液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀測(cè)定賴(lài)氨酸硫酸鹽中無(wú)機(jī)砷含量的不確定度評(píng)估

◎ 陸秀軍，王智亮，孫世杰

（1.赤峰市松山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

砷元素廣泛存在自然界中，是毒性較大的有害元素，受到人們的廣泛關(guān)注，也成為飼料安全重點(diǎn)檢測(cè)的項(xiàng)目。對(duì)砷的毒性作用機(jī)理研究表明，砷的毒害主要取決于它的化學(xué)形態(tài)，不同的化學(xué)形態(tài)呈現(xiàn)出極大的毒性差異，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，三價(jià)無(wú)機(jī)砷的毒性強(qiáng)于五價(jià)無(wú)機(jī)砷，五價(jià)無(wú)機(jī)砷強(qiáng)于有機(jī)砷，長(zhǎng)期過(guò)量攝入三價(jià)無(wú)機(jī)砷不利于身體健康。

自然界中的砷有有機(jī)砷和無(wú)機(jī)砷兩種形式，有機(jī)砷可用于抗生素促生長(zhǎng)類(lèi)飼料添加劑，對(duì)于提高畜禽的飼料利用率、增強(qiáng)抗病能力有著明顯作用，現(xiàn)代動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中被認(rèn)為和硒碘一樣，是動(dòng)物機(jī)體的一種必需元素。但無(wú)機(jī)砷卻是一種有毒有害元素，對(duì)畜禽等動(dòng)物的危害性很大，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)無(wú)機(jī)砷有嚴(yán)格的限制要求，即≤2.0 mg·kg-1[1]。因此，飼料中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)結(jié)果正確性要求是重中之重，但檢測(cè)結(jié)果不可避免會(huì)產(chǎn)生誤差。對(duì)不確定度的分析可以在實(shí)驗(yàn)測(cè)試過(guò)程中有效提高檢測(cè)質(zhì)量水平。本次實(shí)驗(yàn)使用液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀對(duì)三價(jià)無(wú)機(jī)砷含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)整個(gè)測(cè)量過(guò)程中三價(jià)無(wú)機(jī)砷的不確定度來(lái)源進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

磷酸二氫銨（NH4H2PO4）、硼氫化鉀（KBH4）、氫氧化鉀（KOH）、硝酸（HNO3）、鹽酸（HCI）和氨水（NH3·H2O），以上試劑除了有特殊要求外均使用優(yōu)級(jí)純。三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)品（純度為≥99.5%）。C18色譜柱、北京寶德BSA-100A/B/C液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)原理

試樣經(jīng)稀硝酸酸化提取，在液相條件下進(jìn)行分離，用分離后所獲得的物質(zhì)在酸性條件下再與硼氫化鉀（KBH4）反應(yīng)生成氣態(tài)氫化物，用高純氬氣作為載氣，進(jìn)入原子熒光光譜儀原子化器進(jìn)行檢測(cè)，采用外標(biāo)法定量[2]。

1.2.2 試驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g（精確至0.001 g）賴(lài)氨酸硫酸鹽試樣，置于50 mL聚四氟乙烯塑料離心管中，加20 mL硝酸溶液（0.15 mol·L-1），浸泡過(guò)夜。置于90 ℃恒溫箱中，熱浸提2.5 h，每隔30 min取出振搖1 min。提取完畢后，取出冷卻至室溫，置于8 000 r·min-1離心機(jī)中離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣測(cè)定。按同一方法做空白實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)學(xué)模型

采用外標(biāo)法定量計(jì)算無(wú)機(jī)砷的含量，計(jì)算公式為：

式中：X為無(wú)機(jī)砷含量，mg·kg-1；CAs3+為測(cè)定液中扣除空白后無(wú)機(jī)砷的濃度，mg·L-1；V為試樣消解后定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g。

2 三價(jià)砷引入不確定度分析

2.1 試樣制備過(guò)程中引入的不確定度

（1）稱(chēng)重所用天平（0.001 g）的擴(kuò)展不確定度為0.002 g，取包含因子k=2，則天平所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[3]：

（2）容量允差。查《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[4]，25 mL(A級(jí))的容量瓶在20 ℃時(shí)，容量允差為±0.030 mL，取均勻分布，則所帶來(lái)的不確定度為[6]：

（3）試樣制備過(guò)程中引入的合成不確定度為：

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度

所購(gòu)買(mǎi)三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99.5%。純度為0.5%的分散，其半寬為0.25%，三價(jià)無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

三價(jià)無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋步驟。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 mg·L-1）于100 mL容量瓶（A級(jí)）中，用純水定容至刻度[6]。此標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為1 mg·L-1。取7支10 mL容量瓶，準(zhǔn)確加入0 mL、0.50 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.50 mL和1.00 mL，用純水稀釋?zhuān)朔椒?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度依次為 0 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1。

（2）移液器引入的不確定度。查《可調(diào)移液器試行檢定規(guī)則》（JJG 646—2006）[5]，所用100 μL移液器在使用100 μL量程時(shí)，容量允差為±2.0%（容量允差包含體積校準(zhǔn)、滿(mǎn)載液體至移液器刻度的變動(dòng)性、操作員讀數(shù)）則100 μL移液器引入的不確定度為：

所用1 000 μL移液器在使用1 000 μL量程時(shí)，容量允許差為±1.5%（容量允差包含體積校準(zhǔn)、滿(mǎn)載液體至移液器刻度的變動(dòng)性、操作員讀數(shù)），則1 000 μL移液器引入的不確定度為：

（3）容量瓶體積的不確定度。查《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[4]，10 mL容量瓶（A級(jí)）在20 ℃時(shí)，允差為±0.020 mL，取均勻分布，則不確定度為[6]：

（4）純水在實(shí)驗(yàn)室溫度變化（20～25 ℃）時(shí)的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，溫度相差3 ℃，k=1.960。溫度引入的相對(duì)不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(std)

三價(jià)無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對(duì)不確定度為：

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度

準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣5份，同時(shí)進(jìn)行試樣處理，在相同儀器條件下測(cè)定三價(jià)砷濃度，試樣數(shù)據(jù)和結(jié)果，見(jiàn)表1[7]。

表1 試樣數(shù)據(jù)表

三價(jià)砷單次測(cè)量的不確定度為：

5次測(cè)定三價(jià)砷含量平均值的相對(duì)不確定度為：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

使用5個(gè)濃度點(diǎn)的三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液數(shù)據(jù)x和相應(yīng)的峰面積強(qiáng)度值y，進(jìn)行一次方程擬合，擬合得到校正標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=54 535x-52 764，則a=52 764，b=54 535，R2=0.992。共5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度值，重復(fù)測(cè)2次，則P=10，則C的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則三價(jià)砷的不確定度為：

3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

三價(jià)無(wú)機(jī)砷的合成不確定度：

4 擴(kuò)展不確定度

試樣中三價(jià)無(wú)機(jī)砷含量的擴(kuò)展不確定度，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定為U=2×u(x)=2×0.000 730=0.001 46 mg·g-1。

5 結(jié)論

通過(guò)不確定度分量的評(píng)估可以得出結(jié)論，對(duì)合成相對(duì)不確定度貢獻(xiàn)最大的分量為試樣制備過(guò)程及校準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分量。試樣制備過(guò)程和校準(zhǔn)曲線的配制及擬合對(duì)于每一位檢測(cè)技術(shù)人員的操作水平有很高的要求，因此實(shí)驗(yàn)人員的操作手法和熟練程度能夠顯著降低試驗(yàn)過(guò)程中帶來(lái)的不確定度。