常壓室溫等離子體-紫外復合誘變選育新硫肽類抗生素166A高產菌株

李艷青 戴劍漉 蔣忠科 羅輝 孫承航,*

(1 廣東醫科大學，南方海洋科學與工程廣東省實驗室，湛江 524023；2 中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫藥生物技術研究所，微生物化學研究室，北京 100050；3 中國醫學科學院&北京協和醫學院 醫藥生物技術研究所，國家衛健委抗生素生物工程重點實驗室，北京 100050)

硫肽類抗生素是由微生物產生的結構復雜且含多個噻唑環的多肽類次級代謝產物。1948年發現第一個硫肽類抗生素，微球菌素(micrococcin)開始[1]，迄今已報道了上百種該類抗生素[2]。硫肽類抗生素對革蘭陽性菌，尤其是對多種抗生素耐藥的革蘭陽性菌具有很強的抗菌活性。但由于這類抗生素普遍水溶性差、生物利用度低，僅作為動物腸道的抗菌藥物，如曾經作為動物飼料添加劑的硫鏈絲菌素和那西肽，無法在臨床使用[2-3]。目前臨床抗生素耐藥嚴重，亟需抗耐藥新抗生素，如何解決水溶性差的難題，將硫肽類抗生素應用于臨床，一直是學術界和制藥工業界廣泛關注的問題。近年來，通過化學結構修飾，已有一些硫肽類抗生素的衍生物進入了臨床研究階段，如GE2270A類似物LFF571作為治療由艱難梭菌(Clostridioides difficile)引起的腸道感染藥物，完成了臨床Ⅱ期試驗[4-5]。另一個GE2270A衍生物NAI003對痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)有窄譜抗菌活性，作為治療痤瘡新藥也已完成臨床I期研究[6]。

166A是化合物玄奘米星的代號，該化合物是由塔克拉瑪干沙漠分離到的小單孢菌TMD166產生的新硫肽類抗生素，具有我國自主知識產權[7]，是目前所有已報道硫肽類抗生素分子中分子量最大的成員。硫肽類抗生素絕大多數成員沒有或僅有3個及以下糖單元，而166A具有罕見的4個糖單元，天然的多糖基取代使其在改善水溶性方面具有先天的結構優勢，體內外抗菌活性研究表明，它對革蘭陽性菌如葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等均有極強抑制活性，體外抗耐萬古霉素腸球菌最低抑菌濃度(MIC)在0.125～0.5 μg/mL之間，體內2～4 mg/kg靜脈注射即能對感染耐萬古霉素腸球菌的小鼠有100%的保護作用，且體外對結核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)也顯示出中等強度的抑制活性。因此，作為新抗感染藥源分子，具有良好開發前景。為后續實驗工作的需要，本研究對其產生菌TMD166進行了高產菌株選育。

紫外誘變(UV)是微生物育種中常用和有效的誘變方法之一[8-9]，由于小單孢菌細胞壁結構特殊、誘變效果欠佳且生長較緩慢[10]，僅通過UV誘變獲得166A高產菌株有一定難度，而且在育種過程中，反復使用單一誘變源往往會降低突變率，產生抗性飽和和突變譜窄的現象[11]。因此，選用新誘變因子并采取多種方式可能是提高誘變效果和產量的有效途徑。常壓室溫等離子體(ARTP)技術是近年來發展出的一種新的菌種誘變育種方法，依賴于均勻分布的高濃度活性粒子作用于微生物細胞壁或者細胞膜，增加通透性同時損傷基因，導致微生物代謝網絡及生物性狀發生變化[12-13]。目前，常壓室溫等離子體誘變已成為快速突變各類微生物基因組的有效方法。例如，該方法對一株他克莫司出發菌株進行誘變，高產菌株搖瓶發酵單位提高了162%[14]；對替考拉寧產生菌Actinoplanes teichomyceticusFIM-68的孢子進行誘變，獲得一株遺傳性狀穩定的替考拉寧高產菌FIM-68-66，其替考拉寧產量提高了2倍[15]；通過ARTP技術對菌株米曲霉KA2308誘變處理，篩選得到米曲霉高產株菌株KA1515，曲酸產量較出發株增加31.48%[16]。新型多功能等離子體誘變系統(multifunctional plasma mutagenesis system，MPMS)是以等離子體誘變為主，同時可結合紫外、化學誘變等多種手段開展復合誘變，該系統以氮氣為工作氣體，取代了ARTP所使用的高成本氦氣，同時具有可控性強、操作簡便、過程安全、獲得的突變體性狀穩定等特點，是一種新型微生物誘變平臺。本研究以小單孢菌TMD166為出發菌株，采用MPMS復合紫外照射(MPMS-UV)，以期獲得166A高產突變株，為該抗生素的進一步開發利用提供高產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發菌株：166A產生菌TMD166是2011年中國醫學科學院醫藥生物技術研究所微生物化學研究室在塔克拉瑪干沙漠南麓采集的沙漠植物中分離得到的一株內生放線菌，為小單孢菌屬放線菌，代號TMD166。保存于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所微生物化學研究室。抗菌活性檢定菌株：枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilisCPCC 100029)。

1.1.2 培養基

(1)平板及發酵培養基(g/L)

38#培養基：葡萄糖4.0，酵母粉4.0，麥芽浸粉5.0，ZnSO4.7H2O 0.001，MnCl2.4H2O 0.001，FeSO4.7H2O 0.002，苯丙氨酸0.001，丙氨酸0.0003，維生素B10.001，維生素B20.001，維生素B60.001，煙酸0.001，生物素0.001，pH 8.5。固體培養基加瓊脂12.0，115℃滅菌20 min。

(2)生物檢定培養基(g/L)

牛肉膏2.5，酵母膏6.0，蛋白胨(F403) 6.0，葡萄糖2.0，瓊脂13.0，pH8.0。

1.2 儀器與試劑

多功能等離子體誘變系統 (MPMS-MANDELA)：北京艾德豪克國際技術有限公司；臺式振蕩器(ZHWY-3212)：上海智城有限公司；高壓滅菌器(SQ810C)：雅馬拓科技貿易(上海)有限公司；抑菌圈測量儀(Z9)：杭州迅數科技有限公司；真空離心濃縮儀(EZ-2)：英國Genevac公司；島津高效液相色譜儀(LC-20AT)：島津企業管理(中國)有限公司；分析色譜柱 (4.6 mm×250 mm，粒徑：5 μm)：北京綠百草科技發展有限公司。HPLC所用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸液制備方法

將出發菌株孢子用無菌水洗脫，置于裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，28℃，210 r/min振蕩15～30 min，使孢子分散。經無菌脫脂棉過濾，制成孢子濃度約為106個/mL的單孢子懸液。

1.3.2 誘變方法

(1)紫外誘變 移取20 μL孢子懸液均勻涂抹在無菌不銹鋼載片上，超凈臺內風干1 min形成菌膜后，轉移至多功能等離子體誘變系統中進行紫外誘變。以處理時間為誘變的主要操作參數，紫外誘變條件：照射距離30 cm，波長254 nm，功率30 W，斜45度角照射。每組樣品處理時間分別為15 s、30 s依次遞增至120 s。處理后，用1 mL無菌水洗脫置于無菌管中，再以無菌水10倍梯度稀釋，均勻涂布在平板培養基上，未經紫外線照射的菌懸液作為平行對照。以上平板28℃，避光培養7～10 d，通過菌落計數法計算誘變致死率。

(2)等離子體誘變 按照“1.3.2(1)”項下方法，不銹鋼載片上取20 μL孢子懸液風干形成菌膜置于誘變系統中，以高純(＞99.99%)氮氣為工作氣體，以處理時間為誘變的主要操作參數，等離子體誘變條件：垂直射頻功率為100 W，處理間距5 mm，氣體流量12.05 SLM(standard liters per minute)。每組樣品處理時間分別為15 s、30 s依次遞增至120 s，通過菌落計數法計算誘變致死率。

(3)等離子體-紫外復合誘變 按照“1.3.2(1)”和“1.3.2(2)”項下方法，不銹鋼載片上取20 μL孢子懸液風干形成菌膜置于誘變系統中，選擇最佳復合誘變條件連續誘變，通過菌落計數法計算誘變致死率。

1.3.3 誘變致死率及突變率的計算

誘變菌株致死率(%)=(對照平板菌落數-誘變平板菌落數)/對照平板菌落數×100%。誘變株突變率的計算以出發菌株抑菌圈直徑為標準。定義抑菌圈直徑大于或小于出發菌株抑菌圈直徑10%以上的菌株為突變株，其中，抑菌圈直徑大于出發菌株10 %的菌株定義為正突變株。因此，正突變率(%)=正突變株數/誘變菌落總數×100%。

1.3.4 菌株篩選及發酵

牛津杯固體發酵高通量初篩：挑取平板培養基上成熟單菌落至含有固體發酵培養基的牛津杯中，28℃發酵7 d，將牛津杯轉移至枯草芽胞桿菌檢定平板上進行166A抗菌活性檢測。37℃培養12～15 h，挑取抑菌圈直徑高于出發菌株的正突變菌落傳代培養。

搖瓶復篩：將初篩獲得的正突變株挖塊接種于發酵培養基(250 mL三角瓶，裝量50 mL)，在210 r/min、28℃條件下搖瓶發酵96～120 h。發酵液離心后取上清液270 μL，采用杯碟法進行生物活性檢定。選取抑菌圈直徑顯著高于出發菌株的發酵液樣品再進行HPLC分析。

1.3.5 分析方法

(1)效價測定 待檢測發酵液經3000 r/min離心10 min，取25 mL上清液以等體積乙酸乙酯萃取后，取出酯相至真空離心濃縮儀中抽干。取250 μL甲醇溶解待測樣品，以12000 r/min離心10 min取上清，根據文獻采用的高效液相色譜法[17]，測定其中166A的含量。

(2)HPLC檢測條件 色譜儀：島津高效液相色譜儀(LC-20AT)，色譜柱：SilGreen ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：68%甲醇-水溶液，檢測波長：230 nm，流速：0.8 mL/min，進樣量：15 μL。

2 結果

2.1 紫外誘變及等離子體誘變時間條件的確定

按照 “1.3.2(1)”和“1.3.2(2)”項所述紫外誘變以及等離子體誘變方法，繪制菌株誘變致死率曲線(圖1～2)。結果顯示，以時間為參數的誘變劑量與致死率之間存在明顯的正相關性，致死率隨誘變時間的延長呈上升趨勢。紫外誘變中，輻射45 s時致死率達到77.44%，輻射90 s時致死率達到95.77%；等離子體誘變處理時間為30 s時，致死率為76.55%；當處理時間達到45 s，致死率為93.22%，當處理時間達到120 s時，紫外誘變和等離子體誘變致死率都接近100%。另有文獻表明，紫外處理致死率在70%～80%之間時正突變率較高[18]，因此，結合致死率曲線和發酵篩選結果，在盡可能增大誘變株篩選樣本量的條件下，復合誘變紫外輻射時間選擇45～60 s，等離子體照射時間選擇75～105 s。

圖1 菌株TMD166紫外誘變致死率曲線Fig.1 The lethality rate of strain TMD166 treated by UV

圖2 TMD166-UV130等離子體誘變致死率曲線Fig.2 The lethality rate of strain TMD166-UV130 treated by MPMS

2.2 等離子體-紫外復合誘變的致死率

按照“1.3.2(3)”項中等離子體-紫外復合誘變方法，將誘變株TMD166-MPMS105單孢子懸液放入誘變系統中進行復合誘變。其中，等離子體誘變處理時間為75、90和105 s；紫外線照射時間為45和60 s。涂布后，28℃培養7～10 d，統計致死率。結果顯示MPMS75s-UV45s、MPMS90s-UV45s、MPMS105s-UV45s、MPMS75s-UV60s、MPMS90s-UV60s和MPMS105s-UV60s 6種條件下，菌株致死率分別為80.35%、94.35%、95.79%、86.42%、99.79%和99.88%(圖3)。

圖3 TMD166 MPMS-UV誘變致死率Fig.3 The lethality rate of TMD166 treated by MPMS-UV

2.3 等離子體-紫外復合誘變菌株突變率

從MPMS-UV復合誘變不同劑量組中挑取1200個單菌落，以TMD166為對照，先采用牛津杯固體發酵高通量篩選方法進行初篩，根據抑菌圈直徑大于對照10%以上為正突變，計算不同MPMS-UV誘變劑量下的突變率，結果見表1。在MPMS105s-UV60s條件下誘變效果最佳，正突變率達到41.43%，顯著高于其他MPMS-UV復合誘變條件。MPMS75s-UV60s誘變條件下，正突變率最低，僅為2.64%。而MPMS90s-UV60s和MPMS105s-UV60s兩種誘變條件致死率接近，但正突變率差異較大，分別為12.70%和41.43%。

表1 不同復合誘變條件下的致死率和正突變率Tab 1 Lethality rate and positive mutation rate by different mutation conditions

2.4 等離子體-紫外復合誘變選育結果

以TMD166為出發菌株，按圖4所示篩選流程，取在優化實驗條件下，分別經UV、MPMS、MPMSUV復合誘變處理后的菌懸液涂布于分離平板上，基于牛津杯固體發酵高通量篩選方法初篩，對正突變菌株開展搖瓶復篩。所得發酵液采用杯碟法進行生物活性檢測，選取抑菌圈直徑顯著高于出發菌株的樣品進行HPLC分析，測定誘變菌株的化學效價。MPMS-UV復合誘變共挑選出400個正突變株搖瓶復篩，選取81株正突變株測定化學效價，其相對化學效價見圖5。最終篩選出2株高產菌株(圖6)，其中TMD166-MU1突變株的166A產量最高，經HPLC分析(圖7)，相比出發菌株提高了7.47倍。

圖4 誘變篩選流程圖Fig.4 The flow-chart of mutagenesis and screening

圖5 TMD166菌株與MPMS-UV突變株166A的相對效價Fig.5 The relative titer of 166A produced by mutants from TMD166 strain treated by MPMS-UV

圖6 TMD166菌株與MPMS-UV突變株產生166A的相對化學效價Fig.6 The relative titer of 166A produced by the TMD166 and TMD166-MU1

圖7 TMD166和TMD166-MU1發酵產物166A的HPLC檢測圖Fig.7 HPLC profiles of 166A produced from strain TMD166 and TMD166-MU1

3 結論和討論

紫外線能使細胞DNA分子形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對，從而引發突變[19]。等離子體源中富含均勻分布的高濃度活性粒子，能夠對微生物的遺傳物質造成損傷，微生物基因序列及其代謝網絡發生顯著變化。本研究采用常壓室溫等離子體結合紫外照射的復合誘變方法，彌補了紫外單一誘變源容易產生誘變飽和效應現象的不足[20-21]，充分發揮了等離子體誘變能夠提供更為豐富的突變位點以及增強遺傳穩定性的優勢，提高突變率的同時也增加了突變類型[22]。研究結果表明，采用常壓室溫等離子體-紫外復合誘變選育，結合牛津杯固體發酵高通量篩選方法，高效獲得了比原始菌株166A產量提高7.47倍的復合誘變高產菌株TMD166-MU1，為166A的進一步研發利用奠定了良好基礎。

除較新穎的MPMS-UV復合誘變平臺外，本研究采用的牛津杯固體發酵高通量篩選方法(圖8)也值得一提。由于誘變后獲得的菌株數量極多，在較短時間內完成大量成熟單菌落的快速篩選難度較大。本研究采用該方法對誘變菌株開展全覆蓋初篩，節省了大量的材料、時間和搖床設備，極大提高了篩選效率。結果表明，采用牛津杯固體發酵高通量篩選方法，不僅增大了篩選樣本量，提高了高產菌株發現概率，還進一步體現出MPMS-UV復合誘變的核心優勢，為其他次級代謝產物高產菌株的選育提供了良好的借鑒。

圖8 牛津杯固體發酵高通量篩選方法Fig.8 The high throughput screening with oxford cup method