基于NF-κB信號通路篩選產抗炎活性次級代謝產物的紅樹林真菌

田銀 林芳 吳黃銘 李珊珊 湯熙翔,*

(1 福州大學先進制造學院，晉江 362200；2 自然資源部第三海洋研究所，廈門 361005；3 廈門市海滄醫院，廈門 361026)

炎癥是機體受到有害理化或生物刺激時發生的非特異性免疫反應，是先天性免疫系統的防御措施之一[1-2]。正常情況下，炎癥是機體應對有害刺激的保護性生理反應，可抵御感染、修復受損組織以及恢復體內穩態，對機體是有利的。但是，過度的炎癥反應會損傷機體，引發疾病，比如組織壞死、炎性休克、纖維化等[3]。

核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是一種二聚體轉錄因子，由諾貝爾獎獲得者David Baltimore和合作者[4]最早在B淋巴細胞中發現，后證明其在幾乎所有細胞類型中均存在，參與細胞的增殖、分化、存活，是免疫發育、免疫應答以及炎癥反應的關鍵調節因子[5]。NF-κB信號通路可由經典通路與非經典通路介導活化。經典通路轉導短暫快速的轉錄活性，主要負責調節促炎基因的表達，介導炎癥反應。非經典通路的激活通過少數TNF受體發生，過程緩慢、持久，主要參與免疫細胞的發育[6]。最常見的NF-κB二聚體由NF-κB1(p50)和RelA(p65)組成。在大多數處于正常生長狀態的細胞中，NF-κB二聚體與IκB蛋白結合，處于靜息狀態。IκB蛋白是一種NF-κB抑制劑，可與NF-κB形成復合物后定位于細胞質，阻止NF-κB進入細胞核。經典NF-κB信號通路的IκB蛋白包括IκBα、IκBβ和IκBε,NF-κB的活化主要依賴于IκBα蛋白的降解。當細胞受到相關刺激時，NF-κB信號通路被激活，IκB激酶(IKK)復合物催化IκBα的磷酸化以及泛素化，隨后其被26S蛋白酶體降解，失去與NF-κB結合的能力，NF-κB被釋放，發生核易位，進入細胞核，與靶基因特定序列結合，激活靶基因的轉錄[7-8]。過度活化的NF-κB信號通路在癌癥與慢性炎癥等疾病中發揮關鍵作用，因此，藥物靶向抑制NF-κB信號通路是疾病治療的常用手段[9]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，可與細胞膜上的Toll樣受體(toll-like receptor 4，TLR4)結合，活化經典NF-κB信號通路，促進IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥細胞因子的釋放，常用作NF-κB的激活劑[10-11]。

雙熒光素酶報告基因系統是以熒光素為底物檢測熒光素酶活性的一種報告系統，螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase)作為主報告基因，海腎熒光素酶(renilla luciferase)作為內參，通過熒光素酶與底物反應產生的熒光信號檢測基因表達，具有簡便、高效、靈敏、快速以及穩定等特點，常用于轉錄因子活性調控研究[12-13]。Leung等[14]向人肝癌細胞HepG2中導入報告基因質粒pBIIX-luc(包含兩個連續重復NF-κB結合位點)和pRL-TK，利用該模型從冬凌草中檢測到四種可有效抑制NF-κB轉錄活性的二萜類化合物；潘梓燁等[15]將NF-κB熒光素酶報告基因質粒PGL4.32和內參質粒 Prl-TK瞬時共轉染HEk293細胞，利用該雙熒光素酶報告基因系統從桑菊飲中篩選出16種具有NF-κB抑制活性的成分。

紅樹林生長在熱帶和亞熱帶地區海岸與河口的潮間帶，棲息其中的生物種類非常豐富。藻類、真菌、放線菌以及細菌是紅樹林生態系統中的主要微生物類群[16-17]，其中真菌是紅樹林這一特殊生態環境微生物中最突出的物種之一，已有研究表明，紅樹林真菌是海洋真菌的第二大類群，其次級代謝產物化學結構獨特，生物活性廣泛，是藥物先導化合物的寶庫[18-19]。福建漳江口紅樹林位于云霄縣漳江入海口，是福建省最重要的紅樹林國家級自然保護區[20]。本課題組于2016年從福建漳江口紅樹林沉積物中分離出135株真菌，本研究選取了其中102株真菌發酵得到的135份粗提物樣品進行抗炎活性篩選。采用雙熒光素酶報告基因分析方法(圖1)，將pNFκBluc(包含多個NF-κB結合位點)和pRL-SV40-C報告基因質粒共轉染小鼠巨噬細胞Raw264.7，以脂多糖(LPS)刺激該細胞建立體外炎癥模型，構建了基于NF-κB信號通路的雙熒光素酶報告基因篩選體系，以此對102株紅樹林沉積物來源真菌發酵得到的135份粗提物樣品進行抗炎活性篩選，最后獲得5株產潛在抗炎活性次級代謝產物的菌株，為后續發現潛在海洋抗炎先導化合物奠定了基礎。

圖1 雙熒光素酶報告系統示意圖Fig.1 Schematic diagram of a dual-luciferase reporting system

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小鼠單核巨噬細胞Raw264.7由本室保存；DMEM高糖培養基，Biosharp公司；ABW優級胎牛血清，廣州威佳科技有限公司；Genopure Plasmid Maxi kit質粒大量抽提試劑盒，Sigma-Aldrich公司；白色不透光96孔板、一次性雙頭細胞鏟，上海臥宏生物科技有限公司；細胞培養皿、透明96孔細胞培養板，ThermoFisher Scientific公司；脂多糖LPS、Lipo8000TM轉染試劑、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、pNFκB-luc報告基因質粒、pRL-SV40-C報告基因質粒和NF-κB抑制劑BAY 11-7082均購自碧云天生物技術有限公司；六孔細胞培養板，CoStar公司；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，Bioword technology公司；二甲基亞砜(DMSO)，BioFroxx公司；PBS緩沖液為自配；大腸埃希菌DH5α菌株由本室保存。

1.2 主要儀器設備

TE2000顯微鏡(日本Nikon公司)；SCA-165DS二氧化碳培養箱、Heraeus Megafuge 8R高速冷凍離心機、Varioskan LUX多功能酶標儀、NanoDrop 1000超微量分光光度計(美國ThermoFisher Scientific公司)；Tanon 1600凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；SLI-220恒溫培養箱(上海愛朗儀器有限公司)；DK-8AXX電熱恒溫水槽(上海恒科學儀器有限公司)；SW-CJ1FD型單人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；Countstar全自動IC1000細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

取出液氮凍存Raw264.7細胞，置于37℃恒溫水浴鍋中均勻晃動使其快速解凍，離心，棄去上清。用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 μg/mL和鏈霉素100 μg/mL)的高糖DMEM培養基重懸細胞，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每兩天換一次培養基，取對數生長期細胞進行實驗。待細胞完全貼壁且生長至80%～90%時，傳代，傳代時用一次性細胞鏟將細胞輕輕刮下后，用移液槍反復吹吸成單細胞懸液，按1:3將細胞懸液等量接種到3個新的細胞培養皿內，補加培養基至終體積為10 mL，繼續培養。

1.3.2 質粒抽提

用移液槍吸取0.5 μL質粒加入裝有50 μL大腸埃希菌DH5α菌液的EP管中，輕彈混勻，冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴2 min，加入500 μL LB液體培養基，于37℃搖床振蕩培養45 min復蘇。取100 μL復蘇后的菌液涂布到帶氨芐抗性的LB平板，37℃恒溫培養箱過夜培養，挑單菌落接種到裝有5 mL LB培養基的試管中(含終濃度100 μg/mL氨芐西林)，37℃搖床振蕩培養過夜；取2 mL菌液轉接到裝有200 mL LB培養基(含終濃度100 μg/mL氨芐西林)的錐形瓶中，37℃搖床振蕩培養過夜，按照Genopure Plasmid Maxi kit質粒大量抽提試劑盒說明書進行質粒抽提。抽提的質粒用雙蒸水溶解，取1 μL用紫外分光光度計測定濃度，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余分裝，-20℃保存備用。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因質粒瞬時共轉染Raw264.7細胞

取對數生長期Raw264.7細胞，按細胞數1×106/孔接種至六孔細胞培養板，待貼壁密度達到80%～90%進行質粒轉染。取一潔凈無菌EP管，依次加入125 μL無血清高糖DMEM培養基、1 μg pNFκB-luc報告基因質粒、2 μg pRL-SV40-C報告基因質粒和4 μL Lipo8000TM轉染試劑，用移液槍輕柔混勻，室溫放置10 min后，緩慢滴入細胞培養板，置于37℃，5% CO2培養箱繼續培養24 h。用移液槍吸取20 μL導入報告基因質粒的Raw264.7細胞懸液，自動細胞計數儀計數，按細胞數1×104/孔接種到白色不透光96孔板，每孔100 μL，同時接種3孔未導入質粒細胞作空白，37℃，5% CO2培養箱孵育12 h至細胞完全貼壁。

1.3.4 建立炎癥細胞模型

實驗設置空白組(未導入質粒)、對照組(導入質粒)和模型組(導入質粒+LPS)。模型組加入10 μL終濃度為1 μg/mL的LPS，空白組與對照組補加10 μL培養基，每組做3孔重復，培養6 h。取出96孔板，用移液槍吸去上清，PBS清洗兩遍，每孔均勻加入100 μL報告基因細胞裂解液，室溫放置20 min。溶解熒光素酶檢測試劑，多功能酶標儀檢測發光信號，檢測時間設置為10 s，間隔2 s，具體按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作。以相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)反應NF-κB信號通路活化程度。

1.3.5 真菌發酵粗提物抗炎活性篩選

粗提物樣品終濃度設置為100、50和25 μg/mL，初步篩選采用100 μg/mL終濃度，有細胞毒作用的樣品復篩驗證時進行濃度調整。實驗設置模型組(LPS組)、陽性對照組和粗提物組。粗提物組加入10 μL終濃度為100 μg/mL的真菌發酵粗提物樣品，每個樣品設置一個孔；陽性對照組加入10 μL終濃度為5 μmol/L的NF-κB抑制劑BAY11-7082[21]，做3孔重復；模型組補加10 μL培養基，做3孔重復。培養2 h后，各組加入10 μL終濃度為1 μg/mL的LPS，繼續培養6 h。檢測熒光素酶活性，分析粗提物對LPS刺激的NF-κB信號通路的影響，相對熒光素酶活性與LPS組相比較下降明顯的(50%及以上)定義為初篩陽性。初篩為陽性的粗提物，每個樣品做3個復孔，重復上述步驟。

1.3.6 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期Raw264.7細胞，按細胞數1×104/孔均勻接種到透明96孔板，每孔100 μL。37℃，5%CO2培養箱孵育12 h至細胞完全貼壁。用篩選獲得陽性粗提物預處理細胞，作用濃度與抗炎實驗一致，每個樣品做6孔重復，培養2 h后每孔加入10 μL LPS(1 μg/mL)，繼續培養6 h。每孔均勻加入10 μL CCK-8檢測試劑，培養2 h，酶標儀測定450 nm處吸光度(A)，計算細胞活力。

1.3.7 粗提物對LPS刺激的Raw264.7細胞分化作用

將對數生長期Raw264.7按細胞數1×103/孔接種到透明96孔板，培養12 h至細胞完全貼壁。分別設置對照組(正常生長的Raw264.7細胞)、炎癥模型組(LPS)和粗提物組，每組設置3個復孔。粗提物組用抗炎實驗獲得的陽性樣品預先作用2 h(作用濃度與抗炎實驗一致)，隨后炎癥模型組與粗提物組加入10 μL LPS(1μg/mL)，對照組補加10 μL培養基，繼續培養12 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.3.8 統計學分析

采用GraphPad Prism9.0軟件進行統計學分析，實驗結果以均值±標準差()表示。組間數據采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間方差不齊采用非參數檢驗法(Kruskal-Wallis法)，P＜0.05表示實驗結果具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS刺激活化NF-κB信號通路

如圖2所示，與對照組相比，1 μg/mL的LPS刺激顯著增加了熒光素酶表達水平，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明NF-κB轉錄活性上升，炎癥模型造模成功。

圖2 1 μg/mL LPS刺激Raw264.7細胞建立炎癥模型Fig.2 Stimulated Raw264.7 cells with 1 μg/mL LPS to establish inflammatory model

2.2 真菌發酵粗提物抗炎活性篩選結果

一共對135份紅樹林沉積物來源真菌的發酵粗提物樣品進行了抗炎活性篩選。對初篩為陽性的樣品進行三孔重復實驗，排除了假陽性的結果后，獲得8個可顯著下調相對熒光素酶活性的粗提物。如圖3A所示，與LPS組相比，陽性對照組(BAY11-7082)以及100 μg/mL粗提物H1458、H515、H386、E17-5、H788、T2-3'干、T2-3'油和XT20-8干預顯著下調了相對熒光素酶活性(relative luciferase activity)，差異有統計學意義(P＜0.05)。此外，海腎熒光素酶(renilla luciferase)作為內參，可消除轉染效率、裂解效率和細胞數量等因素對實驗結果的影響，在本實驗中，主要用于評價粗提物的細胞毒性，以排除因細胞死亡導致的熒光素酶活性差異。因此，本研究在用螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值(relative luciferase activity)反映NF-κB活化程度的同時，還單獨對海腎熒光素酶活性進行了比較分析。如圖3B所示，與LPS組相比，E17-5、H788、T2-3'干以及XT20-8的海腎熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)，提示其在100 μg/mL時存在一定細胞毒性；H1458、H515、H386和T2-3'油的海腎熒光素酶活性與LPS組比較無顯著性差異(P＞0.05)。對幾個具有細胞毒性的粗提物進行濃度調整，用DMSO稀釋(DMSO終濃度不超過0.1%)，從100 μg/mL調整至50 μg/mL與25 μg/mL。如圖4A、B所示，E17-5、H788、T2-3'干和XT20-8濃度降至50 μg/mL時，相對熒光素酶活性依然顯著低于LPS組(P＜0.05)，25 μg/mL時差異無統計學意義(P＞0.05)。除E17-5在50 μg/mL時的海腎熒光素酶活性顯著低于LPS組之外(P＜0.05)，其余組別與LPS組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

圖3 100 μg/mL粗提物對LPS刺激的Raw264.7細胞NF-κB活化的影響Fig.3 Effect of 100 μg/mL crude extracts on LPS-stimulated NF-κB activation in Raw264.7 cells

圖4 50和25 μg/mL粗提物對LPS刺激的Raw264.7細胞NF-κB活化的影響Fig.4 Effect of 50 μg/mL and 25 μg/mL crude extracts on LPS-stimulated NF-κB activation in Raw264.7 cells

綜上，雙熒光素酶實驗結果表明，粗提物H1458、H515、H386、H788、T2-3'干、T2-3'油和XT20-8可下調相對熒光素酶活性，提示其能夠抑制LPS誘導的Raw264.7細胞NF-κB信號通路活化。而E17-5存在一定的細胞毒性，其相對熒光素酶活性的下調應該是由于部分細胞死亡導致。

2.3 粗提物對Raw264.7細胞活力的影響

CCK-8法檢測結果顯示(圖5)，50 μg/mL的E17-5與100 μg/mL的H386顯著抑制了Raw264.7細胞增殖活力(P＜0.05)，體現出一定的細胞毒性。其余粗提物對細胞活力無顯著影響，差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖5 粗提物對Raw264.7細胞活力的影響Fig.5 Effect of crude extracts on Raw264.7 cells viability

2.4 Raw264.7細胞形態

正常生長的Raw264.7細胞為圓形或橢圓形，少數有偽足；當細胞受到LPS刺激時，包括NF-κB在內的多種信號通路持續活化，炎癥反應發生，細胞啟動吞噬效應，吞噬抗原，變為梭形，偽足增多且變得肥大。與炎癥模型組(LPS組)相比，粗提物與LPS共同作用后，大部分細胞仍保持圓形或橢圓形態，分化細胞變少(圖6)。

圖6 粗提物對LPS刺激的Raw264.7細胞形態的影響(×400)Fig.6 Effect of crude extracts on LPS-stimulated Raw264.7 cells morphology(×400)

3 結論與討論

海洋真菌次級代謝產物具有抗炎、抗菌以及酶抑制等諸多生物學活性，是藥物先導化合物的重要來源，在新藥開發方面潛力巨大[22]。有關紅樹林真菌次級代謝產物在抗炎領域的研發已有廣泛報道。Lin等[23]從中國南海岸紅樹林真菌Xylariasp.中分離出天然化合物xyloketal B，Pan等[24]發現xyloketal B可抑制NF-κB、Toll樣受體(TLR4)以及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表達水平，同時還能下調IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的mRNA水平，具有顯著的抗炎活性；Jia等[25]首次報道了紅樹林真菌Pseudofusicoccumsp.J003產生的類固醇衍生物具有抗炎作用，可顯著抑制LPS誘導的Raw264.7細胞一氧化氮(NO)的產生，25 μmol/L時的抑制率高達72.89%；Chi等[26]對分離自爵床科紅樹林植物的28株具有抗菌活性的內生真菌進行了抗炎活性測試，大部分內生真菌粗提取物可抑制iNOS活性，排除具有細胞毒的粗提取物后，確定3株內生真菌粗提取物具有高iNOS抑制率以及低細胞毒活性；Ding等[27]報道了紅樹林真菌Penicilliumsp.DM815來源的2個化合物sorbicillinoid(5)和sorbicillinoid(9)具有抗炎活性，它們以劑量依賴性方式降低了LPS誘導的iNOS表達和NO的產生；Ukwatta等[28]報道了分離自紅樹林內生真菌Aspergillus terreus的化合物Cowabenzophenone A可抑制炎癥細胞因子IL-6的產生；Zhou等[29]報道了紅樹林內生真菌Aspergillussp.GXNU-MA1產生的5種倍半萜類化合物均可抑制LPS刺激的Raw264.7細胞產生一氧化氮(NO)，其半抑制濃度為16.15～27.08 μmol/L，且無細胞毒性。

本課題組前期已成功從福建漳江口紅樹林沉積物來源真菌的發酵粗提物中分離鑒定出具有降血糖、抗流感以及抗茶葉致病真菌活性的化合物[30-34]。本研究以核因子NF-κB信號通路作為藥物篩選的靶點，LPS誘導Raw264.7細胞構建體外炎癥模型，采用雙熒光素酶報告基因構建的系統，對福建漳江口紅樹林沉積物來源的102株真菌的135份發酵粗提物樣品進行了抗炎活性篩選，初步獲得了8個可下調相對熒光素酶活性的粗提物樣品，綜合海腎熒光素酶活性與CCK-8測試結果，去除了2個具有細胞毒性的粗提物，最后確定了6個可明顯抑制NF-κB信號通路且無細胞毒性的陽性粗提物，它們的樣品編號分別為H788、H1458、H515、XT20-8、T2-3'干和T2-3'油，其中T2-3'干和T2-3'油均來自菌株T2-3'。這5株具有抗炎活性的真菌分布于4個屬：H515與H788為青霉屬(Penicilliumsp.); XT20-8為曲霉屬(Aspergillussp.); H1458為Phialemoniopsissp.; T2-3'為木霉屬(Trichodermasp.)。這些菌株的獲得，為我們后續開展深入的化學研究，研發潛在海洋抗炎藥物奠定了基礎。