不同基原枳實藥材的質量差異評價研究

陸超穎，王佳麗，王洪蘭，池玉梅，張 雯，趙曉莉*，狄留慶*

不同基原枳實藥材的質量差異評價研究

陸超穎1, 2，王佳麗1, 2，王洪蘭1，池玉梅1，張 雯1, 2，趙曉莉1, 2*，狄留慶1, 2*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥高效給藥系統工程技術研究中心，江蘇 南京 210023

通過比較性狀、浸出物、生物堿和黃酮成分的含量、指紋圖譜等內容來系統研究基原為酸橙和甜橙的枳實藥材質量差異，以期建立一個多元的枳實藥材質量控制體系。按照《中國藥典》2020年版枳實項下對酸橙和甜橙枳實藥材進行質量評價和比較，通過HPLC法對枳實進行定性及定量分析，分別建立不同基原枳實藥材的指紋圖譜并對其9個主要的黃酮成分進行含量測定。不同基原的枳實藥材浸出物含量差異明顯，而辛弗林含量沒有顯著性差異；甜橙枳實中不含新橙皮苷，而酸橙枳實中該成分含量最高；除桔皮素外，2個基原枳實的其他黃酮成分含量均存在顯著性差異（＜0.05）；通過指紋圖譜的模式識別，2種枳實分類情況與其產地分布較為吻合；通過正交偏最小二乘判別分析篩選出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷這3個差異性成分。不同基原枳實藥材在浸出物含量、主要黃酮類成分的種類及含量等方面均存在一定的差異性，對其進行的質量差異研究及指紋圖譜的比較，可以為枳實臨床用藥選擇、新藥開發、藥材質量控制等方面提供依據。

枳實；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘判別分析；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

枳實為臨床常用中藥，具有破氣消積、化痰散痞的功效。根據《中國藥典》2020年版記載，枳實為蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種或甜橙Osbeck的干燥幼果[1]。不同基原的枳實藥材所含活性成分的類別、含量等方面均存在差異性，而這些差異可導致其藥理作用和活性上的不同。目前，《中國藥典》規定浸出物與辛弗林含量是控制枳實藥材質量的2個主要指標，而研究表明，黃酮類成分在枳實中的含量較高，是其主要功效成分。因此，本研究通過對不同基原枳實藥材多方面的綜合考察，建立起一個多元的質量控制體系，可以更好地為臨床用藥的有效性和新藥研發藥材的選擇提供保障和依據。

1 儀器與材料

sartorius CPA225D型電子天平；HH-S8型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Milli-Q Synthesis 108超純水儀；Waters e2695型高效液相色譜儀；KH-500DE型超聲波清洗器。無水甲醇、無水乙醇、甲酸、磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉、冰醋酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；對照品辛弗林（批號110727-201608，質量分數99.9%）、橙皮苷（批號110721-201617，質量分數96.1%）、柚皮苷（批號110722-201714，質量分數93.4%）、新橙皮苷（批號111857-201703，質量分數99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號P11N8L48150）、橙皮素（批號C03F6Y1）、柚皮素（批號YJ0603HA13）、甜橙黃酮（批號P14M6R1）、桔皮素（批號H09M7K14409）、川陳皮素（批號H22M8K32109）購于上海源葉生物有限公司，質量分數均大于98%。

枳實藥材采集自重慶江津、江西樟樹、江西吉安、四川眉山的4個不同地區，經南京中醫藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種或甜橙Osbeck 的干燥幼果。詳細信息見表1。

表1 樣品信息

Table 1 Information of samples

序號樣品編號基原產地采收時間序號樣品編號基原產地采收時間 1S1酸橙重慶江津白沙鎮2018-0617T2甜橙重慶江津白沙鎮2018-07 2S2酸橙重慶江津白沙鎮2018-0618T3甜橙重慶江津白沙鎮2018-07 3S3酸橙重慶江津白沙鎮2018-0619T4甜橙重慶江津白沙鎮2018-07 4S4酸橙重慶江津白沙鎮2018-0620T5甜橙重慶江津白沙鎮2018-07 5S5酸橙重慶江津白沙鎮2018-0621T6甜橙江西樟樹黃土崗2018-05 6S6酸橙江西樟樹黃土崗2018-0722T7甜橙江西樟樹黃土崗2018-05 7S7酸橙江西樟樹黃土崗2018-0723T8甜橙江西樟樹黃土崗2018-06 8S8酸橙江西樟樹黃土崗2018-0724T9甜橙江西樟樹黃土崗2018-06 9S9酸橙江西樟樹黃土崗2018-0625T10甜橙江西樟樹黃土崗2018-06 10 S10酸橙江西樟樹黃土崗2018-0626T11甜橙江西吉安新干縣2017-05 11 S11酸橙江西吉安新干縣2018-0627T12甜橙江西吉安新干縣2017-05 12 S12酸橙江西吉安新干縣2018-0628T13甜橙江西吉安新干縣2017-05 13 S13酸橙江西吉安新干縣2018-0629T14甜橙江西吉安新干縣2017-06 14 S14酸橙江西吉安新干縣2018-0630T15甜橙江西吉安新干縣2017-06 15 S15酸橙江西吉安新干縣2018-0631T16甜橙四川眉山丹棱縣2018-07 16T1甜橙重慶江津白沙鎮2018-0732T17甜橙四川眉山丹棱縣2018-07

2 方法與結果

2.1 不同基原枳實藥材性狀比較

隨機選取酸橙與甜橙枳實不同產地的某一編號樣品，對其進行性狀分析，結果見圖1，并從以上編號中每批隨機選取6枚枳實，用游標卡尺（精度為0.02 mm）測量其瓤囊及橫切面直徑，計算瓤囊占橫切面積的百分比，結果見表2。酸橙、甜橙瓤囊占比差異性分析見圖2。可以看出，2種基原的枳實藥材多呈半球形，少數為球形。質地堅硬，氣清香。藥材外果皮顏色為棕褐色或灰綠色，外表有皺紋，有些具有殘留的果梗，中果皮稍隆起且呈黃白（褐）色，瓤囊棕色。2種枳實藥材所表現出的性狀與《中國藥典》2020年版中對枳實的描述基本一致。不同產地的酸橙樣品與甜橙樣品相比較，酸橙枳實樣品的瓤囊占比較小，即中果皮相對較厚。這一結論與文獻報道[2]中的一致。另外，不同產地的甜橙枳實在性狀上比較接近，而酸橙枳實由于產地的不同表現出外觀的大小不一。

A～C-酸橙枳實（分別產自重慶江津白沙鎮、江西樟樹黃土崗、江西吉安新干縣，瓤囊占比較小） D～F-甜橙枳實（分別產自重慶江津白沙鎮、江西樟樹黃土崗、江西吉安新干縣，瓤囊占比較大）

表2 不同基原代表性枳實藥材瓤囊面積占橫切面面積百分比

Table 2 Percentage of pulp capsule area in cross section area of different varieties of Aurantii Fructus Immaturus

編號瓤囊直徑/mm橫切面直徑/mm瓤囊面積/mm2橫切面面積/mm2占比/%平均值/% S4 7.1021.52 39.57363.5410.8915.16 7.3222.44 42.06395.2910.64 9.1225.14 65.29496.1413.16 9.9822.54 78.19398.8219.60 10.5224.48 86.88470.4318.47 11.3426.56100.95553.7718.23 S6 4.5013.18 15.90136.3611.6613.83 5.3815.78 22.72195.4711.62 3.9810.26 12.43 82.6415.05 5.1616.22 20.90206.5210.12 5.5414.62 24.09167.7914.36 6.1613.72 29.79147.7720.16 S11 4.2213.38 13.98140.53 9.9510.65 3.9812.12 12.43115.3110.78 5.0612.58 20.10124.2316.18 3.5610.68 9.95 89.5411.11 2.4410.24 4.67 82.31 5.68 3.14 9.82 7.74 75.7010.22 T114.3625.06161.87492.9832.8445.63 15.4422.64187.14402.3746.51 14.9021.36174.28358.1648.66 18.9824.64282.79476.6059.34 17.7623.02247.60415.9959.52 12.0223.18113.42421.7926.89 T814.2624.14159.63457.4534.9031.17 15.2225.98181.84529.8434.32 11.9624.06112.29454.4224.71 11.8821.10110.79349.4931.70 11.2222.50 98.82397.4124.87 14.2423.56159.18435.7336.53 T14 8.6216.22 58.33206.5228.2430.13 9.4215.72 69.66193.9935.91 9.2418.56 67.02270.4124.78 7.6616.12 46.06203.9922.58 10.8616.64 92.58217.3642.59 9.2017.82 66.44249.2826.65

**P＜0.01

2.2 浸出物含量測定

浸出物含量照《中國藥典》2020年版醇溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法測定，用70%乙醇作溶劑。除去經甲苯法（通則0832第四法）所測得的水分，按干燥品計算浸出物的含量。測定結果見表3，浸出物含量差異性分析見圖3。15批酸橙枳實的浸出物平均含量為58.19%；17批甜橙枳實的浸出物平均含量為25.12%，雖均符合藥典枳實浸出物項下規定（不少于12.0%），但不同基原枳實浸出物含量差異明顯（＜0.01）。

2.3 辛弗林含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Brige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（即磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉l.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL）；檢測波長為275 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL，理論塔板數（按辛弗林峰計算）應不低于2000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取辛弗林對照品適量，精密稱定。加水制成含30.8 μg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取枳實中粉約l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，通過聚酰胺柱（60～90目，2.5 g，內徑為1.5 cm，干法裝柱），用水25 mL洗脫，收集洗脫液，轉移至25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

表3 不同基原枳實藥材的浸出物含量測定

Table 3 Determination of extract content of different kinds of Aurantii Fructus Immaturus

樣品編號浸出物/%樣品編號浸出物/% S156.07T225.38 S257.81T324.81 S359.22T426.70 S464.36T525.12 S559.57T626.48 S665.26T729.81 S765.08T832.23 S866.71T925.68 S953.08 T1027.31 S1054.13 T1122.09 S1157.89 T1222.00 S1253.42 T1322.83 S1353.84 T1422.54 S1454.66 T1522.38 S1551.81 T1621.41 T127.46 T1722.79

**P＜0.01

2.3.4 方法學考察 精密吸取“2.3.3”項下供試品溶液10 μL，連續進樣6次，再取同一供試品溶液，在制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣，結果辛弗林峰面積的RSD值均小于2.1%，說明儀器精密度、供試品溶液穩定性良好；精密稱取同一樣品粗粉6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液并測定，結果辛弗林含量的RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好；精密稱取已知辛弗林含量的同批枳實粉末6份，每份0.5 g，精密加入辛弗林對照品溶液，按“2.3.3”項供試品溶液制備方法處理后進樣檢測，結果辛弗林平均加樣回收率為98.3%，RSD值均小于2.2%，表明該方法準確度符合要求。

2.3.5 樣品測定結果 取各批枳實樣品，按“2.3.3”項配制供試品溶液；照“2.3.1”項色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄辛弗林峰面積，以外標法計算辛弗林的濃度。供試品平行3份，除去經甲苯法（通則0832第四法）所測得的水分，按干燥品計算樣品中辛弗林的含量，結果見表4，辛弗林含量差異性分析見圖4。根據統計數據，15批酸橙枳實的辛弗林平均含量為0.490%；17批甜橙枳實的辛弗林平均含量為0.647%，均符合藥典枳實含量測定項下規定（不少于0.30%）。2種基原枳實中辛弗林的含量沒有顯著性差異（＞0.05），其中江西樟樹黃土崗的甜橙枳實辛弗林含量較其他產地高。

2.4 黃酮類成分含量分析與指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Brige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min，10%～19%A；10～25 min，19%A；25～27 min，19%～30%A；27～50 min，30%～53%A；50～51 min，53%～75%A；51～56 min，75%A；56～57 min，75%～10%A；57～62 min，10%A。檢測波長為330 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL。

表4 不同基原枳實藥材中辛弗林的含量測定

Table 4 Determination of synephrine in different varieties of Aurantii Fructus Immaturus

序號樣品編號辛弗林/%序號樣品編號辛弗林/% 1S10.42917T20.463 2S20.43418T30.893 3S30.41019T40.442 4S40.42920T50.445 5S50.50121T60.863 6S60.57722T71.132 7S70.57923T81.139 8S80.51424T91.176 9S90.36325 T100.600 10 S100.55526 T110.448 11 S110.52027 T120.407 12 S120.41628 T130.519 13 S130.75029 T140.533 14 S140.37430 T150.524 15 S150.49631 T160.456 16T10.45332 T170.508

**P＜0.01

2.4.2 對照品溶液的制備 取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素9種對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質量濃度分別為103.57、596.00、335.47、968.53、22.55、22.97、6.67、33.07、23.34 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取枳實粗粉0.1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入3/4體積甲醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，取出放冷，甲醇定容，搖勻濾過，取續濾液過0.45 μm濾膜，即得。

2.4.4 線性關系考察 取“2.4.2”項下混合對照品溶液，作為標準曲線最高質量濃度，精密移取混合對照品溶液1 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，混勻。依照倍比稀釋法，依次制備得到不同質量濃度的混合對照品溶液，按“2.4.1”項色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標（），對照品質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線及回歸方程，結果見表5。

2.4.5 方法學考察 精密吸取“2.4.3”項下供試品溶液10 μL，連續進樣6次，再取同一供試品溶液，在制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣，結果9種成分峰面積的RSD值均小于2.8%，表明儀器精密度、供試品溶液穩定性良好；精密稱取同一樣品粗粉6份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算得9種成分含量的RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好；精密稱取已測定的枳實粉末6份，每份0.05 g，分別精密加入與樣品中含量相當的9種對照品溶液，按“2.4.3”項下方法制備供試品，進樣測定，計算各成分的平均加樣回收率及RSD，結果表明9個成分平均加樣回收率在103.5%～94.7%，RSD值均小于2.6%，表明該方法準確度較好。

表5 9種成分的線性關系考察

Table 5 Results of linear regression of nine components

成分r回歸方程線性范圍/(μg·mL?1) 蕓香柚皮苷0.999 5Y＝2 999.1 X－1 460.31.62～103.57 柚皮苷0.999 9Y＝3 760.9 X＋10 2629.31～596.00 橙皮苷0.999 9Y＝3 458.1 X＋3 604.45.24～335.47 新橙皮苷0.999 9Y＝4 111.6 X＋19 47315.13～968.53 柚皮素0.999 9Y＝10 943 X＋500.670.35～22.55 橙皮素0.999 9Y＝11 487 X＋865.80.36～22.97 甜橙黃酮0.999 8Y＝25 816 X－445.270.10～6.67 川陳皮素1.000 0Y＝12 673 X＋1 354.40.52～33.07 桔皮素1.000 0Y＝25 796 X＋1 779.80.36～23.34

2.4.6 樣品中黃酮類成分含量測定結果 將各供試品溶液按“2.4.1”項下的色譜條件進樣檢測，記錄各黃酮成分峰面積，根據標準曲線計算黃酮類成分的濃度。供試品平行3份，除去經甲苯法（通則0832第四法）所測得的水分，按干燥品計算樣品中黃酮類成分的含量，結果見表6，黃酮類成分的含量差異性分析見圖5。數據顯示，酸橙枳實中包含了9種黃酮類成分；而甜橙枳實中，除產自四川眉山丹棱縣的2個樣品外，其余產地的甜橙枳實中包含了除新橙皮苷的8種黃酮類成分。且酸橙枳實以新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷為主導；甜橙枳實以橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素、柚皮苷含量占主導地位。2種基原枳實除桔皮素外，其余黃酮類成分含量均存在顯著性差異（＜0.05），總黃酮含量亦具有顯著性差異（＜0.05）。

表6 不同基原枳實藥材中的黃酮類成分種類及含量測定

Table 6 Types and contents of flavonoids in different varieties of samples

樣品編號蕓香柚皮苷/%柚皮苷/%橙皮苷/%新橙皮苷/%柚皮素/%橙皮素/%甜橙黃酮/%川陳皮素/%桔皮素/%總和/% S10.356 9.166 1.15214.9800.0180.0160.0070.0760.01825.788 S20.276 8.416 0.48214.4950.0260.022—0.0680.01823.804 S30.314 9.187 0.73315.6850.0190.0160.0040.0820.02126.059 S40.319 9.501 0.49014.0150.0160.008—0.0730.02124.443 S50.306 8.003 1.08220.1230.037 0.0360.0060.0930.02329.709 S60.999 9.895 1.71513.8290.1590.1020.0160.2850.14927.150 S71.09910.260 1.35013.8540.1570.0870.0160.3230.17627.321 S81.056 9.942 0.99013.7940.1460.1030.0190.3820.20226.635 S90.486 7.212 0.51913.3130.0470.0250.0140.2080.08421.908 S100.476 7.110 0.51412.7040.0360.0170.0140.2130.08921.175 S110.729 4.204 2.85716.7070.0450.0730.0230.1300.07324.842 S121.082 3.841 3.87417.2150.0440.0560.0230.1260.07326.333 S131.138 4.418 3.08316.4180.0590.0960.0260.1600.08525.483 S140.626 3.911 2.32416.9560.0440.0610.0260.1460.08024.174 S151.073 4.152 4.53316.2180.0540.1990.0300.1360.07726.472 T12.376 0.13018.176———0.0940.2320.02921.036 T22.188 0.26619.436—0.0170.0260.0510.3610.15422.498 T32.185 0.12318.924——0.0190.0810.1980.02621.557 T42.138 0.09418.607—0.0080.0120.0760.1810.02421.139 T52.364 0.12719.824——0.0150.0870.2120.02822.657 T61.676 0.42424.400—0.0210.0430.0220.4710.25727.313 T72.167 0.37421.298—0.0130.0450.0260.4770.25024.651 T82.460 0.43318.267—0.0090.0240.0260.5270.26022.007 T91.744 0.42623.949—0.0100.0540.0210.4860.26526.957 T101.947 0.40523.303—0.0100.0450.0250.4840.26326.482 T111.755 0.08818.283—0.0110.0380.0600.1410.02020.396 T122.096 0.11221.322—0.0130.0410.0650.1520.02323.822 T132.565 0.17926.061—0.0140.0730.0850.1940.02629.198 T141.907 0.07418.689—0.0110.0180.0610.1430.02120.924 T152.002 0.09220.580—0.0120.0410.0660.1520.02222.968 T162.006 0.31814.0690.1540.0170.0160.0830.2010.02816.892 T171.978 0.31013.7100.1400.0170.0160.0820.1970.02716.478

*P＜0.05 **P＜0.01

2.4.7 指紋圖譜方法學考察 精密吸取“2.4.3”項下供試品溶液10 μL連續進樣6次，再取同一供試品溶液，分別在溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，再精密稱取同一樣品粗粉0.1 g，按“2.4.3”項下方法同時制備6份供試品溶液后進樣測定，以橙皮苷為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果顯示，蕓香柚皮苷等9種已知成分與橙皮苷之間的相對保留時間、各共有峰相對峰面積的RSD值均小于3%。

2.4.8 樣品HPLC指紋圖譜的建立 將15批酸橙枳實的供試品溶液按“2.4.1”項下的色譜條件進樣檢測，所得的樣品色譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件。以S1指紋圖譜作為參照譜，生成共有模式，標定出21個共有峰。精密吸取混合對照品溶液10 μL按“2.4.1”項下的色譜條件進樣檢測。通過與對照品保留時間及光譜圖比對，指認出9個共有峰，見圖6。

同法17批甜橙枳實樣品共標定出了14個共有峰，并指認出其中8個共有峰，見圖7。酸橙枳實指認出了9個黃酮類成分，甜橙枳實指認出了8個黃酮類成分，甜橙枳實缺少的為新橙皮苷。

8-蕓香柚皮苷 10-柚皮苷 11-橙皮苷 12-新橙皮苷 15-柚皮素 16-橙皮素 18-甜橙黃酮 19-川陳皮素 21-桔皮素

對2種基原枳實樣品分別進行指紋圖譜測定，樣品疊加圖見圖8、9。以共有模式作為對照指紋圖譜，進行指紋圖譜相似度的評價。15批酸橙枳實樣品和對照圖譜之間的相似度分別為0.992、0.993、0.993、0.985、0.995、0.983、0.980、0.980、0.996、0.995、0.982、0.975、0.984、0.980、0.975，均大于0.960，表明15批酸橙枳實藥材相似度良好。17批甜橙枳實樣品與對照圖譜之間的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.995、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999，也均大于0.960，表明17批甜橙枳實藥材相似度良好。

5-蕓香柚皮苷 6-柚皮苷 7-橙皮苷 9-柚皮素 10-橙皮素 11-甜橙黃酮 12-川陳皮素 14-桔皮素

圖8 15批酸橙枳實藥材HPLC疊加圖

圖9 17批甜橙枳實藥材HPLC疊加圖

2.4.9 指紋圖譜的模式識別研究 以2種枳實標定的共有峰峰面積為變量，導入SPSS 22.0軟件。對原始數據標準化后，用歐氏距離進行聚類分析，結果見圖10。根據聚類結果可以把枳實藥材分為7類，第I類包括T16、T17，產自四川眉山丹棱縣；第II類包括T11、T12、T14、T15，均產自江西吉安新干縣；第III類包括T1、T3、T4、T5、T13，其中除T13外，其余樣品均產自重慶江津白沙鎮；第IV類包括T2、T6、T7、T8、T9、T10，其中除T2外，其余樣品均產自江西樟樹黃土崗；第V類包括S6、S7、S8，均產自江西樟樹黃土崗；第VI類包括S1、S2、S3、S4、S5，均產自重慶江津白沙鎮；第VII類包括S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，其中除S9、S10外，其余均產自江西吉安新干縣。酸橙枳實根據產地不同聚為3類，甜橙枳實根據產地聚為4類，分類情況與枳實產地分布較為吻合，其中部分幾個樣品未歸在相應產地一類，表明其與相同產地的其余批次樣品間差異較大。

將各樣品28個共有峰的峰面積導入到SIMCA 14.1軟件，數據經標準化后，進行主成分分析，結果見圖11。根據主成分結果可以把枳實藥材分為6類：S1、S2、S3、S4、S5歸為I類；S6、S7、S8歸為II類；S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15歸為III類；T1、T3、T4、T5、T11、T12、T13、T14、T15、T16、T17歸為IV類；T6、T7、T8、T9、T10歸為V類，T2單獨歸為VI類。I類為重慶江津白沙鎮的酸橙枳實，II類為產自江西樟樹黃土崗的酸橙枳實，III類酸橙枳實中，除S9、S10外，其余均產自江西吉安新干縣，IV類為重慶江津白沙鎮、江西吉安新干縣、四川眉山丹棱縣3個產地的甜橙枳實，第V類是江西樟樹黃土崗的甜橙枳實，VI類只有產自重慶江津白沙鎮的T2甜橙枳實樣品。

圖10 聚類分析樹狀圖

圖11 主成分分析圖

將各樣品28個共有峰的峰面積導入SIMCA 14.1軟件，進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），篩選出差異性化合物。對酸橙組與甜橙組建模，模型參數2＝0.832，2＝0.986，2＝0.985。結果見圖12。從OPLS-DA得分圖（圖12-A）可見得分值集中分布于95%置信區間，模型擬合效果好。S-plot（圖12-B）中12、13、14號峰（A12、A13、A14）位于S-plot兩端，對應成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，可篩選其作為差異性標記物。構建OPLS-DA的模型驗證試驗，假設檢驗次數設為100，置換檢驗圖（圖12-C）中顯示，獲得隨機模型的2值均小于原模型的2值，表明模型具有良好的穩定性，擬合良好。根據變量權重重要性（Variable importance in the projection，VIP）排序預測值分布圖（圖12-D），提取VIP＞1的變量，分別為12、13、14號峰，其在S-plot中距離原點均有較大的距離，表明它們對分類的貢獻較大，提示其可能為2種不同基原枳實的差異性成分。其中，14號峰新橙皮苷的VIP值最大，是基原鑒別最重要的標識物。將32批樣品28個共有峰的峰面積導入OmicShare網站，所有數據歸一化后進行聚類熱圖分析，結果見圖13。從聚類熱圖中可以看出，15個酸橙枳實樣本聚為一類，17個甜橙枳實樣本聚為一類，這與枳實基原的分類相符。色譜峰聚類表明：2～3、7～15、17、19、22～24、26號峰在不同基原枳實中差異較大，是區別2種枳實的強特征峰。

A-OPLS-DA得分圖 B-S-plot圖 C-100次置換檢驗圖 D-VIP值圖 A1～A28-峰1～28

圖13 聚類熱圖

3 討論

同一藥材可能存在多基原現象，而基原的不同會導致所含活性成分的差異，進而會引起藥物療效的差別。枳實中醇浸出物含量會影響枳實藥材的貯存及質量，故控制醇浸出物的含量對評價枳實質量有重要的意義[3]，但目前浸出物含量是否與枳實基原有關則很少見文獻報道。生物堿類成分辛弗林是枳實中的有效成分之一，具有強心、升血壓與抗組胺[4]的藥理作用。枳實中生物堿成分的含量多少受藥材采收時間、存放時間等因素影響[5]，采收的適宜期應為5月下旬，藥材存放時間越長，生物堿含量則會降低。

對于枳實藥材的質量控制，《中國藥典》2020年版目前規定只對辛弗林進行含量測定，但枳實中的其他成分如黃酮類[6]也具有顯著的藥理活性，因此，只對單一的成分進行質量控制不能全面體現藥材的質量。中藥指紋圖譜因信息量大、整體性好、特征性強[7]，可以很好地反映出中藥多種成分、整體作用的特點。黃酮類成分在枳實中的含量較高，是其主要功效成分，主要為橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮蕓香苷等[8]。現代研究發現，枳實的黃酮類成分具有抑制胃腸道平滑肌痙攣性收縮、抗炎、抗氧化[9]等作用，這與枳實臨床用于破氣消積，治療胃脹痛、胃潰瘍等胃腸道疾病的功效相一致。有文獻[10]報道稱，不同基原枳實的黃酮類成分存在種類與含量差異，而這些差異可能進一步導致該藥材藥理作用及活性上的差異。本實驗中黃酮類含量測定方法[11]參考了本課題組前期的研究。結果表明，甜橙枳實中不含有新橙皮苷，且不同基原的枳實黃酮類成分含量存在顯著性差異。

近年來，許多研究人員對酸橙與甜橙枳實進行了質量差異的比較。其中關于酸橙與甜橙枳實黃酮類成分的含量測定研究，大多表明兩者黃酮含量存在差異性[12-15]，但并未解釋產生這種現象的原因。本實驗研究發現，酸橙枳實總黃酮含量、浸出物含量均比甜橙枳實高，而又由于其瓤囊面積占橫切面面積遠小于甜橙枳實（即中果皮較厚），推測枳實中黃酮類成分與醇溶性浸出物主要存在于中果皮中。即酸橙枳實的總黃酮、浸出物含量高與其中果皮較厚有關。并且通過性狀分析發現，酸橙枳實除瓤囊面積占比小之外，其橫切面直徑也比甜橙枳實小，印證了《本草圖經》中“今醫家多以皮厚而小者為枳實”[16]這一對酸橙枳實的描寫。現代中醫臨床實踐證明，來源于酸橙的枳實更適合現代中醫臨床病癥[17]，本實驗的研究結果也為這一觀點提供了依據。從產地上來看，江西樟樹黃土崗的酸橙枳實浸出物含量最高，且該地的甜橙枳實辛弗林含量也相對較高。研究結果驗證了現代枳實以江西為道地產區，品質以江西樟樹最優[18]這一說法的科學性。實際應用中，可根據具體情況來選擇不同基原、不同產地的枳實，以適應臨床用藥的需要，達到對藥用資源的合理利用。此外，在2種枳實的質量均一性上，有研究者認為不同產地的酸橙枳實質量均一性較好，甜橙枳實質量差異較大[19]。而本實驗的性狀分析、相似度分析、主成分分析結果顯示，甜橙枳實質量較為均一，分析產生不同結論的原因可能是實驗所選取的枳實藥材產地不同。除重慶、江西、四川外，陜西、江蘇、福建、浙江、湖南等地亦為枳實的常見產地[20]。另外，考慮到樹齡對于枳實的質量評價也會存在一定影響，后期實驗還可以采集不同地區、不同樹齡所產的枳實藥材，進一步對枳實不同產地、樹齡與其質量之間進行比較研究。

本實驗分別建立了2個基原枳實的HPLC指紋圖譜，并對其進行了模式識別研究。采用聚類分析、主成分分析、聚類熱圖分析對不同基原產地的枳實藥材進行了質量分類，分類情況與枳實基原、產地分布較為吻合。利用OPLS-DA篩選出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種差異性標記物，其中新橙皮苷是枳實不同基原鑒別最重要的標識物。

中藥材作為各種飲片、經典名方制劑等中成藥新藥開發的源頭材料，其質量關乎到藥品最終的臨床療效的發揮，因此建立健全藥材的質量控制體系就顯得尤為關鍵。近年來，隨著一測多評、指紋圖譜技術的廣泛應用，中藥質量控制水平得到了較大的提升，這也使得更多更好的且安全有效的中藥制劑將服務于大眾。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on quality difference offrom different origins

LU Chao-ying1, 2, WANG Jia-li1, 2, WANG Hong-lan1, CHI Yu-mei1, ZHANG Wen1, 2, ZHAO Xiao-li1, 2, DI Liu-qing1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210023, China

The quality differences of two origins of Zhishi ()were studied by comparing their characters, extractives, synephrine, fingerprint and flavonoid contents.The quality ofwas evaluated and compared with that ofunder the items of character, extract and content determination ofin(2020 Edition). Then, the qualitative and quantitative analysis ofwas carried out by HPLC, and the fingerprints of differentwere established and the nine main flavonoids were determined.There was significant difference in the content of extracts from different varieties of, but no significant difference in the content of synephrine. There was no new hesperidin in sweet orange immature orange, but the content of this component was the highest in. There was a significant difference in the content of flavonoids in the two varieties except for tangerine peel (＜0.05). Through the pattern recognition of fingerprint, the classification of the two origins ofwas consistent with the distribution of its origin. Three different components, naringin, hesperidin and neohesperidin were selected by OPLS-DA analysis.There are some differences in the extract content, types and contents of the main components of different origins of. The quality difference research and fingerprint comparison in this experiment can provide the basis for clinical drug selection, new drug discovery and quality control of.

; high performance liquid chromatography; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares discriminant analysis; naringin; hesperidin; neohesperidin

R286.2

A

0253 - 2670(2022)14 - 4493 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.028

2021-12-03

江蘇高校優勢學科建設工程項目（PAPD）

陸超穎（1998—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥劑學。E-mail: 676891730@qq.com

趙曉莉（1976—），女，副研究員，研究方向為中藥藥劑學。E-mail: xlee_zhao@163.com

狄留慶（1964—），男，教授，研究方向為中藥藥劑學。E-mail: diliuqing@126.com

[責任編輯 時圣明]