1株海洋真菌Aspergillus sp.WHUF0313次級代謝產物及其活性研究

王森 洪葵 霍瑞云 賈佳 孫立彥,* 劉玲,*

(1 山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)藥學院，泰安 271016；2 武漢大學藥學院，武漢 430070；3 中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室，北京 100101；4 南京醫科大學基礎醫學院，南京 211166)

天然產物是藥物先導化合物的重要來源，海洋微生物因其豐富多樣的特性逐漸成為天然產物開發的熱點領域。海洋真菌是生存在寡營養、含鹽、弱堿性的海水環境中的一大類微生物群體，為適應其生長環境，可能具有獨特代謝途徑和防御體制，從而產生系列結構新穎、功能豐富的生物活性代謝產物。近20年來，海洋真菌來源天然產物在種類和數量上呈逐年遞增趨勢，目前已經發現的新的次級代謝產物數量有幾千種，這些天然產物大多為生物堿、聚酮、萜類和大環內酯等結構[1-4]，且具有抗癌、抗菌、抗病毒和抗氧化等生物活性[5-7]，因此海洋真菌也逐漸成為藥物開發的重要來源之一。蛇孢菌素(ophiobolin)類化合物是一類以[5,8,5]三環為基本骨架的二倍半萜類化合物，這類化合物主要由Aspergillussp.和Bipolarissp.產生[8]。1957年，日本學者從植物病原真菌Bipolaris oryzae中分離出第一個蛇孢菌素化合物，命名為ophiobolin A[9]。隨后越來越多的蛇孢菌素類化合物被分離和鑒定，該類化

合物也具有廣泛的生物活性，包括植物毒性[10]、抗腫瘤[11-13]、抗菌活性[14-15]、抗病毒[16]、殺線蟲[17]和抗炎活性[18]等。本研究以一株分離自深海沉積物真菌Aspergillussp.WHUF0313為研究對象，從其發酵產物中分離獲得9個化合物，通過核磁波譜數據和文獻對比分別鑒定為：asperophiobolin G(1)[19]、asperophiobolin F(2)[19]、ophiobolin Q(3)[20]、asperophiobolin H(4)[19]、6-epi-ophiobolin G(5)[21]、ophiobolin H(6)[21]、6-epiophiobolin K(7)[21]、6-epi-21,21-O-dihydroophiobolin G(8)[22]和asperophiobolin J(9)[19]，并進行了體外抗菌試驗和細胞毒活性評價，化合物1～9的結構見圖1。

圖1 化合物1～9結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；高速低溫離心機(美國Sigma公司)；高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；生化培養箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；FlexStation 3酶標儀(美谷分子儀器有限公司)。甲醇、氯仿、乙酸乙酯和丙酮(分析純，北京化工廠)；色譜甲醇及色譜乙腈(德國Emoon公司)；柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(通用Helthcare公司)；柱層析反相硅膠(YMC公司)。

1.1.2 菌株來源

菌株Aspergillussp.WHUF0313為武漢大學藥學院洪葵課題組分離自深海沉積物，因其PDA固體培養物的甲醇提取物經初步抗菌活性篩選有較強的抗金黃色葡萄球菌活性，并且經HPLC-DAD分析呈現系列吸收峰，被選出進行化合物分離鑒定。對該菌株提取DNA，通過內部轉錄間隔區(Internal transcribed spacer region,ITS)序列進行比對，初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)真菌。

1.1.3 培養基

(1)馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)：新鮮去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1000 mL。

(2)種子液培養基：酵母提取物4 g，葡萄糖4 g，麥芽糖提取物10 g，去離子水1000 mL。

(3)大米海鹽培養基：大米100 g，無菌水120 mL，海鹽2 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株發酵

將菌株Aspergillussp.WHUF0313從凍存管中接至PDA平板活化，28℃恒溫培養箱靜置培養，長至2/3培養基后，觀察記錄菌落形態。切取3～4塊0.5 cm2菌塊接種至已滅菌的種子液培養基中，28℃，200 r/min條件下振蕩培養3～4 d，以5%的接種量接種至添加1%海鹽的固體大米培養基(4 kg)中，28℃恒溫避光靜置發酵30 d。

1.2.2 化合物分離純化

發酵結束后經乙酸乙酯(EtOAc)浸泡萃取，減壓濃縮得粗提物29.3 g。粗提物經正相減壓硅膠柱層析分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(20:1，15:1，10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2)，100%甲醇洗脫，經薄層層析(TLC)分析合并相似組分后，得到9個組分(Fr.1～Fr.9)。Fr.2經ODS反相柱層析,甲醇:水(30:70～100:0)分離得到9個組分(Fr.2-1～Fr.2-9)，其中Fr.2-9經半制備液相甲醇:水(87:13)得到化合物5(2 mg,tR30 min)、化合物6(4 mg,tR50 min)、化合物7(4 mg,tR32 min)、化合物8(2.5 mg,tR55 min)和化合物9(4 mg,tR16 min)。Fr.6經ODS反相柱層析,甲醇:水(30:70～100:0)分離得到7個組分(Fr.6-1～Fr.6-7)，其中Fr.6-6經半制備液相甲醇:水(50:50)制備得到化合物1(4 mg,tR26.5 min)、化合物3(5 mg,tR24 min)和化合物4(5 mg,tR25.5 min)。Fr.8經Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇:二氯甲烷(1:1)分離，收集得到10個組分(Fr.8-1～Fr.8-10)，其中Fr.8-9～10合并，經半制備液相甲醇:水(45:55)制備得到化合物2(5 mg,tR21 min)。

1.2.3 體外抗菌活性測試

采用肉湯微量稀釋法[23]檢測化合物1～9對多種致病菌的抑制作用。實驗所采用的指示菌為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)以及糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，菌株編號見表1。96孔板中第1孔加188 μL的相應培養基，其中幽門螺桿菌培養應用腦心浸出液培養基(BHI)，其他非幽門螺桿菌菌株培養用M-H培養基。另外加入2 μL 6.4 mg/mL的待測化合物溶液母液，在96孔板進行二倍倍比稀釋，每孔待測化合物終濃度分別為64、32、16、8、4、2和1 μg/mL，再加入10 μL待測菌液，其中幽門螺桿菌終濃度為5×105～1×106CFU/mL，其他非幽門螺桿菌株終濃度為5×104～1×105CFU/mL，幽門螺桿菌需放置于微需氧培養箱中培養3 d，其他菌株在37℃細菌培養箱中培養1 d，然后對細菌培養液渾濁度進行觀察，培養液最澄清的孔所對應的藥物濃度為該待測藥物的最小抑菌濃度MIC(minimum inhibitory concentration，MIC)，甲硝唑或氨芐西林作陽性對照，DMSO作陰性對照，空培養基作空白對照。該實驗需重復3次。

表1 化合物1～9的抗菌活性結果Tab.1 Antibacterial activities of compounds 1～9

1.2.4 細胞毒活性測試

采用MTS法[24]測試細胞毒性，將小鼠黑色素瘤(B16)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和人肝癌細胞(HepG2)從液氮內取出，于37℃水浴2 min，離心去上清，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，37℃、5% CO2靜置培養。將胰酶、培養基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)預熱至37℃，PBS沖洗細胞培養液，棄掉PBS后使用含EDTA的0.25%胰酶消化2 min，再加入同體積含血清的完全培養基用于終止反應。移液管吹打制成單細胞懸液，培養皿內加入1:3～1:4單細胞，再加入10 mL培養基于37℃、5% CO2靜置培養，獲得傳代細胞。將對數生長期的細胞消化后計數，按3×103個/孔加入96孔板，培養過夜使細胞貼壁，去除培養基后加入無酚紅無血清DMEM培養基100 μL/孔，DMSO溶解陽性對照及化合物加入96孔板，倍比稀釋，使其濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.13 μmol/L，空白對照加入等體積的有機溶劑DMSO，每組有3個平行孔，在37℃、5% CO2環境中培養48 h，每孔加配置好的MTS:PMS=20:1(V/V)的混合溶液20 μL，37℃黑暗條件下培養90 min。490 nm酶標儀測定各孔光吸收值，計算抑制率，Prism 6.0軟件計算IC50值。重復3次實驗。

2 結果與分析

2.1 結構解析

化合物1：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.86 (1H,dd,J=2.4,6.6 Hz,H-8),5.88 (1H,s,H-4),5.43 (1H,overlap,H-16),5.41 (1H,overlap,H-17),4.22 (1H,d,J=9.0 Hz,H-18),3.32 (1H,d,J=4.5 Hz,H-6),3.24 (dt,J=20.7,3.2 Hz,H-9a),2.78 (1H,m,H-10),2.70 (1H,m,H-2),2.62 (1H,m,H-15),2.37 (1H,m,H-9b),2.06 (3H,s,H-20),2.02(1H,m,H-1a),1.97 (1H,m,H-14),1.67 (1H,m,H-13a),1.50 (1H,m,H-12a),1.39 (1H,m,H-12b),1.34 (1H,m,H-13b),1.23 (1H,t,J=13.0 Hz,H-1b),1.17 (3H,s,H-25),1.13 (3H,s,H-24),0.98 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.91 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 206.1 (C-5),193.2 (C-21),176.9 (C-3),157.9 (C-8),141.3 (C-16),140.8 (C-7),130.7 (C-4),128.5 (C-17),74.9 (C-18),72.6 (C-19),52.7 (C-14),50.5 (C-6),49.9(C-2),46.6 (C-1),46.2 (C-11),44.9 (C-12),44.4 (C-10),33.5 (C-15),31.4 (C-9),28.3 (C-13),26.8 (C-25),24.9(C-24),23.1 (C-22),21.5 (C-23),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[19]數據比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin G。

化合物2：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.38 (1H,s,H-21),7.11 (1H,dd,J=7.1,3.3 Hz,H-8),5.99 (1H,s,H-4),5.33 (1H,overlap,H-16),5.32 (1H,overlap,H-17),4.18 (1H,m,H-6),4.04 (1H,d,J=8.1 Hz,H-18),3.14 (1H,m,H-2),2.88 (1H,dt,J=19.8,3.7 Hz,H-9a),2.64 (1H,m,H-15),2.57 (1H,m,H-9b),2.23 (3H,s,H-20),2.20 (1H,m,H-10),1.94 (1H,m,H-14),1.85 (1H,m,H-1a),1.65 (1H,m,H-13a),1.48(1H,m,H-12a),1.41 (1H,m,H-13b),1.36 (1H,m,H-1b),1.30 (1H,m,H-12b),1.14 (3H,s,H-25),1.12 (3H,s,H-24),0.89 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23),0.82 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.4 (C-5),195.4(C-21),177.9 (C-3),160.5 (C-8),141.7 (C-16),138.9 (C-7),131.1 (C-4),127.2 (C-17),74.8 (C-18),72.7 (C-19),49.3 (C-2),48.9 (C-6),47.0 (C-14),46.8,(C-11),40.7 (C-10),40.7 (C-12),36.3 (C-1),36.3 (C-15),30.5 (C-9),28.3(C-13),26.7 (C-25),24.9 (C-22),24.5 (C-24),20.7 (C-23),18.6 (C-20)。以上波譜數據譜與文獻[19]數據比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin F。

化合物3：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.83 (1H,dd,J=6.6,2.6 Hz,H-8),5.88 (1H,s,H-4),5.59 (1H,dd,J=11.0,8.6 Hz,H-16),5.51 (1H,dd,J=11.0,9.2 Hz,H-17),4.19 (1H,d,J=9.2 Hz,H-18),3.35 (1H,d,J=4.3 Hz,H-6),3.06 (1H,dt,J=20.0,3.3 Hz,H-9a),2.86 (1H,m,H-2),2.73 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.36 (1H,m,H-9b),2.11 (1H,dd,J=13.1,3.7 Hz,H-1a),2.07(3H,s,H-20),2.01 (1H,m,H-14),1.67 (1H,m,H-13a),1.53 (1H,m,H-12a),1.48 (1H,m,H-12b),1.35 (1H,m,H-13b),1.22 (1H,t,J=13.1 Hz,H-1b),1.19 (3H,s,H-24),1.17 (3H,s,H-25),1.06 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.90 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 206.1 (C-5),193.2 (C-21),176.9 (C-3),156.9 (C-8),141.8 (C-16),141.7 (C-7),130.7 (C-4),129.3 (C-17),74.7 (C-18),72.9 (C-19),52.9 (C-14),50.5 (C-6),49.9(C-2),46.6 (C-11),46.1 (C-1),45.0 (C-12),44.3 (C-10),33.6 (C-15),32.1 (C-9),28.2 (C-13),26.3 (C-25),25.3(C-24),22.9 (C-22),22.3 (C-23),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[20]數據比對一致，因此鑒定該化合物為ophiobolin Q。

化合物4：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z401.27 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O4，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.39 (1H,s,H-21),7.09 (1H,dd,J=7.2,3.1 Hz,H-8),6.00 (1H,s,H-4),5.41 (1H,overlap,H-16),5.40 (1H,overlap,H-17),4.14 (1H,d,J=7.2 Hz,H-18),4.05 (1H,d,J=7.6 Hz,H-6),3.14 (1H,m,H-2),2.82(1H,m,H-9a),2.68 (1H,m,H-15),2.48 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,m,H-10),2.24 (3H,s,H-20),1.96 (1H,m,H-13a),1.88 (3H,m,H-1a),1.63 (1H,m,H-13b),1.40(1H,m,H-12a),1.35 (H,m,H-1b),1.30 (1H,m,H-12b),1.19 (3H,s,H-25),1.16 (3H,s,H-24),0.94 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23),0.80 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.1 (C-5),195.4 (C-21),177.9 (C-3),159.7 (C-8),142.5 (C-16),139.2 (C-7),131.1 (C-4),127.5 (C-17),74.6 (C-18),72.9 (C-19),49.4 (C-2),48.9(C-6),47.4 C-11),46.7 (C-14),40.9 (C-12),40.9 (C-10),36.3 (C-1),36.1 (C-15),30.8 (C-9),28.0 (C-13),26.4(C-25),25.0 (C-22),24.6 (C-24),21.2 (C-23),18.6 (C-20)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[19]數據比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin H。

化合物5：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z367.26 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H34O2，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.23 (1H,s,H-21),6.84 (1H,dd,J=6.5,2.5 Hz,H-8),6.13 (1H,overlap,H-17),6.16 (1H,d,J=10.1 Hz,H-18),5.87 (1H,s,H-4),5.26 (1H,d,J=9.1 Hz,H-16),3.35 (1H,d,J=4.5 Hz,H-6),2.89 (1H,m,H-9a),2.72 (1H,m,H-2),2.69 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.18 (1H,m,H-9b),2.07 (3H,s,H-20),2.02(1H,m,H-1a),1.88 (1H,m,H-14),1.82 (3H,s,H-25),1.78 (3H,s,H-24),1.63 (1H,m,H-13a),1.52 (2H,m,H-12a),1.42 (1H,m,H-12b),1.28 (1H,m,H-13b),1.19(1H,m,H-1b),0.97 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.91 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 206.1 (C-5),193.3 (C-21),176.9 (C-3),157.1 (C-8),141.8 (C-7),138.5 (C-19),135.4 (C-16),130.7 (C-4),124.5 (C-17),121.3 (C-18),52.5 (C-14),50.5 (C-6),49.9 (C-2),46.5(C-1),45.3,(C-11),44.3 (C-12),44.2 (C-10),33.3 (C-15),31.4 (C-9),27.3 (C-13),26.5 (C-25),23.1 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-24),16.9 (C-20)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[21]數據比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-ophiobolin G。

化合物6：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z387.29 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H38O3，不飽和度為7。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH: 6.10 (1H,d,J=11.5 Hz,H-18),6.02(1H,t,J=11.5 Hz,H-17),5.55 (1H,m,H-8),5.24 (1H,t,J=10.2 Hz,H-16),4.43 (2H,overlap,H-21),3.13 (1H,m,H-6),2.77 (1H,m,H-15),2.52 (1H,m,H-9a),2.24(1H,m,H-2),2.10 (1H,m,H-14),2.02 (2H,overlap,H-4),1.78 (3H,s,H-25),1.75 (1H,m,H-13a),1.71 (3H,s,H-24),1.61 (1H,m,H-9b),1.58 (1H,m,H-10),1.53(1H,m,H-1a),1.42 (2H,m,H-1b,12a),1.38 (1H,m,H-12b),1.30 (1H,m,H-13b),1.15 (3H,s,H-20),0.95(3H,s,H-22),0.88 (3H,d,J=6.7 Hz,H-23);13C NMR(125 MHz,Acetone-d6) δC: 142.2 (C-7),138.8 (C-16),135.1 (C-19),122.6 (C-8),122.0 (C-17),121.4 (C-18),117.2 (C-5),80.0 (C-3),71.8 (C-21),56.2 (C-10),54.5(C-6),52.4 (C-2),51.4 (C-4),48.1 (C-14),44.3 (C-11),43.9 (C-12),37.1 (C-1),36.2 (C-15),27.3 (C-13),26.4(C-25),26.3 (C-20),25.7 (C-9),20.6 (C-23),19.0 (C-22),18.1 (C-24)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[21]數據比對，鑒定該化合物為ophiobolin H。

化合物7：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z385.27 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O3，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.17 (1H,s,H-21),6.92 (1H,dd,J=6.9,2.4 Hz,H-8),6.15 (1H,overlap,H-17),6.12 (1H,overlap,H-18),5.29 (1H,t,J=9.4 Hz,H-16),3.17 (1H,d,J=10.6 Hz,H-6),2.90 (1H,d,J=16.5 Hz,H-4a),2.87 (1H,m,H-9a),2.69 (1H,m,H-10),2.62 (1H,m,H-15),2.34 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,dd,J=16.5,1.5 Hz,H-4b),2.09 (1H,m,H-2),2.07 (1H,overlap,H-14),1.97 (1H,m,H-1a),1.82 (3H,s,H-25),1.73 (3H,s,H-24),1.67 (1H,m,H-13a),1.50 (1H,m,H-1b),1.49(1H,m,H-12a),1.46 (1H,m,H-12b),1.40 (3H,s,H-20),1.30 (1H,m,H-13b),0.98 (3H,d,J=6.8 Hz,H-23),0.88 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6)δC: 215.7 (C-5),194.9 (C-21),159.9 (C-8),143.2 (C-7),137.0 (C-19),136.2 (C-16),124.5 (C-17),121.3 (C-18),76.2 (C-3),55.7 (C-4),52.9 (C-14),50.9 (C-2),49.6(C-6),46.1 (C-12),45.5 (C-11),44.6 (C-10),42.4 (C-1),33.3 (C-15),31.4 (C-9),28.3 (C-13),26.5 (C-25),25.8(C-20),23.5 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-24)。以上波譜數據與文獻[21]數據比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-ophiobolin K。

化合物8：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z369.28 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H36O2，不飽和度為8。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH: 6.10 (2H,overlap,H-17,18),5.82(1H,s,H-4),5.61 (1H,d,J=6.0 Hz,H-8),5.22 (1H,t,J=10.0 Hz,H-16),4.16 (1H,m,H-21a),3.86 (1H,d,J=12.0 Hz,H-21b),3.45 (1H,d,J=3.5 Hz,H-6),2.89 (1H,overlap,H-2),2.67 (1H,m,H-10),2.67 (1H,m,H-15),2.51 (1H,m,H-9a),2.09 (1H,dd,J=13.0,3.5 Hz,H-1a),2.06 (1H,overlap,H-20),1.94 (1H,m,H-9b),1.80 (3H,s,H-25),1.72 (3H,s,H-24),1.63 (1H,m,H-14),1.52 (1H,m,H-13a),1.46 (1H,m,H-12a),1.33 (1H,m,H-12b),1.29 (1H,m,H-13b),1.18 (1H,m,H-1b),1.04 (3H,s,H-22),0.94 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 208.2 (C-5),179.5(C-3),137.7 (C-16),135.7 (C-19),135.6 (C-7),130.5(C-4),129.6 (C-8),124.0 (C-17),121.4 (C-18),66.6 (C-21),53.1 (C-6),52.9 (C-14),51.4 (C-2),47.1 (C-1),45.8(C-11),45.0 (C-12),44.4 (C-10),33.1 (C-15),28.4 (C-9),26.4 (C-13),26.4 (C-24),23.1 (C-22),21.6 (C-23),18.1 (C-25),17.3 (C-20)。以上波譜數據與文獻[22]數據比對一致，因此鑒定該化合物為6-epi-21,21-Odihydroophiobolin G。

化合物9：無色油狀，ESIMS顯示其準分子離子峰為m/z419.28 [M+H]+，結合氫譜和碳譜推測其分子式為C25H38O5，不飽和度為9。1H NMR (500 MHz,Acetone-d6) δH:9.17 (1H,s,H-21),6.94 (1H,dd,J=6.5,2.0 Hz,H-8),5.46 (1H,dd,J=11.5,9.5 Hz,H-16),5.41(1H,dd,J=11.5,9.5 Hz,H-17),4.20 (1H,d,J=9.0 Hz,H-18),3.16 (1H,d,J=9.9 Hz,H-6),2.91 (1H,d,J=16.0 Hz,H-4a),2.84 (1H,overlap,H-9a),2.67 (1H,m,H-15),2.58 (1H,ddd,J=14.5,10.0,4.0 Hz,H-10),2.35 (1H,m,H-9b),2.27 (1H,dd,J=16.0,1.5 Hz,H-4b),2.09 (1H,m,H-2),1.95 (1H,m,H-14),1.80 (1H,dd,J=13.5,4.5 Hz,H-1a),1.73 (1H,m,H-13a),1.66 (1H,m,H-1b),1.51 (1H,m,H-12a),1.46 (1H,m,H-12b),1.40 (3H,s,H-20),1.31(1H,m,H-13b),1.16 (3H,s,H-25),1.13 (3H,s,H-24),0.99 (3H,d,J=6.5 Hz,H-23),0.89 (3H,s,H-22);13C NMR (125 MHz,Acetone-d6) δC: 215.8 (C-5),194.8 (C-21),160.8 (C-8),142.8 (C-16),140.6 (C-7),128.5 (C-17),76.2 (C-3),74.9 (C-18),72.6 (C-19),55.8 (C-4),52.8 (C-14),50.9 (C-2),49.6 (C-6),46.0 (C-12),45.6 (C-11),44.6(C-10),42.4 (C-1),33.4 (C-15),31.3 (C-9),28.2 (C-13),26.7 (C-25),25.8 (C-20),24.9 (C-24),23.6 (C-22),21.5(C-23)。1H NMR和13C NMR數據與文獻[19]數據比對一致，因此鑒定該化合物為asperophiobolin J。

2.2 體外抗菌活性

對化合物進行抗多重耐藥(耐甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星)幽門螺桿菌H.pylori159、多重耐藥(耐克拉霉素、阿莫西林)幽門螺桿菌H.pylori129、金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC25923、S.aureusNEWMAN)、屎腸球菌(E.faeciumATCC19434)以及糞腸球菌(E.faecalisFA2-2)的活性測試，結果顯示化合物6對幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌均有一定程度的抑菌活性，MIC值分別為16、4、16和16 μg/mL。化合物7對幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性，MIC值為16 μg/mL，實驗結果如表1。

2.3 細胞毒活性

對化合物1～9進行了細胞毒活性測試，測試結果顯示化合物4對B16和MCF-7具細胞毒活性，IC50值分別為(74.63±17.23)和(96.43±2.81) μmol/L；化合物3對B16、MCF-7和HepG2均有細胞毒活性，IC50值分別是(33.50±6.91)、(70.79±6.72)和(66.41±6.61) μmol/L。順鉑為陽性對照，IC50值分別為(20.45±0.66)、(3.80±0.20)和(10.44±1.55) μmol/L。

3 討論

本研究從一株深海來源曲霉屬真菌WHUF0313發酵產物中分離得到9個蛇孢菌素類化合物，分別為：asperophiobolin G(1)、asperophiobolin F(2)、ophiobolin Q(3)、asperophiobolin H(4)、6-epiophiobolin G(5)、ophiobolin H(6)、6-epi-ophiobolin K(7)、6-epi-21,21-O-dihydroophiobolin G(8)和asperophiobolin J(9)。根據文獻報道，這9個蛇孢菌素類化合物主要是抗炎、抗菌和抗腫瘤活性：化合物3、4、5和9均具有一定的抗炎活性[19,25]；化合物5、6和7對不同的致病菌均具有抑制生長的能力[26-29]；化合物3、5、7和8對多種腫瘤細胞具有細胞毒活性[13,20-21,30]。本研究對分離得到的化合物進行了細胞毒活性評價，發現化合物4對B16和MCF-7具有細胞毒活性；化合物3對B16、MCF-7和HepG2細胞均有細胞毒活性。同時對化合物1～9進行體外抗菌活性評價，本研究首次報道了化合物6和7對兩種多重耐藥幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用，可在此基礎上對該菌株進一步研究，通過優化其發酵培養條件對其次級代謝產物進行深入研究，更好的幫助我們去尋找天然抗菌活性化合物，為臨床上抗菌藥物的開發提供借鑒。本研究結果豐富了海洋來源曲霉屬真菌活性次級代謝產物，表明海洋真菌是生物活性次級代謝產物的重要來源，以海洋來源真菌為切入點開發抗菌藥物具有較大潛力和廣闊前景。