(cè)定體系的吸光度(圖11)，根據(jù)奶粉中三聚氰胺的吸光度曲線計(jì)算得到三聚氰胺的理論含量，計(jì)算檢出率。對(duì)含有三聚氰胺的奶液體系進(jìn)行反復(fù)檢出，計(jì)算得到檢出率為95%–99%。

圖11 加入預(yù)處理奶液的反應(yīng)液吸光度標(biāo)準(zhǔn)擬合曲線

3.10 反相高效液相色譜分析

由圖12可以確定三聚氰胺、氰尿酸和亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液的出峰位置，確定三者的保留時(shí)間(圖13)，氰尿酸保留時(shí)間為2.745 min，三聚氰胺保留時(shí)間為2.876 min，亞甲基藍(lán)保留時(shí)間為7.364 min (因無(wú)影響已除去)。

圖12 三聚氰胺定性檢出限散點(diǎn)圖

圖13 三聚氰胺、氰尿酸、亞甲基藍(lán)及反應(yīng)后清液色譜圖

由圖14可以看到反應(yīng)后的清液不存在三聚氰胺特征峰，說(shuō)明其中基本不含有三聚氰胺，這也側(cè)面說(shuō)明了利用三聚氰胺與氰尿酸反應(yīng)的自組裝機(jī)理對(duì)三聚氰胺進(jìn)行定量檢測(cè)，檢出效率高。

圖14 三聚氰胺及反應(yīng)后清液色譜圖

4 條件優(yōu)化

4.1 溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

分別在不同溫度條件下，對(duì)混有三聚氰胺的奶粉進(jìn)行前處理，測(cè)定吸光度(圖15)，在奶液標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取三聚氰胺濃度，比較不同溫度下的檢測(cè)效果，說(shuō)明溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

圖15 吸光度-溫度關(guān)系

在溫度為25 °C時(shí)，吸光度最小，檢測(cè)出三聚氰胺的濃度最大，相較于其他溫度效果較好，因而在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可以采取室溫作為反應(yīng)條件。

4.2 時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

在不同反應(yīng)時(shí)間下開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)體系中吸光度的變化，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響(圖16)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸降低，三聚氰胺的檢測(cè)濃度隨之升高，而在反應(yīng)15 min后，吸光度基本不變。因而可以采取15 min作為反應(yīng)條件。

圖16 吸光度-時(shí)間關(guān)系

5 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)基于超分子自組裝原理，利用亞甲基藍(lán)對(duì)三聚氰胺與氰尿酸交聯(lián)形成超分子的誘導(dǎo)作用，提出了一種新型的定性和定量檢測(cè)三聚氰胺的方法，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富，同時(shí)結(jié)合社會(huì)實(shí)際問(wèn)題，有利于拓寬學(xué)生的知識(shí)面，激發(fā)化學(xué)研究的興趣。

本實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，綠色環(huán)保，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，同時(shí)涉及多種基本實(shí)驗(yàn)操作與表征方法，對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練和提高有很大幫助。本實(shí)驗(yàn)可模塊化教學(xué)，滿(mǎn)足不同學(xué)時(shí)的實(shí)驗(yàn)要求，適合作為本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行推廣。

6 創(chuàng)新性/特點(diǎn)/特色聲明

(1) 引入超分子自組裝概念，將研究熱點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合；

(2) 綜合運(yùn)用超分子化學(xué)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)等多學(xué)科知識(shí)和多種表征手段與方法，解決社會(huì)實(shí)際問(wèn)題；

(3) 可模塊化教學(xué)，開(kāi)展不同學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)，適合于本科教學(xué)培養(yǎng)。