深海真菌Aspergillus sp.20220129的次級代謝產物及抑菌活性研究

董怡飛 徐秀麗 張新婉 徐巍 楊金鵬 郭夢捷 張楷 宋福行

(1 北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048；2 中國地質大學(北京) 海洋學院，北京 100083)

海洋是地球上生物多樣性和物種最豐富的棲息地之一，特殊的環境條件如高壓、高鹽、無光、低溫、氧含量低、沉積物多等，使其成為天然產物的巨大資源寶庫，海洋來源的天然產物在抑菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮痛等領域發揮著非常顯著的作用[1-2]，為新藥研究提供了結構獨特和生物活性豐富的化合物。如今，抗生素的廣泛使用造成高水平耐藥的病原菌大量出現，因此，尋找新型抗菌活性物質變得更加迫切[3]。研究表明，海洋真菌在發掘海洋天然產物中的貢獻顯著，從其次級代謝產物中分離得到結構新穎且活性顯著的化合物逐年增多，為海洋藥物的研發提供了候選化合物[4]。

曲霉屬真菌(Aspergillus)廣泛存在于各種環境中，從其次級代謝產物中發現獨特分子的潛力巨大[5-6]。近年來，從海洋來源曲霉中分離出了很多具有抗菌活性的化合物，如從太平洋深海海泥來源的真菌Aspergillus versicolorMCCC 3A00080中分離出一個新聯苯衍生物versiperol A，其對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為8 μg/mL[7]；從西太平洋深海海泥來源的真菌Aspergillus sydowiiC1-S01-A7中分離得到化合物2-hydroxy-6-formyl-vertixanthone和12-O-acetylsydowinin A，它們對兩株甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用[8]；從南海深海海泥來源的真菌Aspergillus insuetusSD-512分離出兩種新的苯酚衍生物insphenol A和acetylpeniciphenol，其中acetylpeniciphenol對遲鈍愛德華菌，溶藻弧菌和創傷弧菌的最低抑菌濃度分別為4、8和8 μg/mL[9]。為進一步探索深海來源曲霉產生的抗菌天然產物，本研究對分離自西太平洋深海沉積物中的一株真菌Aspergillussp.20220129開展了次級代謝產物研究，從中分離純化得到9個化合物，通過波譜學方法對化合物進行了結構解析，分別鑒定為terretonin(1)、terretonin A (2)、methyl dichloroasterrate (3)、methyl asterrate (4)、methyl 6-acetyl-5,7,8-trihydroxy-4-methoxy-2-naphthalenecarboxylate (5)、territrem B(6)、alantrypinone (7)、butyrolactone I (8)與versicolactone B (9) (圖1)。利用微量梯度稀釋法對上述化合物進行了抑菌活性篩選，結果表明化合物5、8和9對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌效果，最低抑菌濃度分別為100、100和50 μg/mL。

圖1 化合物1～9結構式Fig.1 The chemical structures of compounds 1～9

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀(安捷倫公司，美國)；EYELA NVP-2100V型旋轉蒸發儀(EYELA東京理化器械株式會社，日本)；MVS-83立式壓力蒸汽滅菌器(冰山松洋生物科技有限公司，日本)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-20D紫外分析儀(上海予申儀器有限公司)；BBSDDC潔凈工作臺(濟南鑫貝西生物技術有限公司)；MQD-M3R振蕩培養箱(上海旻泉儀器有限公司)；Bruker Avance DRX500MHz核磁共振儀(布魯克公司，瑞士)；其它常用試劑購于康科德科技有限公司。

1.2 菌株鑒定

菌株分離于西太平洋海域深度3000 m的深海沉積物中。菌株活化后用離心柱型真菌基因組提取試劑盒(Scintol，北京賽音圖科技有限公司)提取全基因組D N A 后，用真菌通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')與ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')擴增菌株的核糖體rDNA的ITS(Internal transcribed spacer)序列。PCR反應體系(20 μL) ：2×PCR Master Mix(含Taq酶，buffer，dNTP)10 μL，DNA模板1 μL，引物(20 μmol/L) 各0.8 μL，dd H2O 7.4 μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 1 min，72℃ 30 s，40個循環；72℃ 10 min，4℃保存。將PCR產物送往測序公司(北京擎科生物科技有限公司)測序，獲得序列信息后，在GenBank中進行BLAST相似性比對，選取相似度較高的菌株ITS序列，最后用MEGA-X的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.3 菌株發酵

取MEA培養平板(麥芽浸粉30 g，蛋白胨5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH6.0)上活化的1 cm2大小菌落，接入PDB培養基(PDB粉末35 g，蒸餾水 1 L)中，180 r/min，28℃培養3d后，將種子液接入滅菌的大米培養基(1 L三角瓶中，含150 g大米與120 mL水)中，28℃靜置培養30 d，發酵量3.0 kg。

1.4 化合物的分離純化

將發酵完成的培養基用混合溶液(乙酸乙酯-甲醇 4:1，V:V)浸泡過夜后，超聲20 min，抽濾除去培養基和菌體，反復提取3次，用旋轉蒸發儀將提取物濃縮，再用混合溶劑(乙酸乙酯-水 1:1，V:V)將其溶解，用分液漏斗反復萃取3次，將乙酸乙酯相合并濃縮后得粗提物16.2 g。粗提物進行硅膠拌樣，然后利用減壓正相硅膠柱色譜(薄層層析硅膠H)分離，用700 mL正己烷/二氯甲烷和二氯甲烷/甲醇體系(組分A：正己烷-二氯甲烷 50:50；組分B：正己烷-二氯甲烷 20:80；組分C：正己烷-二氯甲烷 5:95；組分D：正己烷-二氯甲烷 3:97；組分E：正己烷-二氯甲烷 2:98；組分F：正己烷-二氯甲烷 1:99；組分G：二氯甲烷-甲醇 99:1；組分H：二氯甲烷-甲醇 97:3；組分I：二氯甲烷-甲醇 95:5；組分J：二氯甲烷-甲醇90:10；組分K：二氯甲烷-甲醇 85:15；組分L：二氯甲烷-甲醇 80:20；組分M：二氯甲烷-甲醇 50:50)梯度洗脫，得到A～M共13個組分。隨后將組分C、D、H、I分別進行Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，均采用混合溶劑(二氯甲烷-甲醇 2:1，V:V)裝柱和洗脫，利用薄層色譜分析后，將收集的組分合并，分別得到C1～C4共4個組分、D1～D4共4個組分、H1～H9共9個組分、I1～I7共7個組分。

E組分直接進行HPLC制備(Agilent Zorbax RX-C8,9.4 mm×250 mm,5 μm，3.0 mL/min，35%～100%乙腈線性梯度14 min)，得到化合物3(13.2 mg)與5(1.5 mg)。C4和D3組分進行HPLC制備(Agilent Zorbax SB-C18,9.4 mm×250 mm,5 μm,3.0 mL/min,50%～100%乙腈線性梯度15 min)，分別得到化合物1(0.9 mg)和化合物3(2.2 mg)、5(4.1 mg)與8(8.3 mg)。H5組分進行HPLC制備(Agilent Zorbax SB-C18,9.4 mm×250 mm,5 μm,3.0 mL/min,35%～100%乙腈線性梯度15 min)，得到化合物5(12.4 mg)與6(13.9 mg)。H6組分進行HPLC制備(Agilent Zorbax SB-C18,9.4 mm×250 mm,5 μm,3.0 mL/min,45%～100%乙腈線性梯度15 min)，得到化合物2(21.1 mg)、4(3.2 mg)與7(7.8 mg)。I2組分進行HPLC制備(Agilent Zorbax SB-C18,9.4 mm×250 mm,5 μm,3.0 mL/min,30%～100%乙腈線性梯度25 min)，得到化合物2(9.8 mg)、6(10.3 mg)、8(19.9 mg)和9(45.6 mg)。

1.5 活性測試

采用96孔板微量稀釋法，對已鑒定的化合物進行活性測試。用二甲基亞砜(DMSO)將化合物濃度配制為4 mg/mL，采用96孔板微量稀釋法，測定已鑒定化合物對金黃色葡萄球菌(S.aureus)、白念珠菌(C.albicans)、大腸埃希菌(E.coli)的抗菌活性，分別以甲氧西林(methicillin)、雷帕霉素(rapamycin)、環丙沙星(ciprofloxacin)為陽性對照，其中DMSO為陰性對照。

采用相應的培養基配制好不同濃度的菌液，其中金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌使用MHB培養基(Solarbio MHB干粉24 g，蒸餾水1 L)，菌液濃度分別為1.0×106CFU/mL與2.5×105CFU/mL，白念珠菌使用RPMI 1640培養基(Gibco RPMI 1640粉末10.4 g，3-N-嗎啉代丙磺酸34.5 g，蒸餾水1 L，pH=7.0)，菌液濃度為1.0×104CFU/mL。

將96孔細胞培養板的各孔均加入80 μL菌液，每個培養板均設陽性對照與陰性對照，即在第一行的1孔內加入相應濃度的陽性對照，另一孔加入8 μL的DMSO作為陰性對照，剩余孔中加入8 μL濃度為4 mg/mL的待測化合物，隨后將第一行用相應的菌液補齊，使其總體積至160 μL，抽吸混勻后，用排槍從第1行中吸取80 μL溶液置于第2行，抽吸混勻，依次梯度稀釋至第8行，使待測化合物在濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.56 μg/mL，培養板用封口膜封好。培養細菌和真菌的96孔培養板，分別放入37℃和28℃恒溫培養箱中培養，培養16～18 h后觀察菌液是否澄清，菌液澄清孔相對應化合物的濃度即為其最低抑菌濃度[10]。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果

將ITS序列信息進行BLAST序列比對，選取相似度較高的菌株ITS序列，構建系統發育樹(圖2)，將菌株20220129初步鑒定為Aspergillussp.。

圖2 基于ITS基因序列相似性構建的菌株20220129的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain 20220129 and its related strains based on ITS sequences

2.2 結構鑒定

化合物1：白色粉末；ESI-MSm/z：489.1[M+H]+，C26H32O9；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) δH: 5.17(1H,s),4.94(1H,s),3.70(3H,s),3.67(1H,s),2.91(1H,d,J=14.5 Hz),2.67(1H,dd,J=19.0,8.5 Hz),2.38(1H,m),2.29(1H,d,J=14.5 Hz),2.06(1H,m),1.79(1H,m),1.78(3H,s),1.58(3H,s),1.35(3H,s),1.33(6H,s),1.06(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) δC: 32.4(C-1),34.0(C-2),214.4(C-3),52.0(C-4),130.7(C-5),139.2(C-6),197.1(C-7),43.5(C-8),77.5(C-9),47.2(C-10),27.9(C-11),140.4(C-12),48.9(C-13),42.8(C-14),167.9(C-15),84.7(C-16),202.5(C-17),21.2(C-18),23.7(C-19),21.3(C-20),18.6(C-21),113.9(C-22),18.3(C-23),23.1(C-24),168.0(C-25),53.5(C-1’)。以上化合物的波譜數據與文獻[11]報道的terretonin基本一致，故化合物1鑒定為terretonin。

化合物2：白色粉末；ESI-MSm/z：473.2[M+H]+，C26H32O8；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) δH: 5.00(1H,s),4.95(1H,s),3.75(3H,s),2.74(1H,s),2.69(1H,dd,J=19.0,9.0 Hz),2.57(1H,t,J=13.5 Hz),2.38(2H,m),2.16(1H,dd,J=13.5,9.0 Hz),1.68(1H,m),1.70(3H,s),1.60(3H,s),1.56(1H,dd,J=12.5,2.5 Hz),1.36(3H,s),1.35(3H,s),1.33(3H,s),0.98(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC: 33.4(C-1),32.4(C-2),214.2(C-3),47.3(C-4),136.1(C-5),139.7(C-6),197.4(C-7),45.9(C-8),51.5(C-9),37.5(C-10),28.3(C-11),144.0(C-12),50.1(C-13),48.5(C-14),166.6(C-15),85.0(C-16),201.9(C-17),21.0(C-18),23.2(C-19),15.6(C-20),16.6(C-21),110.7(C-22),23.2(C-23),21.7(C-24),167.7(C-25),53.8(C-1’)。以上化合物的波譜數據與文獻[12]報道的terretonin A基本一致，故化合物2鑒定為terretonin A。

化合物3：無色晶體；ESI-MSm/z：431.0 [M+H]+，C18H16Cl2O8；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) δH: 9.83(2H,brs),6.76(1H,d,J=2.5 Hz),6.66(1H,d,J=2.5 Hz),3.65(3H,s),3.60(3H,s),3.27(3H,s),2.45(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) δC: 135.1(C-1),124.4(C-2),107.4(C-3),154.7(C-4),104.7(C-5),152.9(C-6),56.1(C-7),164.5(C-8),52.0(C-9),149.2(C-1’),112.5(C-2’),149.0(C-3’),115.4(C-4’),135.7(C-5’),115.5(C-6’),18.2(C-7’),163.8(C-8’),51.9(C-9’)。以上化合物的波譜數據與文獻[13]報道的methyl dichloroasterrate一致，故化合物3鑒定為methyl dichloroasterrate。

化合物4：黃色粉末；ESI-MSm/z：363.1[M+H]+，C18H18O8；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH: 10.07(1H,s),9.89(1H,s),6.75(1H,d,J=2.5 Hz),6.74(1H,d,J=2.5 Hz),6.31(1H,m),5.62(1H,m),3.76(3H,s),3.69(3H,s),3.61(3H,s),2.06(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC: 133.7(C-1),125.7(C-2),107.5(C-3),155.1(C-4),104.8(C-5),153.5(C-6),56.1(C-7),167.0(C-8),52.1(C-9),165.3(C-1’),100.7(C-2’),157.0(C-3’),104.3(C-4’),145.9(C-5’),109.5(C-6’),21.4(C-7’),170.9(C-8’),51.9(C-9’)。以上化合物的波譜數據與文獻[14]報道的methyl asterrate基本一致，故化合物4鑒定為methyl asterrate。

化合物5：黃色針狀；ESI-MSm/z：307.1[M+H]+，C15H14O7；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) δH: 6.94(1H,d,J=1.5 Hz),6.72(1H,d,J=1.5 Hz),3.67(3H,s),3.66(3H,s),2.43(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC: 107.5(C-1),128.0(C-2),103.7(C-3),156.8(C-4),158.7(C-5),112.2(C-6),141.8(C-7),155.4(C-8),111.3(C-9),125.5(C-10),52.3(2-OMe),165.7(2-CO),56.1(4-OMe),18.9(6-Me),200.3(6-CO)。以上化合物的波譜數據與文獻[15]報道的methyl 6-acetyl-5,7,8-trihydroxy-4-methoxy-2-naphthalenecarboxylate基本一致，故化合物5鑒定為methyl 6-acetyl-5,7,8-trihydroxy-4-methoxy-2-naphthalenecarboxylate。

化合物6：淺黃色粉末；ESI-MSm/z：527.1[M+H]+，C29H34O9；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH:7.12(2H,s),6.96(1H,s),6.58(1H,s),6.34(1H,d,J=10.5 Hz),6.32(1H,s),5.65(1H,d,J=10.5 Hz),3.86(6H,s),3.71(3H,s),3.49(1H,d,J=17.5 Hz),2.74(1H,d,J=17.5 Hz),2.29 (1H,dt,J=13.5,3.0 Hz),1.96 (1H,td,J=14.0,3.5 Hz),1.74 (1H,dt,J=14.0,3.5 Hz),1.66 (1H,dt,J=13.0,3.5 Hz),1.40(3H,s),1.36(3H,s),1.20(3H,s),1.07(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) δC: 200.9(C-1),123.2(C-2),152.8(C-3),42.1(C-4),79.1(C-4a),25.2(C-5a),28.5(C-6a),80.7(C-6a),162.3(C-7a),98.2(C-8),156.7(C-9),163.2(C-11),97.8(C-11a),26.5(C-12a),74.9(C-12a),56.1(C-12b),23.5(4a-Me),24.8(4β-Me),23.3(6a-Me),21.5(12b-Me),126.6(C-1’),102.5(C-2’,6’),153.2(C-3’,5’),139.4(C-4’),55.3(3’,5’-OMe),60.1(4’-OMe)。以上化合物的波譜數據與文獻[16]報道的territrem B基本一致，故化合物6鑒定為territrem B。

化合物7：淺黃色粉末；ESI-MSm/z：373.1[M+H]+，C21H16N4O3；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH: 10.65(1H,s),9.56(1H,s),8.22(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz),7.87(1H,ddd,J=8.5,8.0,1.5 Hz),7.70(1H,d,J=8.0 Hz),7.60(1H,ddd,J=8.5,8.0,1.0 Hz),7.32(1H,ddd,J=7.5,7.5,1.0 Hz),7.19(1H,dd,J=7.5,1.0 Hz),7.11(1H,ddd,J=7.5,7.5,1.0 Hz),6.93(1H,d,J=8.0 Hz),5.58(1H,m),2.41(2H,m),1.18(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) δC: 169.1(C-1),61.8(C-2),153.0(C-3),146.8(C-4),127.7(C-5),134.7(C-6),127.2(C-7),126.4(C-8),120.1(C-9),158.3(C-10),52.0(C-11),35.9(C-12a),54.7(C-13),176.7(C-14),142.6(C-15),109.9(C-16),129.2(C-17),122.4(C-18),123.8(C-19),130.0(C-20),13.4(C-21)。以上化合物的波譜數據與文獻[17]報道的alantrypinone基本一致，故化合物7鑒定為alantrypinone。

化合物8：淺黃色粉末；ESI-MSm/z：425.1[M+H]+，C24H24O7；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH: 10.53(1H,s),9.93(1H,s),9.14(1H,s),7.51(2H,d,J=8.5 Hz),6.88(2H,d,J=8.5 Hz),6.53(1H,d,J=8.0 Hz),6.48(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz),6.38(1H,d,J=2.0 Hz),5.01(1H,m),3.74(3H,s),3.37(2H,s),3.00(2H,m),1.63(3H,s),1.53(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC: 167.9(C-1),138.1(C-2),126.5(C-3),84.7(C-4),38.1(C-5),169.9(C-6),121.1(C-1’),128.8(C-2’,6’),115.8(C-3’,5’),157.9(C-4’),123.1(C-1’’),130.9(C-2’’),127.5(C-3’’),153.8(C-4’’),114.1(C-5’’),128.4(C-6’’),27.5(C-7’’),122.4(C-8’’),131.4(C-9’’),25.2(C-10’’),17.5(C-11’’),53.5(6-OMe)。以上化合物的波譜數據與文獻[18]報道的butyrolactone I基本一致，故化合物8鑒定為butyrolactone I。

化合物9：棕黃色粉末；ESI-MSm/z：409.2[M+H]+，C24H24O6；1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) δH: 11.03(1H,s),9.17(1H,s),7.62(2H,d,J=8.0 Hz),7.50(2H,dd,J=8.0,8.0 Hz),7.41(1H,t,J=8.0 Hz),6.53(1H,dd,J=8.0 Hz),6.47(1H,dd,J=8.0,2.0 Hz),6.35(1H,d,J=2.0 Hz),5.00(1H,m),3.76(3H,s),3.39(2H,m),2.99(2H,m),1.61(3H,s),1.52(3H,s);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) δC: 167.6(C-1),140.4(C-2),126.5(C-3),84.9(C-4),37.9(C-5),169.6(C-6),130.1(C-1’),127.0(C-2’,6’),128.9(C-3’,5’),129.4(C-4’),123.0(C-1’’),130.9(C-2’’),126.4(C-3’’),153.8(C-4’’),114.1(C-5’’),128.6(C-6’’),27.5(C-7’’),122.3(C-8’’),131.3(C-9’’),17.5(C-10’’),25.5(C-11’’),53.6(6-OMe)。以上化合物的波譜數據與文獻[19]報道的versicolactone B基本一致，故化合物9鑒定為versicolactone B。

2.3 化合物抑菌活性測定

采用96孔板微量稀釋法對化合物抑菌濃度的測試結果顯示，化合物1～9對白念珠菌和大腸埃希菌無明顯抑制效果，化合物5、8和9對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌效果，其中化合物5和8的最低抑菌濃度為100 μg/mL，化合物9的抑菌效果最好，其最低抑菌濃度為50 μg/mL(表1)。

表1 化合物1～9最低抑菌濃度Tab.1 The MIC values of compounds 1～9

3 結論

本文通過對深海來源真菌Aspergillussp.20220129在大米培養基中的次級代謝產物進行研究，共分離并鑒定了9個化合物，抗菌活性測試表明化合物methyl 6-acetyl-5,7,8-trihydroxy-4-methoxy-2-naphthalenecarboxylate(5)、butyrolactone I(8)和versicolactone B(9)對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。化合物5曾從土壤來源的Penicilliumsp.中分離得到，對李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌與金黃色葡萄球菌有一定的抑制活性[15,20]。化合物8是曾從土曲霉中分離的γ-丁烯酸內酯類化合物，具有抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制[18]、抗病毒[19]、抗腫瘤[21-22]和抗細菌[23]活性。化合物9是從內生真菌雜色曲霉KJ801852[19]以及海洋土曲霉[24]中分離鑒定的γ-丁烯酸內酯類化合物，具有良好的抗煙草花葉病毒活性[19]，并可以抑制人胰腺癌細胞PANC-1的增殖[24]。本研究豐富了深海來源曲霉屬真菌的次級代謝產物，為開發利用海洋微生物天然產物資源與尋找藥物先導化合物提供了科學依據。