西藏新鮮牦牛肉風干過程中微生物種類 及數量變化動態研究

◎ 朱艷妮，布 窮，張志德，馬紅梅

（西藏大學 理學院，西藏 拉薩 850000）

風干牦牛肉是藏族人民重要的日常食物之一，是以生鮮牦牛肉為原料在低溫陰涼通風處陰干或凍干制成的，其傳統的制作方法是把牦牛肉切割成條狀，一條一條掛在陰涼處，讓其自然風干。由于其風味獨特，貯存期長，是一種備受消費者青睞的傳統肉制品。牛肉經冷凍風干過程加工后，水分含量低、體積小、質量輕，保持了牛肉原有營養價值和固有風味[1]。通過定期測定風干過程中牦牛肉自身的pH值，得出上述理化因子的變化和牦牛肉在風干過程中微生物的種類和數量的變化之間是否存在相關性，以期通過控制理化因子的變化來抑制微生物的生長繁殖，避免牦牛肉在風干過程中由微生物引起的腐敗變質問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 kg市售西藏生鮮牦牛肉，市售；PCA（Plate Count Agar）培養基、PCA+（改進型PCA）培養基、MRS（De Man，Rogosa，Sharpe Agar）培養基、MRS+（改進型MRS）培養基和VJ（Vogel Johnson Agar）培養基，西藏建成生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

ESCO超凈工作臺（上海博迅實業有限公司）、DK-8D恒溫水浴鍋（上海佑科儀器儀表有限公司）、JA3003N電子天平、Memert IPP110恒溫培養箱、ZEALWAY高壓滅菌鍋、Panasonic MPR-210醫用冷藏箱、INFORS Multition Standard搖床（無錫市華科儀器儀表有限公司）、Alalis PC320酸度計、Sartorius G-16C高速冷凍離心機、VELP ZX4型振蕩器（鄭州生元儀器有限公司）、DHG-2200B電熱鼓風干燥箱、ESCO S-4S1生物安全柜、Panasonic MDF-682醫用低溫箱、Panasonic MDF-339醫用低溫箱、Biometra P25 T電泳儀、Biometra TADVANCED 846-x-070-280 PCR儀及Analytik jena M-26XV凝膠成像系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計

實驗分別于鮮肉、風干2 d、風干5 d、風干7 d、風干10 d、風干15 d和風干20 d取樣，每次取3個重復。分別檢測樣品菌落總數、微球菌、乳酸菌、乳酸桿菌及葡萄球菌數量的變化，鑒定實驗風干過程的優勢菌種，并測定其pH值、溫度。

1.3.2 風干牦牛肉的制備

購入5 kg市售西藏生鮮牦牛肉，將其切割成一條條的肉條，懸掛在繩子上，進行風干，置于拉薩室內自然環境下，避光通風風干。

1.3.3 微生物指標的測定

采用稀釋平板法測定微生物數量，在無菌條件下稱取25.0 g樣品，加入225 mL 0.9%無菌生理鹽水，充分進行攪拌，使其充分混勻。取1 mL上清液于含有9 mL 0.9%無菌生理鹽水的試管中，進行加倍遞增稀釋，分別稀釋至10-3、10-4、10-5，每個稀度做3個平行，用培養基培養[2]。不同的菌群分別采用不同的選擇性培養基進行分離和計數。

菌落總數的測定：用PCA培養基在30 ℃培養48 h測定細菌總數；微球菌數的測定：用PCA+（改進型PCA）培養基在30 ℃培養48 h測定微球菌；乳酸菌數的測定：用MRS（De Man Rogosa Sharpe Agar）培養基在30 ℃培養48 h測定乳酸菌；乳桿菌數的測定：用MRS+（改進型MRS）培養基在30 ℃培養48 h測定乳桿菌；葡萄球菌數的測定：用VJ培養基（Vogel Johnson Agar）在30 ℃培養48 h測定葡萄球菌[3]。

1.3.4 理化指標的測定

取風干過程的牦牛肉，分別于鮮肉、風干2 d、風干5 d、風干7 d、風干10 d、風干15 d和風干20 d進行取樣，每次取3個重復。將牦牛肉干切碎置于燒杯中，用穿刺型pH計測定樣品的pH值，記錄，結果取3次測定的pH平均值。

1.4 數據處理

每個樣品進行3次重復試驗，并使用SPSS 26軟件進行t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，然后使用Origin軟件繪圖。

1.5 優勢種鑒定

1.5.1 取樣并純化

實驗分別從鮮肉、風干2 d、風干5 d、風干7 d、風干10 d、風干15 d和風干20 d中取樣，每次取3個重復，將上述制成的稀釋液接種于PCA+培養基、MRS培養基、MRS+培養基、VJ培養基，在各培養基中分別取數目最多、重復最高的菌落數純化，得到純化的單菌株。

1.5.2 16S rDNA鑒定細菌

（1）DNA的提取。將菌體放入離心管中，加入50 μL的DNA提取液，10 μL的二氧化硅晶體，放入離心機中，離心（4 ℃，10 000 r·min-1，5 min），取上層清液于管中，放入4 ℃冰箱里保存30 min后取出，在65 ℃水浴鍋里水浴1 h，然后置于-20 ℃冰箱里保藏。

（2）PCR擴增（16S rRNA序列的擴增）。16S rRNA基因的擴增使用細菌通用引物27F和1459R。16S rRNA基因正向引物27F核酸序列（5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物1495R核酸序列（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。PCR 體系 50 μL 內 含 模 板 DNA（100 ng·μL-1）2.0 μL、27F（20 pmoL·μL-1）2.0 μL、1495R（20 pmoL·μL-1）2.0 μL、Premix-Taq酶25 μL和超純水25 μL；擴增條件：94 ℃下模板變性5 min，隨后94 ℃下變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環結束后4 ℃保存。PCR結束后，DNA在1%（W/V）瓊脂糖凝膠（Promega）中電泳。

（3）在凝膠成像儀上觀察。電泳結束后用100 mg·mL-1溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）溶液浸泡凝膠10 min，回收溴化乙錠溶液，用蒸餾水沖洗凝膠后在紫外光（凝膠成像儀）下觀察，PCR產物為1 500 bp的條帶。

（4）送檢。將樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定。

2 結果與分析

2.1 新鮮牦牛肉風干過程中的微生物指標變化

2.1.1 新鮮牦牛肉風干過程中細菌總數的變化

由圖1可知，牦牛肉風干過程中細菌總數均呈現升高趨勢，但菌落總數均沒有超過30 000 CFU·g-1，符合熟肉制品衛生標準[4]。在鮮肉到風干5 d之間均沒有顯著性差異，在風干5 d與風干7 d之間存在顯著性差異，在風干7 d與風干10 d之間存在顯著性差異，而風干10 d到風干20 d之間不存在顯著性差異。

圖1 新鮮牦牛肉風干過程中細菌總數變化圖

2.1.2 新鮮牦牛肉風干過程中微球菌數的變化

由圖2可知，牦牛肉風干過程中微球菌數呈現先下降后升高的趨勢。實驗初期，微球菌為優勢菌種，數量較多，但隨新鮮牦牛肉的風干，微球菌數量下降，但下降不顯著。隨pH值上升，乳酸菌和乳酸桿菌對其抑制作用減弱，微球菌數量上升。

圖2 新鮮牦牛肉風干過程中微球菌數變化圖

2.1.3 新鮮牦牛肉風干過程中乳酸菌數的變化

由圖3可知，牦牛肉風干過程中乳酸菌數基本上呈升高趨勢。在整個風干過程中，乳酸菌一直是優勢菌，能產生細菌素，抑制有害微生物的生長，顯著提高產品的安全性[5]。在鮮肉與風干5 d無顯著性差異，而在鮮肉到風干2 d有顯著性差異，風干2 d到風干5 d有顯著性差異。

圖3 新鮮牦牛肉風干過程中乳酸菌數變化圖

2.1.4 新鮮牦牛肉風干過程中乳酸桿菌數的變化

由圖4可知，牦牛肉風干過程中乳酸桿菌數均呈升高趨勢。在整個風干過程中，乳酸桿菌一直是優勢菌，可以抑制各種腐敗和致病細菌增長。鮮肉到風干5 d無顯著性差異，風干5 d到風干7 d有顯著性差異，風干7 d到風干10 d有顯著性差異，風干10 d到風干15 d有顯著差異，而風干15 d到風干20 d無顯著性差異。

圖4 新鮮牦牛肉風干過程中乳酸桿菌數變化圖

2.1.5 新鮮牦牛肉風干過程中葡萄球菌數的變化

由圖5可知，牦牛肉風干過程中葡萄球菌數基本呈上升趨勢。隨著風干的進行，葡萄球菌數量因乳酸菌產酸的影響有所下降，之后由于水分含量的降低，乳酸菌數量減少，葡萄球菌耐受性增加，導致葡萄球菌數量回升[6]。

圖5 新鮮牦牛肉風干過程中葡萄球菌數變化圖

2.2 新鮮牦牛肉風干過程中的pH變化

由圖6可知，pH值在7 d前呈上升趨勢，在7 d和15 d之間呈下降趨勢，但總體來說pH值是呈上升趨勢的，家畜剛被宰殺時的肉處于等電點，其pH值為5.3～5.5[7]。pH值從實驗初始5.355升至實驗中段6.055，然后降至實驗后期5.935，最后上升至6.205。在肉制品的生產過程中，提高肉制品pH值，可以增加肉制品的系水性[8]。由此可知，實驗pH值升高，可能與肉制品系水性提高相關。實驗后期，乳酸菌、微球菌占據微生物菌群的主導地位，乳酸菌產酸，使肉制品的pH下降；微球菌也可以降低pH，控制病原微生物和腐敗微生物的生長[9]。

圖6 新鮮牦牛肉風干過程中pH值變化圖

2.3 優勢菌種鑒定結果

在實驗初期的優勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）、魏森特普山假單胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、乳酸乳球菌亞種（Lactococcus lactis subsp.lactis）、馬葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、短波單胞菌屬（Brevundimonassp.）；在實驗中期的優勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、魏森特普山假單胞菌（Pseudomonas weihenstephanensis）、多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）；在實驗后期與末期的優勢種為清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）、彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）、琥珀酸葡萄球菌亞種（Staphylococcus succinussubsp.succinus）。

3 結論

新鮮牦牛肉風干過程中細菌總數均沒有超過國家標準，可以安全食用。細菌總數及微球菌、乳酸菌、乳桿菌、葡萄球菌呈上升趨勢，細菌總數及乳酸菌、乳桿菌數目較高。優勢細菌以乳酸菌、乳桿菌為主，其次為假單胞桿菌、葡萄球菌，以及少量的鞘氨醇桿菌、單胞菌屬。

（2）新鮮牦牛肉風干過程中pH變化基本上呈上升趨勢，pH為5.35～6.23，其pH值波動或與乳酸菌、微球菌使牦牛肉pH值下降，與肉制品系水性提高使pH升高有關。

（3）清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）的代謝產物如細菌素和肽聚糖可以抑制致病或腐敗細菌。在整個實驗期間，為優勢種。清酒廣泛乳桿菌（Latilactobacillus sakei）對牦牛肉風干過程中腐敗微生物起抑制作用。彎曲乳酸桿菌（Latilactobacillus curvatus）可以在牦牛肉風干過程的初期與后期起到抑制各種腐敗菌和致病菌增長的作用。這兩種菌或在牦牛肉風干過程中有效抑制了致病菌及腐敗菌的增殖，為保持牦牛肉風干過程中的安全性及可食用性提供了切實的保障。