Th17/Treg 失衡在肝性腦病發病中的作用及與AST、ALT 和血氨的相關性

計鈺亮，朱婷婷，楊君寅

肝性腦病（HE）是由于各種急慢性肝病導致的肝功能障礙或門體分流異常所引發，常伴有不同程度的代謝紊亂和神經精神異常癥狀，是各種肝病發展至終末期常見的并發癥，也是導致終末期肝病患者死亡的主要原因[1]。HE 患者可表現為不同程度的性格改變、行為異常等，隨著疾病進展甚至出現譫妄、嗜睡及昏迷等意識障礙，加劇患者的肝病進程，對患者的預后造成不利影響[2]。關于HE的發病機制至今尚未完全闡明，目前國內外較為公認的機制包括較為經典的氨中毒學說、神經遞質的改變、大腦星形膠質細胞早衰以及血腦屏障通透性的改變等[3-4]。近年隨著研究的深入，免疫因素、炎性應激反應等機制也被認為與HE 的發生和發展關系密切[5]。輔助型T 淋巴細胞（Th17）和調節型T 細胞（Treg）是CD4+T 淋巴細胞的分化表型，其在機體免疫調節中起著重要作用，并參與機體炎癥的發生及發展。有研究表明，高氨血癥與炎癥反應可相互作用，誘導HE的發生和發展，Th17/Treg失衡反映患者免疫功能失調，而且患者血氨水平升高可誘導星形膠質細胞和小膠質細胞活化，進一步釋放腦源性炎性因子，引發神經系統炎癥[6]。為進一步明確HE 患者Th17/Treg失衡與病情的關系，本研究將對HE 患者Th17/Treg 水平和肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和血氨的關系進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2021年7月中國人民武裝警察部隊海警總隊醫院收治的肝病患者179例。HE診斷標準參照《中國肝性腦病診治共識意見》[7]中的標準。排除標準：（1）代謝性腦病；（2）神經系統其他病變；（3）精神障礙患者；（4）血管性癡呆及腦萎縮等。按照是否發生HE 分為HE 組（n=79）和無HE 組（n=100）。HE 組男45例，女34例；年齡49 ～71歲，平均（60.1±8.4）歲；病程8 ～17年，平均（12.61±3.35）年；病因：酒精性肝硬化36例，肝炎后肝硬化43例；HE分級[8]：輕度23例，中度27例，重度29例。無HE 組共100例，其中男69例，女31例；年齡48 ～72歲，平均（60.9±8.8）歲；病程8 ～19年，平均（13.02±3.64）年；病因：酒精性肝硬化47例，肝炎后肝硬化53例。兩組一般差異無統計學意義（P ＞0.05）。本研究患者家屬知情同意且簽署知情告知同意書，本研究通過醫院醫學倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 Th17/Treg 水平檢測 采集患者晨起空腹12 h 外周靜脈血10 ml，血液中加入Hank’s 緩沖液和淋巴細胞分離液，經2 000 r/min離心處理20 min，將細胞分層后吸取最上層的淋巴細胞層得到外周血中單個核細胞；使用PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，每管加入2 ml permeabilization buffer，室溫避光孵育15 min，離心處理后棄上清液；繼續加入100 l permeabilization buffer 室溫孵育15 min，室溫下避光反應30 min，使用PBS 溶液洗滌2 次，1 000 r/min 離心處理5 min 棄上清液；加入2 ml 流式染色液將細胞沉淀重懸，于30 min 內使用流式細胞檢測儀（賽默飛Attune NxT 流式細胞儀）分別測定Th17 和Treg 水平，并計算Th17/Treg。檢測過程中使用的細胞表面染色熒光標記的單抗試劑盒由美國eBioscience 公司生產，嚴格按照試劑盒和檢測儀操作說明進行測定。

1.2.2 肝功能指標和血氨 采集患者晨起空腹靜脈血5 ml，室溫靜置30 min 后經3 500 r/min 離心處理10 min，使用全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，BS-350E）檢測ALT、AST 和血氨水平。

1.3 統計方法 采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t 檢驗；多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用2檢驗；相關性分析采用Pearson 相關分析法和Spearman 相關分析法，并采用受試者工作特征曲線（ROC）分析各指標的價值。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Th17、Treg 和肝功能指標比較 HE 組Th17、Th17/Treg、AST、ALT及血氨水平均高于非HE 組，Treg 水平低于HE 組（均P ＜0.05），見表1。

表1 組Th17、Treg 和肝功能指標比較

2.2 不同嚴重程度HE 患者Th17、Treg和肝功能指標比較 HE 重度組Th17、Th17/Treg、AST、ALT 及血氨水平均高于輕度組和中度組，Treg 水平低于中度組和輕度組（均P＜0.05）；中度組Th17、Th17/Treg、AST、ALT 以及血氨水平均高于輕度組，Treg水平低于輕度組（均P＜0.05）。見表2。

表2 不同嚴重程度HE 患者Th17、Treg 和肝功能指標比較

2.3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平與HE 嚴重程度及肝功能相關指標的關系

Th17/Treg 與AST、ALT、血氨和病情嚴重程度均呈正相關（均P ＜0.05），見表3。

表3 Th17、Treg 和Th17/Treg 水平與HE 嚴重程度以及肝功能相關指標的關系

2.4 Th17/Treg 和肝功能指標評估發生HE 的價值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于評估發生HE 均有較高效能，其中上述指標聯合診斷效能最高，其約登指數為0.734，AUC為0.823，敏感度、特異度分別為90.58%、92.03%。見表4。

表4 Th17/Treg 和肝功能指標評估發生HE 的價值

2.5 Th17/Treg 和肝功能指標評估HE嚴重程度的價值 Th17/Treg、血氨、AST 和ALT 用于評估HE 嚴重程度具有較高效能，其中血氨用于評估HE 嚴重程度的效能最高，其約登指數為0.677，AUC 為0.810，敏感度、特異度分別為89.47%、78.56%。見表5。

表5 Th17/Treg 和肝功能指標評估HE 輕度與中重度的價值

3 討論

HE 是各種肝病發展至終末期的常見并發癥，其多見于肝硬化失代償期和重型肝炎患者，臨床表現和預后情況與發病原因、肝細胞的損傷程度等密切相關，患者可出現不同程度的行為異常、精神異常或意識障礙等，且死亡率較高[9-10]。當前HE 的發病機制尚處于大量研究論證階段，并無明確的標準。明確影響疾病進展的因素對于肝臟原發疾病和HE的及時診治具有重要意義。肝臟疾病的發生和發展以及轉歸與結局與免疫細胞及各類細胞因子的作用關系密切，其中Th17 和Treg細胞能夠相互作用、相互拮抗，達到平衡狀態，在維持免疫內環境的穩定中具有重要的作用，其參與了多種免疫性疾病甚至是腫瘤的發生和發展[11]。本研究結果顯示HE 組Th17、Th17/Treg和肝功能指標AST、ALT 和血氨水平均高于非HE 組，Treg 水平低于非HE 組；這說明HE 患者存在Th17/Treg 失衡，肝功能指標升高。分析原因為Th17 主要參與肝臟炎癥反應過程，而Treg 細胞主要參與機體免疫應答，二者的分化主要取決于肝臟病變微環境中的免疫、炎性細胞因子水平，HE患者多為肝硬化失代償期或重癥肝炎后期，此時機體的Th17水平和白細胞介素-6 的水平明顯升高，參與肝臟的炎性病變，加劇肝臟損傷[12]。隨著肝臟炎性病變的加重，Th17 水平增加加劇肝臟炎性反應，導致Treg 細胞介導的免疫應答受到抑制，Treg 通過下調以維持Th17/Treg 的平衡，并調節機體免疫，進而避免過度的肝細胞損傷，故HE 患者Th17/Treg 高于非HE 組。而HE患者多伴有肝功能衰竭、肝細胞損傷和凋亡嚴重，側支循環的建立，導致氨在門體分流時不經肝臟代謝直接進入體循環，造成血氨水平升高，其代謝產物進入腦組織導致大腦功能的紊亂，因此HE組患者肝功能指標和血氨水平升高[13]。

本研究結果顯示隨著疾病進展HE重度組患者Th17/Treg 及肝功能指標均較輕度組和中度組升高，Th17/Treg隨著病情進展而進一步增加，與HE 進程呈正相關，與肝功能指標AST、ALT 和血氨也呈正相關；這說明Th17/Treg 失衡加劇HE 進展和肝功能損傷。分析原因為Th17 細胞是一種高度促炎的Th 細胞亞型，肝性腦病患者肝功能損傷嚴重時Th17 水平明顯上升，Treg 細胞出現免疫性下調，而在外周血中，Th17 其能夠激活骨髓中中性粒細胞，進而誘導未成熟的單核細胞遷移至血液中，中性粒細胞在Th17 的募集下增加可提高蛋白酶的活性，導致炎性細胞諸如巨噬細胞和單核細胞等釋放增多，使髓鞘和軸突持續受到損傷，且Th17 已被證實更容易通過血腦屏障，表現出神經毒性作用[14]。而血腦屏障的破壞是中樞脫髓鞘病變形成的關鍵，肝功能衰竭患者的轉化增長因子也能夠使血腦屏障的通透性增加，使得大量炎性介質通過血腦屏障進入腦實質，引發神經毒性反應，出現一系列的神經系統病理表現[15]。故隨著肝功能損傷的進一步發展，HE 患者Th17/Treg 失衡越加嚴重，而隨著Th17 和Treg 比例失衡的加劇，血腦屏障破壞嚴重，神經毒性反應加劇，又促進了HE 的進程。而HE 患者病情與肝功能衰竭的程度密切相關，隨著肝細胞的損傷，AST、ALT 等肝功能指標也明顯升高，血氨在肝臟的代謝受到影響，水平明顯升高，故隨著肝功能的進一步損傷，Th17/Treg失衡并誘導炎性反應通過影響血腦屏障參與腦實質的病變中，與HE 的進展和肝功能損害有關。

本研究結果顯示Th17/Treg 聯合AST、ALT 及血氨共同評估肝病患者是否出現HE 的價值較高，且對于鑒別HE嚴重程度也具有較高的效能。分析原因為在肝臟病變早期，Th17 細胞具有一定的清除病毒，延緩感染進程的作用，但隨著炎癥進展，Th17 大量表達和分化導致促炎因子分泌增加，嚴重影響Th17/Treg平衡，促炎因子大量釋放導致肝臟細胞損傷加劇，誘發肝功能衰竭和惡化，隨著患者CD4+、CD25+Treg 細胞數量的降低，細胞毒性T 淋巴細胞的擴增失去控制，引發CD8+細胞毒性T 細胞反應，導致大量肝細胞的壞死，加劇肝衰竭的進程和HE 的風險[16]。另一方面，Th17 細胞還可以通過分泌細胞因子包括白細胞介素-17A、白介素-6、白介素-21 等而對血腦屏障造成免疫攻擊，影響血腦屏障的完整性間接的作用于血腦屏障，加重神經脫髓鞘病變和HE 進程[17]。另外，HE 患者由于肝功能損傷嚴重導致血氨在體內產生蓄積，其代謝產物隨著體循環進入大腦，增加氧化應激和滲透壓，導致星形膠質細胞的水腫，使星形膠質細胞的功能受損，具體表現為異常增殖甚至是細胞凋亡，并釋放腦源性炎性因子引發神經炎癥，加重腦細胞損傷和HE的神經癥狀[18]。