臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝硬化大鼠的治療及抗氧化作用

孫慧聰，孫勝珍，祁世杰，洪訓(xùn)宇，韓冠亞

肝移植是治療終末期肝病的有效方法，但目前由于肝源缺乏、并發(fā)癥多、多種排異反應(yīng)及費(fèi)用昂貴等因素的影響，難以大規(guī)模開展[1]，臨床期待一種新的可替代方案。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有多向分化潛能，能夠分化成軟骨、硬骨、脂肪及其他組織類型，具有來(lái)源豐富及免疫原性較低的特點(diǎn)。多項(xiàng)臨床和亞臨床試驗(yàn)顯示，MSCs可治療急性心肌梗死[2]、腦卒中、急性腎損傷[3]、糖尿病[4]、骨折[5]、肺動(dòng)脈高壓[6]及肝病[7]，另有臨床試驗(yàn)證明MSCs對(duì)嚴(yán)重的移植物抗宿主病有一定作用[8]，但目前MSCs的作用機(jī)制仍不明確[9]。人臍帶源MSCs（hUC-MSCs）是一種從人類臍帶中提取的新型MSCs，目前研究不多，筆者前期研究表明hUC-MSCs 可在體內(nèi)分化為功能性肝細(xì)胞，進(jìn)而改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的肝功能及病理學(xué)變化[10]。本研究以CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型為研究對(duì)象，來(lái)探討hUC-MSCs 移植對(duì)肝硬化大鼠的治療及抗氧化作用，為臨床治療肝硬化提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康成年體質(zhì)量350 ～400 g的清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36 只，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，溫度20 ～25℃，光照明10h/暗14h，自由攝食及飲水。根據(jù)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[11]對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 美國(guó)BECKMAN COULTER 公司生產(chǎn)的CX9 全自動(dòng)生化分析儀；德國(guó)Eppendoff 公司生產(chǎn)的低溫高速離心機(jī)；梅特勒-托利多公司生產(chǎn)的PL1001-L 電子天平；法國(guó)bertin 公司生產(chǎn)的precellys 24 組織均質(zhì)器；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒均由上海碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)；分析純CCl4由上海試劑總廠生產(chǎn)；橄欖油為市售食用橄欖油。天津市和澤干細(xì)胞科技有限公司進(jìn)行hUC-MSCs 的分離、培養(yǎng)及鑒定。

1.3 方法

1.3.1 分離、培養(yǎng)及鑒定hUC-MSCs hUC-MSCs 由天津市和澤干細(xì)胞科技有限公司友情提供。用手術(shù)剪將新分離臍帶剪成小塊，用直徑1.5 mm 的濾網(wǎng)過濾，并接種于T 75 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞融合80%時(shí)，用0.125%胰酶消化，1∶3 傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察hUC-MSCs 形態(tài)，顯示第3 代hUC-MSCs 呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，并漩渦樣生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)hUC-MSCs免疫表型進(jìn)行分析，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為hUC-MSCs（封二彩圖1）。

1.3.2 模型制作及分組 將大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：（1）正常對(duì)照組（n=12）：注射0.9%氯化鈉注射液2 ml/kg；（2）模型對(duì)照組（CCl4+saline 組，n=12）：CCl4造模成功后，尾靜脈注射同等劑量的0.9%氯化鈉注射液，并于移植后第8 周處死大鼠。（3）hUC-MSCs 移植組（CCl4+hUC-MSCs 組，n=12）：造模成功后，大鼠尾靜脈注射hUC-MSCs 5×106個(gè)/只，并于移植后第8 周處死大鼠。按2 ml/kg 劑量，每周2次大鼠四肢輪流皮下注射40% CCl4橄欖油溶液進(jìn)行造模，造模周期42 d。造模結(jié)束后，大鼠禁食不禁水，各組隨機(jī)抽取2 只，處死大鼠留取肝標(biāo)本，制成石蠟切片，HE 及MASSON 染色觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，并評(píng)價(jià)模型狀態(tài)。造模成功后，各組繼續(xù)皮下注射CCl4，每周2 次直至處死。每日觀察大鼠的進(jìn)食水、毛發(fā)及精神狀態(tài)等。

1.3.3 肝功能測(cè)定 留取標(biāo)本前大鼠放于代謝籠，禁食不禁水，消毒大鼠前胸部皮膚，心尖搏動(dòng)最強(qiáng)處進(jìn)針，取大鼠左心室動(dòng)脈血5ml，靜置凝固后離心取上層血清。采用美國(guó)BECKMANCOULTERCX9 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）和清蛋白（ALB）等肝功能指標(biāo)。

1.3.4 肝臟大體標(biāo)本觀察 消毒后切開腹部皮膚進(jìn)入腹腔，分離整個(gè)肝臟，予0.9%氯化鈉注射液沖洗，觀察大鼠肝臟標(biāo)本色澤、質(zhì)地、體積大小及表面是否光滑等，迅速于液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中待用。

1.3.5 病理指標(biāo)評(píng)價(jià) 分離肝臟后取實(shí)驗(yàn)大鼠同一部位肝組織，制成肝組織蠟塊，切片后予HE 染色及MASSON染色，并于光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)變化。肝臟炎癥評(píng)分和纖維化分級(jí)參照我國(guó)病毒性肝炎組織病理學(xué)分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，利用計(jì)算機(jī)圖像分析進(jìn)行膠原纖維定量分析[12]。

1.3.6 抗氧化指標(biāo)測(cè)定 取同一部位肝組織，按1∶9加入冰0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行勻漿，3 000 r/min離心10 min，留取上清液，按上海碧云天生物技術(shù)公司試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定SOD、GSH、GPx 和MDA等指標(biāo)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件分析，服從正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間比較則采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs移植改善大鼠生活狀態(tài) 正常對(duì)照組大鼠皮毛色澤光澤，進(jìn)食水正常，活動(dòng)正常。模型對(duì)照組大鼠注射CCl4后，隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠皮毛色澤逐漸晦暗，精神逐漸萎靡，進(jìn)食水及活動(dòng)量明顯減少。hUC-MSCs 移植后，隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠進(jìn)食水以及活動(dòng)量較模型對(duì)照組明顯增加，但較正常對(duì)照組大鼠明顯減少。

2.2 hUC-MSCs移植改善大鼠肝臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常對(duì)照組大鼠肝臟顏色暗紅，表面細(xì)膩光滑。模型對(duì)照組大鼠注射CCl4后，肝臟逐漸腫脹，體積開始逐漸增大，后逐漸變小，至CCl4注射第7 周，肝臟體積明顯變小，表面明顯粗糙不平，顯示肝硬化造模成功。hUCMSCs 移植后，與模型對(duì)照組大鼠相比，hUC-MSCs 移植可使大鼠肝臟表面相對(duì)光滑，色澤相對(duì)紅潤(rùn)（封三彩圖1）。

2.3 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝臟炎性浸潤(rùn)及纖維沉積 大鼠肝硬化造模結(jié)束時(shí)HE 染色顯示肝臟切片組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝板排列紊亂，肝細(xì)胞水腫、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合MASSON 染色顯示匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見大量纖維組織增生，假小葉形成，提示肝硬化模型造模成功。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組大鼠相比，肝小葉結(jié)構(gòu)更加紊亂，肝板排列更加紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯增加、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維條索明顯增多，而hUC-MSCs 移植組則顯示肝細(xì)胞壞死、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維沉積有所減少（封三彩圖1）。各組肝臟組織的炎癥評(píng)分以及纖維組織沉積定量分析也顯示了同樣的結(jié)果（圖1）。

2.4 hUC-MSCs移植改善肝硬化大鼠肝功能 與正常對(duì)照組相比，隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型對(duì)照組及hUCMSCs移植組ALT、AST、TBIL及DBIL明顯升高，ALB則與之相反。hUC-MSCs 移植組大鼠ALT、AST、TBIL及DBIL 較模型對(duì)照組明顯降低（q≥22.88，均P ＜0.05），ALB則明顯升高（q≥9.61，均P＜0.05）。見表1。

表1 hUC-MSCs 移植對(duì)肝硬化大鼠各組肝功能的影響

2.5 抗氧化指標(biāo)變化 與正常對(duì)照組大鼠相比，模型對(duì)照組及hUC-MSCs 移植組大鼠的肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH及GPx活性的表達(dá)水平顯著降低，MDA 表達(dá)水平顯著升高（q≥24.47，均P ＜0.05），而相較于模型對(duì)照組而言，hUC-MSCs移植組大鼠肝組織SOD、GSH 及GPx 表達(dá)水平顯著升高，MDA 表達(dá)水平則顯著降低（q≥37.27，均P ＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠SOD、MDA、GSH 及GPx 氧化應(yīng)激指標(biāo)變化

3 討論

本研究結(jié)果顯示，大鼠應(yīng)用CCl4橄欖油溶液皮下給藥42 d后，MASSON染色顯示匯管區(qū)及中央靜脈周圍可見大量纖維組織增生，包繞肝細(xì)胞形成假小葉，這與同類研究報(bào)道一致[13]，表明成功建立大鼠肝硬化模型。大鼠的肝臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明，hUC-MSCs 移植可明顯改善肝細(xì)胞壞死，減少肝硬化大鼠的炎癥反應(yīng)及纖維組織形成，這與骨髓源MSCs 移植治療效果相似[14]。

肝功能是衡量肝臟肝細(xì)胞損傷的重要尺度，ALT及AST水平可側(cè)面反映肝細(xì)胞損傷程度，ALB作為肝功能的靈敏指標(biāo)，可協(xié)助評(píng)估肝損傷程度。有研究顯示，將骨髓源MSCs植入CCl4誘導(dǎo)的肝硬化小鼠體內(nèi)，可使小鼠的肝功能改善，死亡率降低[14]。本研究血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，hUC-MSCs 移植可使ALT、AST、TBIL 及DBIL 明顯下降，ALB 明顯升高，與模型對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示hUC-MSCs移植對(duì)肝硬化有治療作用，與上述研究結(jié)果一致。

氧化損傷是肝損傷的重要機(jī)制，肝臟作為機(jī)體重要的代謝器官容易受到自由基攻擊。肝細(xì)胞是肝臟功能的承擔(dān)者，肝細(xì)胞內(nèi)線粒體、微粒體以及過氧化物酶體可產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而最終發(fā)生肝臟功能障礙[15]。肝臟細(xì)胞的抗氧化防御體系由相關(guān)抗氧化酶及細(xì)胞因子共同構(gòu)成，其中SOD 是抗氧化防御體系中最重要的酶[16]，是人體細(xì)胞衰老及死亡的最直觀指標(biāo)。GSH 和GPx可分解氫過氧化物，是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，MDA 是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[17]。為證明hUC-MSCs 移植對(duì)肝硬化大鼠肝臟的抗氧化作用，本研究進(jìn)一步檢測(cè)各組大鼠SOD、GSH、GPx 及MDA 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組相比，hUC-MSCs移植可顯著升高大鼠肝臟SOD、GSH 及GPx 水平，降低肝臟組織中MDA 含量（均P ＜0.05），提示hUC-MSCs 移植可緩解CCl4所致肝硬化大鼠肝組織的氧化損傷，抗氧化作用可能是其作用機(jī)制。

綜上所述，CCl4可成功誘導(dǎo)肝硬化模型，hUCMSCs 移植可能從抗氧化衰老方面改善大鼠的肝硬化程度。在致病因素持續(xù)存在的情況下，hUC-MSCs移植只能延緩肝硬化的進(jìn)程，并不能逆轉(zhuǎn)肝硬化。