蓬莪術揮發油中倍半萜類化學成分及舒張子宮平滑肌活性

崔 婷，倪 紅，劉 娟，彭 成，熊 亮*，劉 菲*

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蓬莪術揮發油中倍半萜類化學成分及舒張子宮平滑肌活性

崔 婷1, 2，倪 紅1, 2，劉 娟1, 2，彭 成1，熊 亮1, 2*，劉 菲1, 2*

1. 成都中醫藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 成都中醫藥大學 西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川 成都 611137

研究蓬莪術根莖揮發油中的化學成分及其舒張子宮平滑肌活性。采用硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜、反相中壓液相色譜、制備薄層色譜和半制備高效液相色譜等分離技術進行分離純化，并運用多種現代波譜技術對化合物進行結構鑒定，通過NOE數據確定其相對構型，計算電子圓二色譜（ECD）確定其絕對構型。利用縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌痙攣模型考察化合物對子宮平滑肌收縮活動的影響。從蓬莪術揮發油中分離得到2個倍半萜化合物，分別鑒定為(1,4,5,6,7,10)-1(10),4(5)-雙環氧吉瑪烷-11(12)-烯-6-醇（1）和curcumanolide A（2）。其中化合物2對縮宮素誘導的大鼠離體子宮平滑肌收縮具有抑制作用。化合物1為1個新的吉瑪烷型倍半萜，命名為雙環氧吉瑪烯醇。化合物2具有舒張子宮平滑肌活性。

蓬莪術；揮發油；倍半萜；雙環氧吉瑪烯醇；curcumanolide A；生物活性；舒張大鼠子宮平滑肌

莪術為姜科植物蓬莪術Val.、廣西莪術S. G. Lee et C. F. Liang或溫郁金Y. H. Chen et C. Ling的干燥根莖[1]，主要分布于四川、廣西、福建等地。最早記載于《藥性論》：“能治女子血氣心痛，破痃癖冷氣，以酒醋磨服，效”[2]，具有行氣破血、消積止痛之功效，治療心腹疼痛，脅下脹疼等血凝氣滯之證。作為活血化瘀的常用中藥，莪術具有較好的調經止痛作用。早在《日華子本草》就有“莪術，通月經，消瘀血，止撲損痛，下血及內損惡血”。《濟陰綱目》也有記載“莪術治經閉不通及血塊疼痛”。在現代臨床中，莪術也多用于治療多種婦科疾病，如子宮內膜異位癥[3]、卵巢癌[4]、痛經[5-6]等。現代研究發現莪術中活性成分主要為揮發油和姜黃素類，其中揮發油以倍半萜類為主[7-9]，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮痛、抗血栓等作用[10-13]，但目前關于其治療痛經的物質基礎研究較為欠缺。課題組前期探索發現蓬莪術揮發油具有顯著的舒張子宮平滑肌活性[14]，證實了蓬莪術揮發油與痛經等婦科疾病的相關性。因此，為了進一步研究蓬莪術揮發油舒張子宮平滑肌的物質基礎，本研究應用多種色譜和波譜技術分離純化和鑒定其中的倍半萜類成分，得到1個新的吉瑪烷型倍半萜成分(1,4,5,6, 7,10)-1(10),4(5)-雙環氧吉瑪烷-11(12)-烯-6-醇（1）以及1個已知化合物curcumanolide A（2）；新化合物1命名為雙環氧吉瑪烯醇。對分離得到的化合物進行舒張子宮平滑肌活性研究，發現化合物2具有舒張子宮平滑肌活性，而化合物1無顯著作用。

圖1 化合物1和2的化學結構

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

旋光測定儀（美國Rudolph公司）；Agilent Cary 600紅外光譜儀（美國Agilent公司）；高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Bruker-600核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Agilent 6230 LC/TOF高分辨質譜儀（美國Agilent公司）；圓二色譜儀（Applied Photophysics Ltd）；C18色譜柱（Welch公司，250 mm×10 mm，5 μm，半制備型）；Gradient Former B-687中壓液相色譜儀（瑞士Buchi公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milli-pore公司）；旋轉蒸發儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；SQP型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HSGF254高效薄層色譜硅膠板（煙臺市芝罘黃務硅膠開發試驗廠）；柱色譜硅膠、薄層色譜硅膠（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（上海東曹生物科技有限公司）；反相C18填料（上海月旭科技股份有限公司）；Powerlab多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro專業版軟件［澳大利亞埃德儀器國際貿易（上海）有限公司］；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

甲醇（色譜級，美國Sigma公司）；乙腈（色譜級，美國Fisher公司）；石油醚、二氯甲烷、二甲亞砜等分析純試劑（成都市科隆化學品有限公司）；縮宮素注射液（江西省創欣藥業集團有限公司，批號191011，規格2 mL∶10 U，使用時用生理鹽水配成1 U/mL）；戊酸雌二醇片（DELPHARM Lille S.A.S.，批號498A，規格1 mg/片，使用時用純水制備成0.8 mg/mL）；鹽酸維拉帕米（中國食品藥品檢定研究院，批號100223-200102，規格50 mg/支，用純水配成1×10?3mol/L的母液）。

1.2 動物

健康未孕成年SD大鼠，普通級，雌性，體質量220～250 g，由成都達碩實驗動物有限公司提，動物生產許可證號SCXK (川) 2020-030。動物實驗經成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會審核（備案編號為2020-04），均符合3R原則。

1.3 藥材

蓬莪術藥材采于四川省崇州市三江鎮宋橋村，經成都中醫藥大學高繼海副教授鑒定為姜科多年生草本植物蓬莪術Val.的干燥根莖，植物標本（CP-20200705）保存于成都中醫藥大學西南特色藥材創新藥物成分研究所。

2 提取與分離

蓬莪術藥材（50 kg）粉碎后加10倍量水，通過水蒸氣蒸餾法得到約420 g揮發油。將得到的揮發油通過分子蒸餾分為低沸點部位和高沸點部位。取高沸點部位（320 g）經硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）梯度洗脫，洗脫液經薄層色譜檢測，合并相似組分，減壓濃縮至稠浸膏，并依次編號為A～K。浸膏E經反相中壓柱色譜，用甲醇-水（50%～100%）梯度洗脫，經薄層色譜法檢視，合并相似洗脫餾分并減壓濃縮，得15個餾分（Fr. E1～E15）。Fr. E8經硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮（400∶1→1∶1）梯度洗脫，得到14份樣品（Fr. E8-1～E8-14），其中Fr. E8-8經制備薄層色譜（石油醚-醋酸乙酯-丙酮10∶4∶3）分離成4份（Fr. E8-8-1～E8-8-4）。Fr. E8-8-3利用制備薄層色譜法（石油醚-醋酸乙酯-丙酮10∶7∶1）分離成3份（Fr. E8-8-3-1～E8-8-3-3），其中Fr. E8-8-3-2經反相半制備高效液相色譜分離，以70%乙腈-水為流動相進行洗脫（體積流量2.0 mL/min），得到3個餾分（Fr. E8-8-3-2-1～E8-8-3-2-3）。再將Fr. E8-8-3-2-1經反相半制備高效液相色譜分離，40%乙腈-水為流動相，1.5 mL/min進行洗脫，得到化合物1（1.72 mg，R＝23 min）。另取Fr. E5過硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯-丙酮（400∶1∶1→3∶1∶1）梯度洗脫，得13個餾分（Fr. E5-1～E5-13）。其中Fr. E5-3經葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）洗脫，得到4個餾份（Fr. E5-3-1～E5-3-4）。對Fr. E5-3-2進行反相半制備液相色譜分離，以48%甲醇-水為流動相進行洗脫，體積流量1.5 mL/min，分離得到化合物2（2.57 mg，R＝75 min）。

3 結構鑒定

為進一步確定化合物1的結構，進行了2D NMR實驗（圖2），化合物1的1H-1H COSY譜顯示H-1/H-2/H-3相關、H-5/H-6相關、H-7/H-8/H-9相關。在HMBC譜中，H-2與C-1、C-3、C-4、C-10相關，H-3與C-2、C-4、C-5、C-15相關，H-6與C-5、C-7、C-8、C-11相關，H-8與C-7、C-9、C-10、C-11相關，H3-15與C-3、C-4、C-5相關，H3-14與C-1、C-9、C-10相關，OH-6與C-5、C-6、C-7相關。根據以上2D NMR數據推斷化合物1為吉瑪烷型倍半萜，且C-6位存在羥基取代，C-11/C-12位為雙鍵，C-1/C-10和C-4/C-5位分別形成了三元氧環。

表1 化合物1的1H-NMR及13C-NMR數據(600/150MHz, acetone-d6)

Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data for compound 1 (600/150MHz, acetone-d6)

碳位δHδC碳位δHδC 13.10 (1H, m)60.692.13 (1H, m), 0.98 (1H, m)40.9 22.25 (1H, m), 1.45 (1H, m)25.410—60.0 32.06 (1H, m), 1.17(1H, m)35.211—149.7 4—59.5124.86 (1H, brs), 4.74 (1H, brs)111.3 52.80 (1H, d, J = 8.4 Hz)68.8131.81 (3H, brs)22.1 63.49 (1H, ddd, J = 8.4, 4.8, 2.4 Hz)72.9141.31 (3H, s)17.0 72.12 (1H, m)50.9151.39 (3H, s)17.1 82.03 (1H, m), 1.02 (1H, m)22.76-OH4.02 (1H, d, J = 4.8 Hz)

圖2 化合物1主要的1H-1H COSY、HMBC和NOE相關信號

化合物1的相對構型通過1D NOE差譜確定，照射H-1引起H-7、H-9 [H0.98 (1H, m)] 和H3-15增益，照射H-6引起H3-15增益，照射H-5引起OH-6和H3-14增益，證明H-5、OH-6、H3-14在同側，H-1、H-6、H-7、H3-15在異側。進一步通過計算ECD確定化合物1的絕對構型，使用IEFPCM模型，以乙腈為溶劑，在CAM-B3LYP/DGDZVP水平計算(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1和(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1的ECD譜，見圖3。結果表明(1, 4, 5, 6, 7, 10)-1的理論ECD譜與化合物1的實驗ECD譜吻合。因此，化合物1的絕對構型被確定為1, 4, 5, 6, 7, 10，化合物1被鑒定為(1,4,5,6,7,10)-1(10), 4(5)-雙環氧吉瑪烷-11(12)-烯-6-醇，經檢索為新化合物，命名為雙環氧吉瑪烯醇。

圖3 化合物1的實驗ECD譜和計算ECD譜

化合物2：無色油狀物。ESI-MS/: 257.151 5 [M＋Na]+，提示其分子組成為C15H22O2（計算值257.151 7，C15H22O2Na）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3): 4.95 (1H, brs, H-9a), 4.76 (1H, brs, H-9b), 2.82 (1H, dd,= 11.4, 8.4 Hz, H-1), 2.46 (2H, m, H2-6), 2.33 (1H, m, H-4), 2.24 (3H, brs, H3-12), 1.91 (1H, m, H-3a), 1.84 (3H, s, H3-13), 1.80 (1H, m, H-2a),1.73 (3H, s, H3-15), 1.64 (1H, m, H-2b), 1.18 (1H, m, H-3b), 0.87 (3H, d,= 7.2 Hz, H3-14)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 170.0 (C-8), 149.4 (C-10), 143.9 (C-11), 120.9 (C-7), 112.9 (C-9), 89.8 (C-5), 52.3 (C-1), 42.9 (C-4), 27.7 (C-6), 26.5 (C-2), 24.5 (C-12), 24.1 (C-13), 23.3 (C-3), 20.0 (C-15), 13.3 (C-14)。以上數據與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物2為 curcumanolide A。

4 大鼠離體子宮平滑肌舒張活性

4.1 溶液制備

取NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl20.24 g、NaHCO30.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理鹽水制備成1000 mL的溶液即得洛氏液。

4.2 大鼠離體子宮平滑肌肌條制備

采用課題組前期建立的模型及方法[16]，每天按8 mg/kg劑量ig戊酸雌二醇溶液，連續2 d，復制動情期大鼠模型。實驗第3天，處死大鼠，將剖取下的子宮置于盛有洛氏液的玻璃皿中，輕輕剝離子宮上附有的結締組織和脂肪組織，并取2～3 cm中間段子宮平滑肌。

4.3 蓬莪術揮發油成分對大鼠離體子宮平滑肌的舒張活性測試

將肌條一端固定于盛有20 mL洛氏液的恒溫水浴槽中（浴槽中的洛氏液持續通入95% O2和5%的CO2，速度為1～2個小氣泡/s），另一端連接張力換能器，記錄子宮收縮曲線[17]。采用縮宮素（160 μL）復制子宮平滑肌收縮模型，并用PowerLab多功能生理記錄儀記錄子宮收縮曲線。以100 μL DMSO為溶劑對照組，終濃度0.5 μmol/L鹽酸維拉帕米為陽性對照，給藥組終濃度分別為2、10、50 μmol/L。觀察10 min內離體子宮平滑肌的收縮張力，記錄收縮曲線，并計算給藥后的子宮平滑肌收縮張力抑制率，實驗重復3～5次。采用統計學軟件SPSS 19.0進行數據分析，結果以表示。

收縮張力抑制率＝(給藥前收縮張力平均值－給藥后收縮張力平均值)/給藥前收縮張力平均值

結果（表2）表明，DMSO對子宮平滑肌收縮活動無明顯影響。與對照組相比，陽性藥組收縮張力明顯降低（＜0.01），抑制率為（67.33±3.68）%；不同劑量的化合物2均可顯著抑制子宮平滑肌收縮（＜0.01），且具有濃度相關性，其中50 μmol/L給藥組效果最佳，抑制率達到（53.72±1.32）%。化合物1對子宮平滑肌收縮無顯著影響。

表2 化合物2對縮宮素誘導的大鼠子宮平滑肌收縮活動的影響 (±s)

Table 2 Effects of compound 2 on oxytocin-induced rat uterine smooth muscle contraction (±s)

組別n/只濃度/(μmol?L?1)收縮張力抑制率/% 對照5—10.01±1.15 鹽酸維拉帕米5 0.567.33±3.68** 23 2 17.77±1.47** 31026.93±4.06** 35053.72±1.32**

與對照組比較：**＜0.01

**<0.01control group

5 討論

蓬莪術為傳統活血化瘀中藥，具有行氣破血、消積止痛的功效，可治療血氣心痛、脅下脹疼、血凝氣滯、月經不調、經閉痛經、妊娠心腹痛等病癥[18-20]。現代臨床常用于心血管疾病和婦科疾病如痛經、月經不調等的治療。基于蓬莪術的傳統功效，課題組開展了一系列相關的物質基礎研究，發現蓬莪術中部分倍半萜成分具有舒張血管和抗血小板聚集活性[21-22]。此外，還發現蓬莪術揮發油具有顯著舒張子宮平滑肌作用[14]。因此，進一步對蓬莪術揮發油中活性倍半萜類化學成分進行了研究。

本研究采用現代分離手段和波譜學技術，從蓬莪術揮發油中分離鑒定了2個倍半萜，其中化合物1為新化合物，為1個具有雙環氧結構的吉瑪烷型倍半萜，并通過計算ECD確定了其絕對構型。進一步對分離得到的2個化合物進行舒張大鼠離體子宮平滑肌的活性篩選，發現化合物2能抑制子宮平滑肌收縮，抑制率隨濃度的增加而升高，呈現劑量相關性關系（＜0.01）。本研究成果豐富了蓬莪術揮發油中倍半萜類成分，探索了蓬莪術揮發油倍半萜成分的舒張子宮平滑肌活性，為后續尋找更豐富的活性成分以及探索相關機制奠定了基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Sesquiterpenoids from volatile oil ofand relaxant effects on uterine smooth muscle

CUI Ting1, 2, NI Hong1, 2, LIU Juan1, 2, PENG Cheng1, XIONG Liang1, 2, LIU Fei1, 2

1. State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Institute of Innovative Medicine Ingredients of Southwest Specialty Medicinal Materials, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To study the chemical components of the volatile oil ofrhizomes and their relaxant effects on uterine smooth muscle in rats.The chemical components were separated and purified by silica gel column chromatography, sephadex LH-20 column chromatography, reversed-phase medium pressure liquid chromatography, preparative thin-layer chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography. The structures of the isolated compounds were identified by a variety of modern spectroscopic techniques. The relative configuration of the new compound was determined by NOE data analysis, then its absolute configuration was characterized by ECD calculations. In addition, an oxytocin-induced contraction model of rat uterine smooth musclewas used to evaluate the relaxant effects of the compounds on uterine smooth muscle.Two sesquiterpenoids were isolated from the volatile oil of, and their structures were determined as (1,4,5,6,7,10)-1(10),4(5)-diepoxygermacran-11(12)-en-6-ol (1) and curcumanolide A (2). Compound 2 showed an inhibitory effect against oxytocin-induced rat uterine smooth muscle contraction.Compound 1 is a new germacrane-type sesquiterpenoid and named biepoxygemarenol. Compound 2 has a relaxant effect on uterine smooth muscle.

Val.; volatile oil; sesquiterpenoids; biepoxygemarenol;curcumanolide A; biological activity;relaxant effects on rat uterine smooth muscle

R284.1

A

0253 - 2670(2022)14 - 4265 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.005

2022-05-07

國家自然科學基金青年基金資助項目（81903777）；國家自然科學基金青年基金資助項目（82104371）；國家自然科學基金優秀青年基金資助項目（82022072）

崔 婷（1999—），碩士研究生，從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: 2584028137@qq.com

熊 亮（1983—），研究員，博士生導師，從事中藥藥效物質基礎及開發應用研究。E-mail: xiling0505@126.com

劉 菲（1989—），副教授，從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: feifeifly555@126.com

[責任編輯 王文倩]