不同基原枳實(shí)藥材的質(zhì)量差異評(píng)價(jià)研究

陸超穎，王佳麗，王洪蘭，池玉梅，張 雯，趙曉莉*，狄留慶*

不同基原枳實(shí)藥材的質(zhì)量差異評(píng)價(jià)研究

陸超穎1, 2，王佳麗1, 2，王洪蘭1，池玉梅1，張 雯1, 2，趙曉莉1, 2*，狄留慶1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023

通過(guò)比較性狀、浸出物、生物堿和黃酮成分的含量、指紋圖譜等內(nèi)容來(lái)系統(tǒng)研究基原為酸橙和甜橙的枳實(shí)藥材質(zhì)量差異，以期建立一個(gè)多元的枳實(shí)藥材質(zhì)量控制體系。按照《中國(guó)藥典》2020年版枳實(shí)項(xiàng)下對(duì)酸橙和甜橙枳實(shí)藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和比較，通過(guò)HPLC法對(duì)枳實(shí)進(jìn)行定性及定量分析，分別建立不同基原枳實(shí)藥材的指紋圖譜并對(duì)其9個(gè)主要的黃酮成分進(jìn)行含量測(cè)定。不同基原的枳實(shí)藥材浸出物含量差異明顯，而辛弗林含量沒(méi)有顯著性差異；甜橙枳實(shí)中不含新橙皮苷，而酸橙枳實(shí)中該成分含量最高；除桔皮素外，2個(gè)基原枳實(shí)的其他黃酮成分含量均存在顯著性差異（＜0.05）；通過(guò)指紋圖譜的模式識(shí)別，2種枳實(shí)分類情況與其產(chǎn)地分布較為吻合；通過(guò)正交偏最小二乘判別分析篩選出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷這3個(gè)差異性成分。不同基原枳實(shí)藥材在浸出物含量、主要黃酮類成分的種類及含量等方面均存在一定的差異性，對(duì)其進(jìn)行的質(zhì)量差異研究及指紋圖譜的比較，可以為枳實(shí)臨床用藥選擇、新藥開(kāi)發(fā)、藥材質(zhì)量控制等方面提供依據(jù)。

枳實(shí)；高效液相色譜法；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘判別分析；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

枳實(shí)為臨床常用中藥，具有破氣消積、化痰散痞的功效。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版記載，枳實(shí)為蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種或甜橙Osbeck的干燥幼果[1]。不同基原的枳實(shí)藥材所含活性成分的類別、含量等方面均存在差異性，而這些差異可導(dǎo)致其藥理作用和活性上的不同。目前，《中國(guó)藥典》規(guī)定浸出物與辛弗林含量是控制枳實(shí)藥材質(zhì)量的2個(gè)主要指標(biāo)，而研究表明，黃酮類成分在枳實(shí)中的含量較高，是其主要功效成分。因此，本研究通過(guò)對(duì)不同基原枳實(shí)藥材多方面的綜合考察，建立起一個(gè)多元的質(zhì)量控制體系，可以更好地為臨床用藥的有效性和新藥研發(fā)藥材的選擇提供保障和依據(jù)。

1 儀器與材料

sartorius CPA225D型電子天平；HH-S8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；Milli-Q Synthesis 108超純水儀；Waters e2695型高效液相色譜儀；KH-500DE型超聲波清洗器。無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、甲酸、磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉、冰醋酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；對(duì)照品辛弗林（批號(hào)110727-201608，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、橙皮苷（批號(hào)110721-201617，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%）、柚皮苷（批號(hào)110722-201714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.4%）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號(hào)P11N8L48150）、橙皮素（批號(hào)C03F6Y1）、柚皮素（批號(hào)YJ0603HA13）、甜橙黃酮（批號(hào)P14M6R1）、桔皮素（批號(hào)H09M7K14409）、川陳皮素（批號(hào)H22M8K32109）購(gòu)于上海源葉生物有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

枳實(shí)藥材采集自重慶江津、江西樟樹(shù)、江西吉安、四川眉山的4個(gè)不同地區(qū)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種或甜橙Osbeck 的干燥幼果。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

Table 1 Information of samples

序號(hào)樣品編號(hào)基原產(chǎn)地采收時(shí)間序號(hào)樣品編號(hào)基原產(chǎn)地采收時(shí)間 1S1酸橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0617T2甜橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-07 2S2酸橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0618T3甜橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-07 3S3酸橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0619T4甜橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-07 4S4酸橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0620T5甜橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-07 5S5酸橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0621T6甜橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-05 6S6酸橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-0722T7甜橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-05 7S7酸橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-0723T8甜橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-06 8S8酸橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-0724T9甜橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-06 9S9酸橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-0625T10甜橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-06 10 S10酸橙江西樟樹(shù)黃土崗2018-0626T11甜橙江西吉安新干縣2017-05 11 S11酸橙江西吉安新干縣2018-0627T12甜橙江西吉安新干縣2017-05 12 S12酸橙江西吉安新干縣2018-0628T13甜橙江西吉安新干縣2017-05 13 S13酸橙江西吉安新干縣2018-0629T14甜橙江西吉安新干縣2017-06 14 S14酸橙江西吉安新干縣2018-0630T15甜橙江西吉安新干縣2017-06 15 S15酸橙江西吉安新干縣2018-0631T16甜橙四川眉山丹棱縣2018-07 16T1甜橙重慶江津白沙鎮(zhèn)2018-0732T17甜橙四川眉山丹棱縣2018-07

2 方法與結(jié)果

2.1 不同基原枳實(shí)藥材性狀比較

隨機(jī)選取酸橙與甜橙枳實(shí)不同產(chǎn)地的某一編號(hào)樣品，對(duì)其進(jìn)行性狀分析，結(jié)果見(jiàn)圖1，并從以上編號(hào)中每批隨機(jī)選取6枚枳實(shí)，用游標(biāo)卡尺（精度為0.02 mm）測(cè)量其瓤囊及橫切面直徑，計(jì)算瓤囊占橫切面積的百分比，結(jié)果見(jiàn)表2。酸橙、甜橙瓤囊占比差異性分析見(jiàn)圖2。可以看出，2種基原的枳實(shí)藥材多呈半球形，少數(shù)為球形。質(zhì)地堅(jiān)硬，氣清香。藥材外果皮顏色為棕褐色或灰綠色，外表有皺紋，有些具有殘留的果梗，中果皮稍隆起且呈黃白（褐）色，瓤囊棕色。2種枳實(shí)藥材所表現(xiàn)出的性狀與《中國(guó)藥典》2020年版中對(duì)枳實(shí)的描述基本一致。不同產(chǎn)地的酸橙樣品與甜橙樣品相比較，酸橙枳實(shí)樣品的瓤囊占比較小，即中果皮相對(duì)較厚。這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道[2]中的一致。另外，不同產(chǎn)地的甜橙枳實(shí)在性狀上比較接近，而酸橙枳實(shí)由于產(chǎn)地的不同表現(xiàn)出外觀的大小不一。

A～C-酸橙枳實(shí)（分別產(chǎn)自重慶江津白沙鎮(zhèn)、江西樟樹(shù)黃土崗、江西吉安新干縣，瓤囊占比較小） D～F-甜橙枳實(shí)（分別產(chǎn)自重慶江津白沙鎮(zhèn)、江西樟樹(shù)黃土崗、江西吉安新干縣，瓤囊占比較大）

表2 不同基原代表性枳實(shí)藥材瓤囊面積占橫切面面積百分比

Table 2 Percentage of pulp capsule area in cross section area of different varieties of Aurantii Fructus Immaturus

編號(hào)瓤囊直徑/mm橫切面直徑/mm瓤囊面積/mm2橫切面面積/mm2占比/%平均值/% S4 7.1021.52 39.57363.5410.8915.16 7.3222.44 42.06395.2910.64 9.1225.14 65.29496.1413.16 9.9822.54 78.19398.8219.60 10.5224.48 86.88470.4318.47 11.3426.56100.95553.7718.23 S6 4.5013.18 15.90136.3611.6613.83 5.3815.78 22.72195.4711.62 3.9810.26 12.43 82.6415.05 5.1616.22 20.90206.5210.12 5.5414.62 24.09167.7914.36 6.1613.72 29.79147.7720.16 S11 4.2213.38 13.98140.53 9.9510.65 3.9812.12 12.43115.3110.78 5.0612.58 20.10124.2316.18 3.5610.68 9.95 89.5411.11 2.4410.24 4.67 82.31 5.68 3.14 9.82 7.74 75.7010.22 T114.3625.06161.87492.9832.8445.63 15.4422.64187.14402.3746.51 14.9021.36174.28358.1648.66 18.9824.64282.79476.6059.34 17.7623.02247.60415.9959.52 12.0223.18113.42421.7926.89 T814.2624.14159.63457.4534.9031.17 15.2225.98181.84529.8434.32 11.9624.06112.29454.4224.71 11.8821.10110.79349.4931.70 11.2222.50 98.82397.4124.87 14.2423.56159.18435.7336.53 T14 8.6216.22 58.33206.5228.2430.13 9.4215.72 69.66193.9935.91 9.2418.56 67.02270.4124.78 7.6616.12 46.06203.9922.58 10.8616.64 92.58217.3642.59 9.2017.82 66.44249.2826.65

**P＜0.01

2.2 浸出物含量測(cè)定

浸出物含量照《中國(guó)藥典》2020年版醇溶性浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用70%乙醇作溶劑。除去經(jīng)甲苯法（通則0832第四法）所測(cè)得的水分，按干燥品計(jì)算浸出物的含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，浸出物含量差異性分析見(jiàn)圖3。15批酸橙枳實(shí)的浸出物平均含量為58.19%；17批甜橙枳實(shí)的浸出物平均含量為25.12%，雖均符合藥典枳實(shí)浸出物項(xiàng)下規(guī)定（不少于12.0%），但不同基原枳實(shí)浸出物含量差異明顯（＜0.01）。

2.3 辛弗林含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Brige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（即磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉l.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1000 mL）；檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)（按辛弗林峰計(jì)算）應(yīng)不低于2000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取辛弗林對(duì)照品適量，精密稱定。加水制成含30.8 μg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取枳實(shí)中粉約l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，通過(guò)聚酰胺柱（60～90目，2.5 g，內(nèi)徑為1.5 cm，干法裝柱），用水25 mL洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

表3 不同基原枳實(shí)藥材的浸出物含量測(cè)定

Table 3 Determination of extract content of different kinds of Aurantii Fructus Immaturus

樣品編號(hào)浸出物/%樣品編號(hào)浸出物/% S156.07T225.38 S257.81T324.81 S359.22T426.70 S464.36T525.12 S559.57T626.48 S665.26T729.81 S765.08T832.23 S866.71T925.68 S953.08 T1027.31 S1054.13 T1122.09 S1157.89 T1222.00 S1253.42 T1322.83 S1353.84 T1422.54 S1454.66 T1522.38 S1551.81 T1621.41 T127.46 T1722.79

**P＜0.01

2.3.4 方法學(xué)考察 精密吸取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，再取同一供試品溶液，在制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果辛弗林峰面積的RSD值均小于2.1%，說(shuō)明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性良好；精密稱取同一樣品粗粉6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果辛弗林含量的RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好；精密稱取已知辛弗林含量的同批枳實(shí)粉末6份，每份0.5 g，精密加入辛弗林對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法處理后進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果辛弗林平均加樣回收率為98.3%，RSD值均小于2.2%，表明該方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.3.5 樣品測(cè)定結(jié)果 取各批枳實(shí)樣品，按“2.3.3”項(xiàng)配制供試品溶液；照“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄辛弗林峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算辛弗林的濃度。供試品平行3份，除去經(jīng)甲苯法（通則0832第四法）所測(cè)得的水分，按干燥品計(jì)算樣品中辛弗林的含量，結(jié)果見(jiàn)表4，辛弗林含量差異性分析見(jiàn)圖4。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，15批酸橙枳實(shí)的辛弗林平均含量為0.490%；17批甜橙枳實(shí)的辛弗林平均含量為0.647%，均符合藥典枳實(shí)含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定（不少于0.30%）。2種基原枳實(shí)中辛弗林的含量沒(méi)有顯著性差異（＞0.05），其中江西樟樹(shù)黃土崗的甜橙枳實(shí)辛弗林含量較其他產(chǎn)地高。

2.4 黃酮類成分含量分析與指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Brige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min，10%～19%A；10～25 min，19%A；25～27 min，19%～30%A；27～50 min，30%～53%A；50～51 min，53%～75%A；51～56 min，75%A；56～57 min，75%～10%A；57～62 min，10%A。檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表4 不同基原枳實(shí)藥材中辛弗林的含量測(cè)定

Table 4 Determination of synephrine in different varieties of Aurantii Fructus Immaturus

序號(hào)樣品編號(hào)辛弗林/%序號(hào)樣品編號(hào)辛弗林/% 1S10.42917T20.463 2S20.43418T30.893 3S30.41019T40.442 4S40.42920T50.445 5S50.50121T60.863 6S60.57722T71.132 7S70.57923T81.139 8S80.51424T91.176 9S90.36325 T100.600 10 S100.55526 T110.448 11 S110.52027 T120.407 12 S120.41628 T130.519 13 S130.75029 T140.533 14 S140.37430 T150.524 15 S150.49631 T160.456 16T10.45332 T170.508

**P＜0.01

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、甜橙黃酮、川陳皮素、桔皮素9種對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為103.57、596.00、335.47、968.53、22.55、22.97、6.67、33.07、23.34 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取枳實(shí)粗粉0.1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加入3/4體積甲醇，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，取出放冷，甲醇定容，搖勻?yàn)V過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.4.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線最高質(zhì)量濃度，精密移取混合對(duì)照品溶液1 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，混勻。依照倍比稀釋法，依次制備得到不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4.5 方法學(xué)考察 精密吸取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，再取同一供試品溶液，在制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果9種成分峰面積的RSD值均小于2.8%，表明儀器精密度、供試品溶液穩(wěn)定性良好；精密稱取同一樣品粗粉6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得9種成分含量的RSD值均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好；精密稱取已測(cè)定的枳實(shí)粉末6份，每份0.05 g，分別精密加入與樣品中含量相當(dāng)?shù)?種對(duì)照品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分的平均加樣回收率及RSD，結(jié)果表明9個(gè)成分平均加樣回收率在103.5%～94.7%，RSD值均小于2.6%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

表5 9種成分的線性關(guān)系考察

Table 5 Results of linear regression of nine components

成分r回歸方程線性范圍/(μg·mL?1) 蕓香柚皮苷0.999 5Y＝2 999.1 X－1 460.31.62～103.57 柚皮苷0.999 9Y＝3 760.9 X＋10 2629.31～596.00 橙皮苷0.999 9Y＝3 458.1 X＋3 604.45.24～335.47 新橙皮苷0.999 9Y＝4 111.6 X＋19 47315.13～968.53 柚皮素0.999 9Y＝10 943 X＋500.670.35～22.55 橙皮素0.999 9Y＝11 487 X＋865.80.36～22.97 甜橙黃酮0.999 8Y＝25 816 X－445.270.10～6.67 川陳皮素1.000 0Y＝12 673 X＋1 354.40.52～33.07 桔皮素1.000 0Y＝25 796 X＋1 779.80.36～23.34

2.4.6 樣品中黃酮類成分含量測(cè)定結(jié)果 將各供試品溶液按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各黃酮成分峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮類成分的濃度。供試品平行3份，除去經(jīng)甲苯法（通則0832第四法）所測(cè)得的水分，按干燥品計(jì)算樣品中黃酮類成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表6，黃酮類成分的含量差異性分析見(jiàn)圖5。數(shù)據(jù)顯示，酸橙枳實(shí)中包含了9種黃酮類成分；而甜橙枳實(shí)中，除產(chǎn)自四川眉山丹棱縣的2個(gè)樣品外，其余產(chǎn)地的甜橙枳實(shí)中包含了除新橙皮苷的8種黃酮類成分。且酸橙枳實(shí)以新橙皮苷、柚皮苷、橙皮苷、蕓香柚皮苷為主導(dǎo)；甜橙枳實(shí)以橙皮苷、蕓香柚皮苷、川陳皮素、柚皮苷含量占主導(dǎo)地位。2種基原枳實(shí)除桔皮素外，其余黃酮類成分含量均存在顯著性差異（＜0.05），總黃酮含量亦具有顯著性差異（＜0.05）。

表6 不同基原枳實(shí)藥材中的黃酮類成分種類及含量測(cè)定

Table 6 Types and contents of flavonoids in different varieties of samples

樣品編號(hào)蕓香柚皮苷/%柚皮苷/%橙皮苷/%新橙皮苷/%柚皮素/%橙皮素/%甜橙黃酮/%川陳皮素/%桔皮素/%總和/% S10.356 9.166 1.15214.9800.0180.0160.0070.0760.01825.788 S20.276 8.416 0.48214.4950.0260.022—0.0680.01823.804 S30.314 9.187 0.73315.6850.0190.0160.0040.0820.02126.059 S40.319 9.501 0.49014.0150.0160.008—0.0730.02124.443 S50.306 8.003 1.08220.1230.037 0.0360.0060.0930.02329.709 S60.999 9.895 1.71513.8290.1590.1020.0160.2850.14927.150 S71.09910.260 1.35013.8540.1570.0870.0160.3230.17627.321 S81.056 9.942 0.99013.7940.1460.1030.0190.3820.20226.635 S90.486 7.212 0.51913.3130.0470.0250.0140.2080.08421.908 S100.476 7.110 0.51412.7040.0360.0170.0140.2130.08921.175 S110.729 4.204 2.85716.7070.0450.0730.0230.1300.07324.842 S121.082 3.841 3.87417.2150.0440.0560.0230.1260.07326.333 S131.138 4.418 3.08316.4180.0590.0960.0260.1600.08525.483 S140.626 3.911 2.32416.9560.0440.0610.0260.1460.08024.174 S151.073 4.152 4.53316.2180.0540.1990.0300.1360.07726.472 T12.376 0.13018.176———0.0940.2320.02921.036 T22.188 0.26619.436—0.0170.0260.0510.3610.15422.498 T32.185 0.12318.924——0.0190.0810.1980.02621.557 T42.138 0.09418.607—0.0080.0120.0760.1810.02421.139 T52.364 0.12719.824——0.0150.0870.2120.02822.657 T61.676 0.42424.400—0.0210.0430.0220.4710.25727.313 T72.167 0.37421.298—0.0130.0450.0260.4770.25024.651 T82.460 0.43318.267—0.0090.0240.0260.5270.26022.007 T91.744 0.42623.949—0.0100.0540.0210.4860.26526.957 T101.947 0.40523.303—0.0100.0450.0250.4840.26326.482 T111.755 0.08818.283—0.0110.0380.0600.1410.02020.396 T122.096 0.11221.322—0.0130.0410.0650.1520.02323.822 T132.565 0.17926.061—0.0140.0730.0850.1940.02629.198 T141.907 0.07418.689—0.0110.0180.0610.1430.02120.924 T152.002 0.09220.580—0.0120.0410.0660.1520.02222.968 T162.006 0.31814.0690.1540.0170.0160.0830.2010.02816.892 T171.978 0.31013.7100.1400.0170.0160.0820.1970.02716.478

*P＜0.05 **P＜0.01

2.4.7 指紋圖譜方法學(xué)考察 精密吸取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，再取同一供試品溶液，分別在溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，再精密稱取同一樣品粗粉0.1 g，按“2.4.3”項(xiàng)下方法同時(shí)制備6份供試品溶液后進(jìn)樣測(cè)定，以橙皮苷為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷等9種已知成分與橙皮苷之間的相對(duì)保留時(shí)間、各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%。

2.4.8 樣品HPLC指紋圖譜的建立 將15批酸橙枳實(shí)的供試品溶液按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，所得的樣品色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件。以S1指紋圖譜作為參照譜，生成共有模式，標(biāo)定出21個(gè)共有峰。精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL按“2.4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間及光譜圖比對(duì)，指認(rèn)出9個(gè)共有峰，見(jiàn)圖6。

同法17批甜橙枳實(shí)樣品共標(biāo)定出了14個(gè)共有峰，并指認(rèn)出其中8個(gè)共有峰，見(jiàn)圖7。酸橙枳實(shí)指認(rèn)出了9個(gè)黃酮類成分，甜橙枳實(shí)指認(rèn)出了8個(gè)黃酮類成分，甜橙枳實(shí)缺少的為新橙皮苷。

8-蕓香柚皮苷 10-柚皮苷 11-橙皮苷 12-新橙皮苷 15-柚皮素 16-橙皮素 18-甜橙黃酮 19-川陳皮素 21-桔皮素

對(duì)2種基原枳實(shí)樣品分別進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，樣品疊加圖見(jiàn)圖8、9。以共有模式作為對(duì)照指紋圖譜，進(jìn)行指紋圖譜相似度的評(píng)價(jià)。15批酸橙枳實(shí)樣品和對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度分別為0.992、0.993、0.993、0.985、0.995、0.983、0.980、0.980、0.996、0.995、0.982、0.975、0.984、0.980、0.975，均大于0.960，表明15批酸橙枳實(shí)藥材相似度良好。17批甜橙枳實(shí)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.995、0.998、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999，也均大于0.960，表明17批甜橙枳實(shí)藥材相似度良好。

5-蕓香柚皮苷 6-柚皮苷 7-橙皮苷 9-柚皮素 10-橙皮素 11-甜橙黃酮 12-川陳皮素 14-桔皮素

圖8 15批酸橙枳實(shí)藥材HPLC疊加圖

圖9 17批甜橙枳實(shí)藥材HPLC疊加圖

2.4.9 指紋圖譜的模式識(shí)別研究 以2種枳實(shí)標(biāo)定的共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件。對(duì)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，用歐氏距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖10。根據(jù)聚類結(jié)果可以把枳實(shí)藥材分為7類，第I類包括T16、T17，產(chǎn)自四川眉山丹棱縣；第II類包括T11、T12、T14、T15，均產(chǎn)自江西吉安新干縣；第III類包括T1、T3、T4、T5、T13，其中除T13外，其余樣品均產(chǎn)自重慶江津白沙鎮(zhèn)；第IV類包括T2、T6、T7、T8、T9、T10，其中除T2外，其余樣品均產(chǎn)自江西樟樹(shù)黃土崗；第V類包括S6、S7、S8，均產(chǎn)自江西樟樹(shù)黃土崗；第VI類包括S1、S2、S3、S4、S5，均產(chǎn)自重慶江津白沙鎮(zhèn)；第VII類包括S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15，其中除S9、S10外，其余均產(chǎn)自江西吉安新干縣。酸橙枳實(shí)根據(jù)產(chǎn)地不同聚為3類，甜橙枳實(shí)根據(jù)產(chǎn)地聚為4類，分類情況與枳實(shí)產(chǎn)地分布較為吻合，其中部分幾個(gè)樣品未歸在相應(yīng)產(chǎn)地一類，表明其與相同產(chǎn)地的其余批次樣品間差異較大。

將各樣品28個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入到SIMCA 14.1軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)圖11。根據(jù)主成分結(jié)果可以把枳實(shí)藥材分為6類：S1、S2、S3、S4、S5歸為I類；S6、S7、S8歸為II類；S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15歸為III類；T1、T3、T4、T5、T11、T12、T13、T14、T15、T16、T17歸為IV類；T6、T7、T8、T9、T10歸為V類，T2單獨(dú)歸為VI類。I類為重慶江津白沙鎮(zhèn)的酸橙枳實(shí)，II類為產(chǎn)自江西樟樹(shù)黃土崗的酸橙枳實(shí)，III類酸橙枳實(shí)中，除S9、S10外，其余均產(chǎn)自江西吉安新干縣，IV類為重慶江津白沙鎮(zhèn)、江西吉安新干縣、四川眉山丹棱縣3個(gè)產(chǎn)地的甜橙枳實(shí)，第V類是江西樟樹(shù)黃土崗的甜橙枳實(shí)，VI類只有產(chǎn)自重慶江津白沙鎮(zhèn)的T2甜橙枳實(shí)樣品。

圖10 聚類分析樹(shù)狀圖

圖11 主成分分析圖

將各樣品28個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），篩選出差異性化合物。對(duì)酸橙組與甜橙組建模，模型參數(shù)2＝0.832，2＝0.986，2＝0.985。結(jié)果見(jiàn)圖12。從OPLS-DA得分圖（圖12-A）可見(jiàn)得分值集中分布于95%置信區(qū)間，模型擬合效果好。S-plot（圖12-B）中12、13、14號(hào)峰（A12、A13、A14）位于S-plot兩端，對(duì)應(yīng)成分為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，可篩選其作為差異性標(biāo)記物。構(gòu)建OPLS-DA的模型驗(yàn)證試驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)為100，置換檢驗(yàn)圖（圖12-C）中顯示，獲得隨機(jī)模型的2值均小于原模型的2值，表明模型具有良好的穩(wěn)定性，擬合良好。根據(jù)變量權(quán)重重要性（Variable importance in the projection，VIP）排序預(yù)測(cè)值分布圖（圖12-D），提取VIP＞1的變量，分別為12、13、14號(hào)峰，其在S-plot中距離原點(diǎn)均有較大的距離，表明它們對(duì)分類的貢獻(xiàn)較大，提示其可能為2種不同基原枳實(shí)的差異性成分。其中，14號(hào)峰新橙皮苷的VIP值最大，是基原鑒別最重要的標(biāo)識(shí)物。將32批樣品28個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入OmicShare網(wǎng)站，所有數(shù)據(jù)歸一化后進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖13。從聚類熱圖中可以看出，15個(gè)酸橙枳實(shí)樣本聚為一類，17個(gè)甜橙枳實(shí)樣本聚為一類，這與枳實(shí)基原的分類相符。色譜峰聚類表明：2～3、7～15、17、19、22～24、26號(hào)峰在不同基原枳實(shí)中差異較大，是區(qū)別2種枳實(shí)的強(qiáng)特征峰。

A-OPLS-DA得分圖 B-S-plot圖 C-100次置換檢驗(yàn)圖 D-VIP值圖 A1～A28-峰1～28

圖13 聚類熱圖

3 討論

同一藥材可能存在多基原現(xiàn)象，而基原的不同會(huì)導(dǎo)致所含活性成分的差異，進(jìn)而會(huì)引起藥物療效的差別。枳實(shí)中醇浸出物含量會(huì)影響枳實(shí)藥材的貯存及質(zhì)量，故控制醇浸出物的含量對(duì)評(píng)價(jià)枳實(shí)質(zhì)量有重要的意義[3]，但目前浸出物含量是否與枳實(shí)基原有關(guān)則很少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。生物堿類成分辛弗林是枳實(shí)中的有效成分之一，具有強(qiáng)心、升血壓與抗組胺[4]的藥理作用。枳實(shí)中生物堿成分的含量多少受藥材采收時(shí)間、存放時(shí)間等因素影響[5]，采收的適宜期應(yīng)為5月下旬，藥材存放時(shí)間越長(zhǎng)，生物堿含量則會(huì)降低。

對(duì)于枳實(shí)藥材的質(zhì)量控制，《中國(guó)藥典》2020年版目前規(guī)定只對(duì)辛弗林進(jìn)行含量測(cè)定，但枳實(shí)中的其他成分如黃酮類[6]也具有顯著的藥理活性，因此，只對(duì)單一的成分進(jìn)行質(zhì)量控制不能全面體現(xiàn)藥材的質(zhì)量。中藥指紋圖譜因信息量大、整體性好、特征性強(qiáng)[7]，可以很好地反映出中藥多種成分、整體作用的特點(diǎn)。黃酮類成分在枳實(shí)中的含量較高，是其主要功效成分，主要為橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮蕓香苷等[8]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)的黃酮類成分具有抑制胃腸道平滑肌痙攣性收縮、抗炎、抗氧化[9]等作用，這與枳實(shí)臨床用于破氣消積，治療胃脹痛、胃潰瘍等胃腸道疾病的功效相一致。有文獻(xiàn)[10]報(bào)道稱，不同基原枳實(shí)的黃酮類成分存在種類與含量差異，而這些差異可能進(jìn)一步導(dǎo)致該藥材藥理作用及活性上的差異。本實(shí)驗(yàn)中黃酮類含量測(cè)定方法[11]參考了本課題組前期的研究。結(jié)果表明，甜橙枳實(shí)中不含有新橙皮苷，且不同基原的枳實(shí)黃酮類成分含量存在顯著性差異。

近年來(lái)，許多研究人員對(duì)酸橙與甜橙枳實(shí)進(jìn)行了質(zhì)量差異的比較。其中關(guān)于酸橙與甜橙枳實(shí)黃酮類成分的含量測(cè)定研究，大多表明兩者黃酮含量存在差異性[12-15]，但并未解釋產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，酸橙枳實(shí)總黃酮含量、浸出物含量均比甜橙枳實(shí)高，而又由于其瓤囊面積占橫切面面積遠(yuǎn)小于甜橙枳實(shí)（即中果皮較厚），推測(cè)枳實(shí)中黃酮類成分與醇溶性浸出物主要存在于中果皮中。即酸橙枳實(shí)的總黃酮、浸出物含量高與其中果皮較厚有關(guān)。并且通過(guò)性狀分析發(fā)現(xiàn)，酸橙枳實(shí)除瓤囊面積占比小之外，其橫切面直徑也比甜橙枳實(shí)小，印證了《本草圖經(jīng)》中“今醫(yī)家多以皮厚而小者為枳實(shí)”[16]這一對(duì)酸橙枳實(shí)的描寫(xiě)。現(xiàn)代中醫(yī)臨床實(shí)踐證明，來(lái)源于酸橙的枳實(shí)更適合現(xiàn)代中醫(yī)臨床病癥[17]，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也為這一觀點(diǎn)提供了依據(jù)。從產(chǎn)地上來(lái)看，江西樟樹(shù)黃土崗的酸橙枳實(shí)浸出物含量最高，且該地的甜橙枳實(shí)辛弗林含量也相對(duì)較高。研究結(jié)果驗(yàn)證了現(xiàn)代枳實(shí)以江西為道地產(chǎn)區(qū)，品質(zhì)以江西樟樹(shù)最優(yōu)[18]這一說(shuō)法的科學(xué)性。實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況來(lái)選擇不同基原、不同產(chǎn)地的枳實(shí)，以適應(yīng)臨床用藥的需要，達(dá)到對(duì)藥用資源的合理利用。此外，在2種枳實(shí)的質(zhì)量均一性上，有研究者認(rèn)為不同產(chǎn)地的酸橙枳實(shí)質(zhì)量均一性較好，甜橙枳實(shí)質(zhì)量差異較大[19]。而本實(shí)驗(yàn)的性狀分析、相似度分析、主成分分析結(jié)果顯示，甜橙枳實(shí)質(zhì)量較為均一，分析產(chǎn)生不同結(jié)論的原因可能是實(shí)驗(yàn)所選取的枳實(shí)藥材產(chǎn)地不同。除重慶、江西、四川外，陜西、江蘇、福建、浙江、湖南等地亦為枳實(shí)的常見(jiàn)產(chǎn)地[20]。另外，考慮到樹(shù)齡對(duì)于枳實(shí)的質(zhì)量評(píng)價(jià)也會(huì)存在一定影響，后期實(shí)驗(yàn)還可以采集不同地區(qū)、不同樹(shù)齡所產(chǎn)的枳實(shí)藥材，進(jìn)一步對(duì)枳實(shí)不同產(chǎn)地、樹(shù)齡與其質(zhì)量之間進(jìn)行比較研究。

本實(shí)驗(yàn)分別建立了2個(gè)基原枳實(shí)的HPLC指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行了模式識(shí)別研究。采用聚類分析、主成分分析、聚類熱圖分析對(duì)不同基原產(chǎn)地的枳實(shí)藥材進(jìn)行了質(zhì)量分類，分類情況與枳實(shí)基原、產(chǎn)地分布較為吻合。利用OPLS-DA篩選出了柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷3種差異性標(biāo)記物，其中新橙皮苷是枳實(shí)不同基原鑒別最重要的標(biāo)識(shí)物。

中藥材作為各種飲片、經(jīng)典名方制劑等中成藥新藥開(kāi)發(fā)的源頭材料，其質(zhì)量關(guān)乎到藥品最終的臨床療效的發(fā)揮，因此建立健全藥材的質(zhì)量控制體系就顯得尤為關(guān)鍵。近年來(lái)，隨著一測(cè)多評(píng)、指紋圖譜技術(shù)的廣泛應(yīng)用，中藥質(zhì)量控制水平得到了較大的提升，這也使得更多更好的且安全有效的中藥制劑將服務(wù)于大眾。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 63.

[2] 邱伊星, 肖瑞飛, 龔力民, 等. 湖南麻陽(yáng)甜橙幼果枳實(shí)的質(zhì)量評(píng)價(jià)分析 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(7): 851-855.

[3] 白雁, 樊明月, 雷敬衛(wèi), 等. 近紅外漫反射光譜法快速測(cè)定枳實(shí)藥材中醇浸出物的含量 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(1): 73-76.

[4] 張霄瀟, 李正勇, 馬玉玲, 等. 中藥枳實(shí)的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(2): 185-190.

[5] 陳振峰. 枳實(shí)及其藥用有效成分研究 [J]. 中國(guó)野生植物資源, 2005, 24(4): 38-40.

[6] 何英杰, 劉東波, 唐其, 等. 酸橙類中藥材枳實(shí)和枳殼化學(xué)成分研究進(jìn)展 [J]. 中藥材, 2017, 40(6): 1488-1494.

[7] 李強(qiáng), 杜思邈, 張忠亮, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向展望 [J]. 中草藥, 2013, 44(22): 3095-3104.

[8] 張紅, 孫明江, 王凌. 枳實(shí)的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 中藥材, 2009, 32(11): 1787-1790.

[9] 黃雪麗, 陳玉宇. 中藥枳實(shí)的化學(xué)成分及分析方法研究進(jìn)展 [J]. 廣州化工, 2016, 44(17): 22-25.

[10] 李輝, 唐愛(ài)國(guó), 徐漢斌, 等. 枳實(shí)研究進(jìn)展 [J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 17(5): 58-59.

[11] 高喜梅, 池玉梅, 張?chǎng)? 等. 指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)酸橙枳實(shí)質(zhì)量的研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(9): 2548-2556.

[12] 朱露, 雷鵬, 黃琪, 等. 反相高效液相色譜法測(cè)定枳實(shí)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量 [J]. 中南藥學(xué), 2013, 11(12): 934-937.

[13] 王淳. 不同品種產(chǎn)地枳實(shí)有效成分的對(duì)比分析 [D]. 北京: 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院, 2009.

[14] 黎陽(yáng), 劉素香, 張鐵軍, 等. 枳實(shí)的高效液相色譜指紋圖譜研究 [J]. 中草藥, 2009, 40(9): 1469-1474.

[15] 張振霞, 鄭玉忠, 梁麗娟, 等. 酸橙和甜橙2種枳實(shí)藥材HPLC指紋圖譜研究及其柚皮苷和辛弗林含量分析 [J]. 中國(guó)藥房, 2011, 22(39): 3711-3714.

[16] 宋·唐慎微撰. 重修政和經(jīng)史證類備用本草(三十卷) [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1957: 323.

[17] 宋玉鵬, 胡源祥, 陳海芳, 等. 對(duì)枳實(shí)和枳殼藥用品種變遷的思考 [J]. 江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 28(4): 120-124.

[18] 胡蓉, 李忠貴, 肖草茂, 等. 枳實(shí)、枳殼藥材基原及道地產(chǎn)地的變遷 [J]. 中藥材, 2019, 42(3): 686-689.

[19] 曾鴻蓮, 劉振麗, 宋志前, 等. 不同品種枳實(shí)HPLC指紋圖譜及成分含量差異性研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(17): 3272-3278.

[20] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典-上冊(cè)[M]. 上海: 上海人民出版社, 1977: 263.

Study on quality difference offrom different origins

LU Chao-ying1, 2, WANG Jia-li1, 2, WANG Hong-lan1, CHI Yu-mei1, ZHANG Wen1, 2, ZHAO Xiao-li1, 2, DI Liu-qing1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210023, China

The quality differences of two origins of Zhishi ()were studied by comparing their characters, extractives, synephrine, fingerprint and flavonoid contents.The quality ofwas evaluated and compared with that ofunder the items of character, extract and content determination ofin(2020 Edition). Then, the qualitative and quantitative analysis ofwas carried out by HPLC, and the fingerprints of differentwere established and the nine main flavonoids were determined.There was significant difference in the content of extracts from different varieties of, but no significant difference in the content of synephrine. There was no new hesperidin in sweet orange immature orange, but the content of this component was the highest in. There was a significant difference in the content of flavonoids in the two varieties except for tangerine peel (＜0.05). Through the pattern recognition of fingerprint, the classification of the two origins ofwas consistent with the distribution of its origin. Three different components, naringin, hesperidin and neohesperidin were selected by OPLS-DA analysis.There are some differences in the extract content, types and contents of the main components of different origins of. The quality difference research and fingerprint comparison in this experiment can provide the basis for clinical drug selection, new drug discovery and quality control of.

; high performance liquid chromatography; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares discriminant analysis; naringin; hesperidin; neohesperidin

R286.2

A

0253 - 2670(2022)14 - 4493 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.028

2021-12-03

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD）

陸超穎（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: 676891730@qq.com

趙曉莉（1976—），女，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: xlee_zhao@163.com

狄留慶（1964—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。E-mail: diliuqing@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]