熒光銅納米簇的制備及熒光分析法檢測過氧化氫
——推薦一個分析化學綜合實驗

董江雪，范亞杰，劉曉彤，李慧

河北大學化學與環境科學學院，河北 保定 071000

近年來，以新型熒光納米材料為探針的光學傳感器在對環境進行分析的過程中發揮了重要作用[1]。熒光金屬納米簇主要是由金、銀、銅等金屬的幾個到幾十個原子組成的相對穩定的聚集體，性質介于單個金屬原子和較大塊金屬之間。熒光金屬納米簇具有優異的光學特性，熒光發射可調、熒光穩定性高、量子產率較高，且易于合成和毒性小，具有良好的生物相容性，因此受到了廣泛的關注，具有十分巨大的發展潛力[2]。為了提升本科教學的前沿性和學術性，我們將科研成果中關于熒光銅納米簇的制備和H2O2的熒光分析法應用于教學，設計了該綜合性化學實驗。該實驗內容主要包括熒光銅納米簇的制備、熒光光譜表征及以熒光銅納米簇為探針的H2O2檢測實驗。首先以青霉胺為穩定劑在室溫下通過攪拌制備發射紅色熒光的銅納米簇，因制備原料簡單，只需硝酸銅和青霉胺，因此，在實驗內容中設計了優化反應物用量比的內容，使學生建立尋找最佳實驗條件的思想。同時，該實驗制備周期短，只需半個小時即可完成銅納米簇的制備，完全可以滿足教學時長的要求。此外，本科教學實驗中經典的H2O2檢測實驗是利用高錳酸鉀滴定法實現對H2O2含量進行檢測的，本實驗以學生制備的銅納米簇為探針，通過熒光分析法對水溶液中的H2O2進行檢測，在學習儀器原理操作的同時，拓寬了學生的視野，激發學生的學習熱情，對培養學生的前沿思想、創新思維及綜合實踐能力具有重要意義。

1 實驗目的

(1) 了解金屬納米簇的性質及應用領域；

(2) 掌握熒光銅納米簇的制備方法；

(3) 掌握熒光分光光度計的基本操作和原理；

(4) 掌握利用熒光分析法檢測H2O2，繪制標準曲線的方法。

2 實驗原理

金屬納米簇是一種尺寸約為2 nm，介于金屬原子和金屬納米顆粒之間的納米材料[3]，近幾十年人們對金、銀等貴金屬納米簇進行了廣泛的研究[4]，而與金、銀同一族的銅，一直到近些年才引起人們的重視。與金、銀相比，銅的相對含量豐富，價格低廉且易于獲取，銅納米簇不僅與金、銀等納米簇具有相似的光化學性質，其生物相容性更高，環境友好，具有廣泛的應用前景。

因小尺寸的金屬納米簇在溶液中易發生聚集，因此在制備金屬納米簇時通常向其中加入穩定劑，即通過模板法制備金屬納米簇，目前用于穩定金屬納米簇的模板有樹枝狀分子、DNA、蛋白質、巰基小分子等[5-8]。模板法也是目前制備銅納米簇的主要方法[9]。青霉胺是一種含有巰基的小分子，可以作為穩定劑制備熒光銅納米簇，且因青霉胺具有較強的還原性，在制備銅納米簇的過程中可同時作為還原劑將二價銅離子還原為一價和零價，或者熒光銅納米簇。根據熒光光譜的特性可知，熒光物質有最大激發光譜和發射光譜，熒光發射光譜的位置不會隨激發波長的變化而變化，因此，可以在不同激發波長下掃描熒光物質的發射光譜，確定最大發射峰的位置，再固定發射峰，反掃激發光譜，從而確定最大激發光譜的位置。

H2O2是一種常見的化學物質，在生活中具有廣泛的用途。作為一種重要的無機化工原料和精細化工產品，在紡織、造紙等化工領域也得到廣泛應用。H2O2是高效、清潔的氧化劑，被廣泛應用于印染紡織工業的漂白過程中[10]。研究顯示，H2O2進入人體后大量堆積極有可能加速人體細胞衰老和誘發心腦血管疾病等[11]，因此對H2O2的檢測具有極為重要的意義。本實驗中因H2O2具有強氧化性，當向銅納米簇溶液中加入H2O2后，銅納米簇會被氧化導致納米簇的穩定結構被破壞，從而使得銅納米簇溶液的熒光被猝滅。在一定的濃度范圍內，H2O2的量與溶液熒光的猝滅值呈線性相關，據此，可以繪制標準曲線，實現對水溶液中H2O2的檢測。

3 實驗試劑與儀器

3.1 實驗試劑

還原型D-青霉胺、三水硝酸銅、混酸溶液(0.04 mol·L-1的磷酸、硼酸和醋酸)、0.2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液、H2O2溶液，實驗試劑均為分析純，購于阿拉丁試劑(上海)有限公司(中國)，實驗用水為超純水。

3.2 實驗儀器

分析天平，85-2A型數顯磁力攪拌器(常州越新)、MX-S型漩渦混勻器(北京大龍)、ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海錦岐)、F-2700型熒光分光光度計(日本，日立)、移液器、移液管、JSM-7500型冷場掃描電子顯微鏡(日本，日本電子)、Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射電子顯微鏡(美國，FEI)。

4 實驗內容

4.1 熒光銅納米簇的制備

配制溶液：準確稱取0.1492 g D-青霉胺粉末于10.00 mL棕色容量瓶中，加超純水定容、搖勻，配制成0.1000 mol·L-1的D-青霉胺溶液；準確稱取0.2416 g三水硝酸銅固體于10.00 mL容量瓶中，加超純水定容、搖勻，配制成0.1000 mol·L-1的硝酸銅溶液。

取5個3 mL樣品瓶將其編號為1-5號，首先，向1-5號樣品瓶中分別加入超純水900、850、800、750、700 μL；隨后，向上述樣品瓶中依次加入0.1000 mol·L-1的D-青霉胺溶液50、100、150、200、250 μL，并放置在恒溫測速磁力攪拌器上，在室溫下以500 r·min-1的轉速攪拌；然后，向5個樣品瓶中加入0.1000 mol·L-1的硝酸銅溶液50 μL，繼續攪拌0.5 h；最后，將上述溶液在室溫下靜置0.5 h，獲得不同青霉胺與硝酸銅摩爾比(1 : 1，2 : 1，3 : 1，4 : 1，5 : 1)下制備的熒光銅納米簇，用于探究反應物比例對制備的納米簇的影響，優化制備銅納米簇的最佳反應物之比。

4.2 銅納米簇的熒光表征

取5支2 mL的一次性離心管，依次取上述制備的1-5號銅納米簇溶液40 μL于5支離心管中，向其中各加入960 μL的超純水得到稀釋后的銅納米簇溶液，利用移液器將稀釋后的熒光銅納米簇分別移入5支比色皿中，將比色皿置于暗箱式紫外分析儀中，在345 nm的紫外燈下觀察不同反應物比例下獲得的銅納米簇的發光情況，初步確定制備銅納米簇的最佳青霉胺與硝酸銅之比。

將上述觀察到的熒光最強的比色皿中的銅納米簇置于熒光分光光度計上，掃描其激發和發射光譜，確認最大激發和發射波長，設置熒光分光光度計的激發和發射狹縫均為10 nm，光電倍增管電壓為400 eV。首先，將熒光光度計的最大激發波長設置為345 nm，在370-650 nm范圍內掃描其發射光譜，得到其最大發射波長為λem；然后，固定發射波長為λem，在330-600 nm范圍內掃描銅納米簇溶液的激發光譜，得到最大激發波長λex。最后，在330-370 nm的激發波長范圍內，改變激發波長，在480-650 nm范圍內掃描不同激發波長下的銅納米簇溶液的發射光譜，觀察制備的銅納米簇是否具有激發依賴性質[12]。進一步在最大激發波長下，在480-650 nm范圍內掃描5支比色皿中稀釋的1-5號銅納米簇溶液的發射光譜，確定制備銅納米簇的最佳青霉胺和硝酸銅比例。

4.3 熒光分析法檢測H2O2

配制溶液：取6個20 mL的樣品瓶，用移液管首先向其中依次加入10.00 mL混酸溶液(0.04 mol·L-1的磷酸、硼酸和醋酸)，隨后向上述樣品瓶中分別加入1.25、1.75、2.00、2.25、2.75和3.75 mL 0.2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，上述溶液混合均勻后依次得到pH為2.4、2.9、3.3、3.8、4.4和5.3的BR緩沖溶液(伯瑞坦-羅比森緩沖溶液)；用移液器移取103 μL 30% H2O2溶液(9.7 mol·L-1)于10.00 mL的棕色容量瓶中，加超純水定容至刻度，獲得100 mmol·L-1的H2O2溶液，并逐級稀釋到1.00 mmol·L-1作為工作溶液。

檢測H2O2：取7支2 mL的一次性離心管，依次向其中加入一定量的超純水，150 μL pH 3.8的緩沖溶液，40 μL銅納米簇工作溶液和1 mmol·L-1的H2O2標準溶液(0、10、50、100、200、300、400 μL)，使溶液的最終體積均為1.00 mL，于漩渦混勻器上混勻。同時，另取一支2 mL的一次性離心管，依次向其中加入610 μL超純水，150 μL pH 3.8的緩沖溶液，40 μL銅納米簇工作溶液和200 μL的H2O2未知溶液，于漩渦混勻器上充分混勻。上述8支溶液在室溫下靜置反應40 min后，于熒光分光光度計上在最大激發波長下，掃描熒光發射光譜，記錄各溶液的熒光強度(F)。以加入H2O2后熒光強度的猝滅值(ΔF)對H2O2的濃度作圖，繪制ΔF-C(H2O2)的標準曲線，同時記錄未知溶液的熒光強度(F未知)，將ΔF未知代入標準曲線方程，計算未知溶液中H2O2的含量。

5 結果與討論

5.1 銅納米簇的制備及熒光性質

如圖1a所示，制備的銅納米簇原液在可見光下為淡黃色懸濁液，在紫外燈下發射強烈的紅色熒光，銅納米簇稀釋后的溶液在可見光下為白色懸濁液，在紫外燈下發射紅色熒光。制備好的銅納米簇溶液在室溫下放置，可在10天內保持光學性質穩定。圖1b表明銅納米簇具有鏡像對稱的激發和發射光譜，最大激發波長為λex= 340 nm，最大發射波長為λem= 620 nm，圖1c表明制備的熒光銅納米簇不具備激發依賴性[12]，在不同的激發波長下，發射峰的位置沒有發生明顯移動。按照4.1節的方法，在不同的D-青霉胺和硝酸銅比例下制備了銅納米簇，通過熒光光譜測量，比較熒光強度，結果表明當D-青霉胺和硝酸銅的比例為4 : 1時所制備的銅納米簇具有較好的熒光性能，如圖1d所示。此外，我們利用冷場電子掃描電鏡(SEM)和高分辨透射電子顯微鏡(TEM)技術探究了所制備的銅納米簇的微觀形貌及顆粒尺寸大小，SEM表征結果(圖1e)表明銅納米簇在溶液中成片狀堆積狀態，TEM圖(圖1f)中可看到這些片狀結構是由多個尺寸約為2 nm的納米顆粒聚集而成。此外，這些聚集的納米顆粒可以均勻地懸濁在溶液中保持至少2 h，但若靜置時間太長會出現一定的沉降現象，因此，制備好的納米簇儲備液在實驗前應首先進行漩渦混勻。

圖1 (a) 銅納米簇原液(1和2)和稀釋后的溶液(3和4)在可見光(1和3)及紫外燈(2和4)下的照片；(b) 銅納米簇的 激發和發射光譜圖；(c) 不同激發波長下銅納米簇的發射光譜；(d) 不同D-青霉胺和硝酸銅比例制備的 熒光銅納米簇的發射光譜圖；(e) 銅納米簇的SEM圖；(f) 銅納米簇的TEM圖，插圖為放大的TEM圖

5.2 檢測H2O2

實驗首先對溶液的最佳pH條件進行了優化，測定了在不同pH條件下空白溶液(不加H2O2)和加入H2O2后溶液的熒光強度，結果如圖2所示，無論是空白溶液還是加入H2O2后溶液的熒光強度均存在隨pH先升高后降低的現象，且ΔF在pH為3.8時具有最大值，因此，實驗選取pH 3.8作為檢測H2O2的最佳條件。

圖2 (a) 不同pH條件下空白溶液加入H2O2后反應溶液的熒光強度； (b) 不同pH條件下加入H2O2后溶液熒光強度的猝滅值

以銅納米簇為探針檢測溶液中的H2O2，按照4.3節的方法，掃描含不同濃度H2O2的銅納米簇溶液的熒光發射光譜，如圖3a所示，當溶液中不含有H2O2時，溶液具有較強的熒光強度，當加入的H2O2的量逐漸增加后，溶液的熒光強度隨之降低，記錄不同H2O2濃度的溶液的熒光強度(F)，以加入H2O2后熒光強度的猝滅值(ΔF)為縱坐標，以H2O2的濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖3b所示，標準曲線方程為ΔF= 1.74 + 4.72，相關系數R= 0.9972，表明在該范圍內熒光強度的猝滅值與溶液中H2O2的濃度間具有較好的線性關系，據此可建立檢測溶液中H2O2含量的熒光分析法。經計算，該方法檢測H2O2的最低檢出限(LOD)為1.71 μmol·L-1，LOD = 3σ/k。

圖3 (a) 含不同濃度H2O2的銅納米簇溶液的熒光光譜圖；(b) 以銅納米簇為探針檢測H2O2的標準曲線

6 注意事項

(1) 配制好的溶液一定要充分混勻，以確保溶液反應均勻。

(2) 在紫外燈下觀察銅納米簇的熒光強度時須將溶液置于四面透光的石英比色皿中進行觀察，排除其他容器自身雜質熒光的干擾。

(3) 配制檢測H2O2的反應溶液時，反應物的添加順序不可更改。

(4) 在進行熒光測定時，系列樣品按照由低向高濃度測定時可以不洗比色皿，當更換溶液時，一定要用超純水清洗比色皿，最后將比色皿中的超純水盡量移除完畢，再將待測樣用移液器移入比色皿。

(5) 比色皿在放入儀器前用吸水紙將表面溶液吸干。

(6) 移取H2O2溶液時，一定要操作規范，以免將溶液灑到身上或衣服上。

7 實驗組織運行方式

本實驗適用于已學習了部分光譜分析理論知識的學生，實驗采用小班教學，每次面向10-12名同學進行授課，將學生分為三組，每組3-4人。實驗學時為9學時，分為兩個階段進行。第一階段為5學時(上午進行)，內容包括：教師引導學生進行文獻調研，了解銅納米簇和H2O2檢測的相關知識；教師進一步講解實驗原理并演示移液器、漩渦混勻器、磁力攪拌、暗箱式紫外分析儀和熒光分光光度計的使用方法及銅納米簇的制備方法，學生開展實驗，配制溶液，制備熒光銅納米簇，將制備好的銅納米簇溶液在室溫下靜置，待后續實驗使用。第二階段為4學時(下午進行)，內容包括：學生開展實驗，確定銅納米簇的最大激發和發射波長，確定制備熒光銅納米簇的最佳反應物之比，配制溶液，繪制檢測H2O2的標準曲線。實驗教學中，結合學生已有的理論知識，啟發式引導學生回顧相關理論知識，理解分析化學中探針的含義和利用熒光強度猝滅值為縱坐標繪制標準曲線的方法。

該實驗在教學中用于綜合化學實驗課程，該課程目標如下：(1) 加深對化學基礎理論知識的理解，學習實驗數據的處理方法，進一步掌握各種儀器的基本工作原理、特點和應用；(2) 綜合運用多種實驗操作技術，提高觀察、分析和解決問題的能力；(3) 了解科技前沿知識，開拓視野、發散思維，培養創新意識；(4) 培養學生實事求是的科學態度和認真細致的工作作風。實驗中的基本熒光光譜理論知識、合成探針、熒光分光光度計的使用和利用熒光猝滅法繪制標準曲線，與課程目標1對應；實驗涉及的探針合成實驗及發光性質觀察等內容，與課程目標2對應；實驗在教學中引入新興的探針材料納米簇，并通過啟發學生查閱文獻資料及講解等方式學習納米簇的相關知識，與課程目標3對應；在實驗過程中，不規范的操作可能導致納米簇的合成失敗或H2O2的檢測結果不準確，啟發學生尊重實驗事實并正確對待實驗結果，同時操作中嚴格按照規定進行，與課程目標4對應。

此外，該實驗的考核內容由預習報告、課堂表現、實驗操作和實驗報告組成，各部分占比分別為10%、20%、40%和30%。綜合化學實驗課程共由15次實驗課組成，該實驗占用2次實驗課時，因此在課程成績中占比2/15。由于該實驗是綜合化學實驗課程中唯一涉及熒光探針和熒光分析法的實驗，同時實驗中設計了通過紫外燈觀察探針發光情況、讓學生用自己合成的探針進行分析檢測實驗等環節，激發了學生的好奇心理，充分調動了學生的學習積極性。因此，學生對此實驗反饋較好，教學評價結果優秀。但該實驗仍存在一定的不足，未來改進方向有：(1) 實驗中每個同學制備1000 μL的銅納米簇溶液，但整個實驗中只需要不到500 μL納米簇溶液即可，存在浪費的問題，而青霉胺試劑較為昂貴，因此導致實驗成本較高，今后應努力對教學中熒光探針的制備方法進行改進，尋找更加簡單、合成量可更少的制備方法；(2) 該實驗以具有強氧化性的H2O2為檢測對象，在實驗過程，學生在移取30% H2O2溶液時，稍有不慎即會沾染到身體或衣服上，存在一定隱患，今后應改進H2O2稀溶液的配制方法，或在不影響教學效果的基礎上尋找更為安全的檢測對象替代H2O2。

8 結語

本實驗將科學研究中常用的一種新型熒光納米材料——銅納米簇引入化學實驗教學中，開拓學生視野，使其明白發射熒光的物質不僅限于化學分子。此外，銅納米簇的制備方法簡單，反應快速，所需實驗試劑無毒，綠色環保，可滿足本科教學的時長及安全性要求，且在不同反應物比的條件下制備銅納米簇，并將其熒光發射情況進行比較，使學生理解“優化實驗條件”的基本思路和方法。同時，在實驗條件下，H2O2可以猝滅銅納米簇的熒光，熒光強度的猝滅值在一定范圍內與H2O2的濃度成正比，因此在教學中建立熒光猝滅法檢測H2O2的分析方法，使學生構建了“利用待測物對熒光探針的猝滅效應檢測其含量”的科學思想。將本實驗引入教學，提升了教學的學術深度，激發了學生的學習熱情，啟發學生思考，有助于培養學生的創新意識和綜合實踐能力。