南美白對蝦肝胰腺蛋白提取方法優化及無水保活環境脅迫對細胞凋亡蛋白的影響

鄭曉嫻 吳嘉鑫 徐德峰 孫力軍 王雅玲 秦小明 范秀萍

摘 要：為提高Western Blotting結果的可靠性，以蛋白溶出率和凝膠電泳蛋白條帶完整性為指標，比較提取液種類、研磨方式、酶抑制劑種類及其體積分數和提取時間對南美白對蝦肝胰腺蛋白提取效果的影響。采用優化后的提取方法獲得高質量蛋白樣品，并采用Western Blotting法分析無水環境脅迫后南美白對蝦肝胰腺組織中細胞凋亡信號通路相關蛋白的表達水平。結果表明：RIPA裂解液作為提取溶劑所得的蛋白溶出率高于水提和磷酸鹽緩沖液，電動勻漿和液氮研磨所得蛋白條帶更完整，4%蛋白酶磷酸酶混合抑制劑能有效抑制肝胰腺內源酶引起的蛋白降解;采用Western Blotting法分析無水保活期間南美白對蝦肝胰腺蛋白，發現低溫誘導休眠的同時會引起細胞輕微凋亡，且凋亡水平呈應激時間依賴性增加，環境脅迫解除后有所回調。

關鍵詞：南美白對蝦;肝胰腺;蛋白提取;保活運輸;細胞凋亡

Optimization of Protein Extraction from Hepatopancreas of Litopenaeus vannamei and Effect of Environmental Stress during Waterless Transportation on Apoptosis-Related Proteins

ZHENG Xiaoxian1， WU Jiaxin1， XU Defeng1，2，*， SUN Lijun1， WANG Yaling1， QIN Xiaoming1， FAN Xiuping1

（1.Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Food， Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety， College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China;

2.Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， China）

Abstract： In the present study， in order to improve the reliability of Western blotting results， the effects of extraction buffers， grinding methods， inhibitor type and concentration， and extraction time on protein extraction from the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei were explored by considering protein dissolution rate and the completeness of protein bands in electrophoretic gels. Next， the expression levels of apoptosis-related proteins in the hepatopancreas of Litopenaeus vannamei were detected with Western blotting. The results showed that the protein dissolution rate was higher using RIPA lysis buffer compared with phosphate buffer saline （PBS） or water as the extraction solvent. Electric homogenization and liquid nitrogen grinding provided more complete protein bands. The degradation of proteins by endogenous proteases was obviously suppressed by addition of 4% protease and phosphatase inhibitor cocktail. In addition， Western blotting results revealed that in addition to inducing Litopenaeus vannamei into dormancy， low temperatures induced slight apoptosis in the hepatopancreas tissue. Furthermore， the apoptosis level increased with waterless duration and this effect was alleviated after removal of environmental stress.

Keywords： Litopenaeus vannamei; hepatopancreas; protein extraction; live transportation; apoptosis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018

中圖分類號：TS254.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2022）06-0009-07FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

引文格式：

鄭曉嫻， 吳嘉鑫， 徐德峰， 等. 南美白對蝦肝胰腺蛋白提取方法優化及無水保活環境脅迫對細胞凋亡蛋白的影響[J].

肉類研究， 2022， 36（6）： 9-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHENG Xiaoxian， WU Jiaxin， XU Defeng， et al. Optimization of protein extraction from hepatopancreas of Litopenaeus vannamei and effect of environmental stress during waterless transportation on apoptosis-related proteins[J]. Meat Research， 2022， 36（6）： 9-15. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220315-018.? ? http：//www.rlyj.net.cn

南美白對蝦是我國沿海地區最受歡迎的水產養殖品種之一，其養殖產量位居我國對蝦養殖首位[1]。近年來，隨著南美白對蝦養殖面積及養殖產量的不斷攀升以及消費者對水產品品質要求的提高，人們更青睞于消費鮮活水產品，因而帶動了水產品活體運輸業的發展[2-3]。

在低溫無水保活運輸過程中，南美白對蝦易受到低溫、缺氧、空氣暴露及機械振動等環境因素的影響，引起一系列生理應激[4]。當對蝦處于應激狀態時，機體通過細胞凋亡來清除損傷細胞，而細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，分為線粒體介導的內源性凋亡和死亡受體介導的外源性凋亡[5-6]。在機體響應外界環境脅迫時，促凋亡B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族中的Bax蛋白被激活并遷移到線粒體外膜，降低線粒體膜電位，使線粒體膜通透性增加，而細胞色素C被釋放到胞質中，促進凋亡小體的形成，進而啟動細胞凋亡;同時Caspase家族中的啟動者（Caspase-9蛋白）和執行者（Caspase-3蛋白）被連續激活，最終導致細胞凋亡[7]。此外，Caspase-3的活化會進一步水解胞內蛋白，引起細胞骨架分子降解，導致肌肉軟化及持水性下降，影響食用口感，對水產品保活運輸業造成巨大的經濟損失[8-9]。因此，明確細胞凋亡規律及其機制對提升水產動物保活質量具有十分重要的理論和現實意義。

肝胰腺作為甲殼類動物生理代謝的重要器官之一，擔負著消化酶的分泌、生理調節、防御及造血等功能，是響應外界環境脅迫的關鍵器官[10-12]，因此可以作為評價保活流通過程細胞凋亡水平的靶組織。此外，蛋白質作為生命活動的功能執行者，在機體應答環境生物或非生物脅迫、調控內穩態平衡、維持個體存活等方面發揮至關重要的作用。楊明等[13]研究低氧脅迫期間日本沼蝦鰓、肝胰腺及肌肉組織中抗氧化酶活力變化，發現與其他組織相比，肝胰腺抗氧化酶活力變化更明顯。本課題組前期研究證明，無水保活流通過程中南美白對蝦應答急冷和無水暴露雙重脅迫時肝胰腺氧化與免疫防御、生理代謝調節系統均發生了顯著變化，且肝胰腺組織超微結構發生了明顯的結構損傷[14-16]，提示肝胰腺蛋白特異性變化可作為判斷機體早期生理功能變化的輔助指標，而獲取高質量肝胰腺蛋白樣品是后續蛋白分析的前提。

但對蝦肝胰腺組織柔軟、水分含量高、富含絲氨酸蛋白酶等內源性蛋白酶[17-21]，因此研磨時內源性蛋白酶的溶出會造成蛋白質快速降解。前期實驗表明，經典的組織/細胞蛋白提取法在對蝦肝胰腺蛋白提取過程中存在提取不充分和提取過程快速降解的典型問題[22-23]，而適用于對蝦肝胰腺蛋白的高質量提取方法鮮見系統報道。為此，本研究針對肝胰腺蛋白提取過程中可能誘發組織蛋白降解的典型環境和操作因子，以蛋白溶出率和蛋白完整性為評價指標，依次考察提取液種類、研磨方式、抑制劑種類及其體積分數、提取時間對肝胰腺蛋白提取效果的影響，旨在優化南美白對蝦肝胰腺蛋白提取方法，為后續在蛋白質水平上解析機體應答環境脅迫的生理調控機制提供高質量蛋白樣品。并在此基礎上，采用Western Blot方法研究對蝦在無水保活流通過程中的凋亡進展規律，為靶向提升對蝦存活質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦購于廣東省湛江市霞山水產品批發市場。將鮮活的南美白對蝦充氧保活運回實驗室，之后迅速放入1 m3新鮮海水中暫養12 h，水溫（23±1） ℃，pH 7.69±0.50，增氧泵連續曝氧，期間不投放餌料。

挑選大小、顏色均一、無機械性損傷且狀態良好的對蝦進行實驗。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、考馬斯亮藍染色液、考馬斯亮藍脫色液、增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒 上海碧云天生物技術公司;BCA蛋白定量分析試劑盒、預染蛋白Marker 美國Thermo Scientific公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrohoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒 陜西中暉赫彩生物醫藥科技有限公司;Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9單克隆抗體 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設備

3-30KS高速冷凍離心機 德國Sigma公司;Varioskan Flash全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技有限公司;GelDoc XR+凝膠成像系統、Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳系統 美國Bio-Rad公司;塑料周轉箱（490 mm×345 mm×285 mm） 東莞市茶山中距塑膠卡板廠。FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

1.3 方法

1.3.1 南美白對蝦肝胰腺蛋白提取流程

參照Luo Zhizhan等[24]方法，選用暫養12 h的南美白對蝦進行肝胰腺蛋白提取方法優化，實驗流程如圖1所示。稱取200 mg研磨均勻的對蝦肝胰腺組織，加入1 mL含酶抑制劑的提取液后置于冰上提取一段時間，期間多次振蕩混勻。取出后于4 ℃、14 000 r/min離心15 min，去除上層懸浮液和下層沉淀，收集澄清液即肝胰腺蛋白提取液，于-20 ℃冰箱中短暫保存。

肝胰腺蛋白提取的主要影響因素為提取液種類（水、RIPA裂解液和PBS）、研磨方式（研缽研磨、電動勻漿機勻漿、液氮研磨）、酶抑制劑種類及其體積分數（PMSF：0.5%、1.0%、2.0%;蛋白酶磷酸酶混合抑制劑：2%、4%、6%）、提取時間（30、60、120、180 min），

以蛋白溶出率和SDS-PAGE蛋白條帶完整性為指標，依次考察上述4 個因素對肝胰腺蛋白提取效果的影響，確定南美白對蝦肝胰腺蛋白提取的最佳工藝參數。

本研究使用的蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物為50×的儲備液商品，使用時按照需求分別以體積比1∶50、2∶50、3∶50加入裂解液中，體積分數分別為2%、4%和6%。同樣，所使用的PMSF為100×的儲備液，按照需求以不同比例加入裂解液中。

1.3.2 南美白對蝦肝胰腺蛋白溶出率測定

參照代佳和等[25]的方法，采用BCA法測定不同處理條件下肝胰腺蛋白的溶出量，以牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）為標準蛋白，在562 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為y=0.001 3x+0.176 3（R2=0.997），其中y為蛋白質量濃度，x為吸光度。按式（1）計算肝胰腺蛋白溶出率。

（1）

式中：ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）;V為待測溶液體積/mL;n為待測體積稀釋倍數;m為肝胰腺樣品質量/g。

1.3.3 蛋白完整性分析

參照許倩倩等[26]方法，對肝胰腺蛋白進行SDS-PAGE。將上述提取的肝胰腺總蛋白與上樣緩沖液混合后于沸水浴中變性5 min，每個泳道蛋白上樣量為200 ?g，上樣體積20 ?L，80 V電泳30 min后，120 V繼續電泳至結束。將凝膠置于考馬斯亮藍染色液中搖床染色2 h，回收考馬斯亮藍染色液，加入脫色液脫色至背景透明后進行凝膠電泳成像。

1.3.4 南美白對蝦分組及處理

預先準備3 個塑料周轉箱，并連續編號。按照本課題組前期實驗方法[27]，將暫養12 h后的南美白對蝦分為3 組，每組120 條，其中1 組放入含有新鮮海水的1號箱中作為正常對照（normal control，NC）組，其余2 組分別放入含有（12±1） ℃海水的2號和3號箱中低溫誘導休眠。觀察對蝦的活動狀態，至側倒、腹肢無明顯擺動、觸及反應微弱后撈出，2號箱中對蝦為急性冷應激（acute cold，AC）組。3號箱中對蝦分裝于塑料密封袋中，每袋10 只，共12 袋，排出袋內空氣后充氧密封，放入12 ℃層析柜中模擬無水保活運輸（waterless duration，WD）。

將保活3、6、9 h，及保活9 h后放入常溫海水中復蘇（recover，R）2 h的對蝦分別記為WD3h、WD6h、WD9h、WD9h+R組。

1.3.5 肝胰腺中細胞凋亡相關蛋白表達測定

采用優化后的蛋白提取方法，分別提取NC組、AC組、WD3h組、WD6h組、WD9h組及WD9h+R組對蝦肝胰腺蛋白。按照Luo Zhizhan等[24]的方法，采用Western Blot法檢測肝胰腺中細胞凋亡相關蛋白的表達。BCA試劑盒測定各組的蛋白質量濃度后取等量蛋白樣品上樣，SDS-PAGE分離蛋白組分，濕轉法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，7 g/100 mL脫脂牛乳封閉，TBST緩沖液洗膜。然后加入一抗（Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3），4 ℃孵育過夜，并回收對應的一抗;之后加入二抗，室溫搖床孵育2 h，ECL顯色，最后將目標條帶放入發光型凝膠成像系統照相，采用Image J軟件進行條帶的灰度值分析，以β-actin為內參，定量分析目標蛋白的相對表達水平。各目標蛋白的相對表達量按式（2）計算。

（2）

1.4 數據處理

所有實驗設置3 次重復，結果用平均值±標準差表示。采用SPSS 25軟件進行差異統計分析，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。實驗結果用GraphPad Prism 8和Power Point軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦肝胰腺蛋白提取方法優化

2.1.1 提取液種類對肝胰腺蛋白提取效果的影響

目前，常用于組織蛋白提取的方法有PBS提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、裂解液提取法等[28]，其中PBS提取法和裂解液提取法在甲殼類動物肝胰腺蛋白的提取中多有報道[29-32]。本實驗以水作為對照，采用PBS和RIPA裂解液分別提取對蝦肝胰腺中的蛋白。

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。圖3～5同。

由圖2可知，RIPA裂解液提取所得的蛋白溶出率最高，為（54.63±0.67）%，而PBS組與對照組（水）之間無統計學差異。不同提取液提取所得的蛋白經電泳染色后結果如圖2B所示，與PBS相比，RIPA裂解液提取所得的蛋白條帶更清晰，在60～130 kDa處條帶更清晰、數量更多。RIPA裂解液更利于組織中蛋白的釋放，蛋白總體提取效果優于PBS組。因此確定肝胰腺蛋白最佳提取液為RIPA裂解液。

2.1.2 研磨方式對肝胰腺蛋白提取效果的影響FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

目前，動物組織研磨破碎的方法主要有超聲破碎法、玻璃珠勻漿法、機械研磨法和液氮研磨法等[26]，可進一步將其分為勻漿法和研磨法兩大類。采用電動勻漿機和液氮研磨提取動物組織蛋白已多有報道[28，33-34]。因此，本研究以研缽研磨為對照，選取較有代表性的電動勻漿機勻漿和液氮研磨2 種方法進行比較實驗。

由圖3可知，電動勻漿法所得的蛋白溶出率最高，達到（63.82±0.62）%，與液氮研磨的蛋白溶出率有極顯著差異，可能是因為電動勻漿機是將肝胰腺組織勻漿成液態，使樣品與裂解液充分接觸，更利于蛋白的溶出。電動勻漿法和液氮研磨法在40 kDa以上的蛋白完整性明顯優于研缽研磨。其中液氮研磨法所得的蛋白在55 kDa和70～100 kDa處的清晰度和條帶數量略高于電動勻漿法，可能是因為液氮的超低溫將組織迅速凍結，保護蛋白不被破壞或降解，但二者差異并不明顯。根據上述結果，確定肝胰腺蛋白最佳研磨方式為電動勻漿機勻漿法。

2.1.3 抑制劑種類及其體積分數對肝胰腺蛋白提取效果的影響

溫度的回升會激活對蝦肝胰腺中的內源酶，極易造成蛋白質的降解和去修飾，影響后續蛋白的檢測[35]。因此，低溫環境和添加酶抑制劑是抑制蛋白酶活性的主要措施。PMSF是一種絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑，是組織蛋白提取過程常用的蛋白酶典型抑制劑。蛋白酶磷酸酶混合抑制劑（以下分析簡稱為混合抑制劑）包含廣譜的絲氨酸、半胱氨酸和酸性蛋白酶等抑制劑。

由圖4可知，與PMSF組相比，混合抑制劑組的蛋白溶出率和蛋白完整性明顯更優，其中以體積分數4%混合抑制劑組的蛋白溶出率最高，可達（62.39±0.76）%，但其蛋白條帶與6%混合抑制劑組無差異，同時2%混合抑制劑組在35～60 kDa處的蛋白條帶清晰度略差，提示蛋白可能發生降解。因此確定肝胰腺蛋白最佳抑制劑為體積分數4%混合抑制劑。

2.1.4 提取時間對肝胰腺蛋白提取效果的影響

由圖5可知，提取時間延長有利于肝胰腺蛋白的溶出。當冰上提取時間達120 min時蛋白溶出率達到最大，繼續延長提取時間，蛋白溶出率略有下降但變化不顯著。不同提取時間所得的蛋白條帶之間無明顯差異，且蛋白完整、豐度較高。除此之外，樣品的貯藏條件對肝胰腺蛋白的提取也有一定的影響。前期實驗分別提取當天和低溫放置一段時間后的蛋白樣品，發現蛋白樣品放置的時間越長，貯藏溫度越高，其蛋白降解程度越大，蛋白豐度顯著降低，該結果再一次表明對蝦肝胰腺組織的獨特性。結合前期實驗，推測繼續延長提取時間可能會降低蛋白溶出率，誘發肝胰腺中蛋白酶激活進而導致蛋白降解。因此，出于對蛋白溶出率和蛋白完整性的綜合考慮，確定肝胰腺蛋白最佳提取時間為120 min。同時應盡可能保持全程環境低溫，使用新鮮的肝胰腺，且蛋白提取后應盡快完成后續測定。

2.2 低溫無水保活期間南美白對蝦細胞凋亡信號通路

蛋白表達水平變化

A.免疫印跡圖;B～F. Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3表達水平;與NC組相比，*. P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001，****. P<0.000 1。

采用Western blotting技術檢測線粒體凋亡信號通路中起關鍵作用的主要蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9）。由圖6可知，與NC組相比，低溫誘導休眠（AC組）使Caspase-3蛋白表達水平顯著上調

（P<0.000 1），Bcl-2蛋白的表達水平有所上調但不顯著。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中的重要一員，可與促凋亡蛋白（如Bax）結合，抑制細胞凋亡，在抗凋亡過程中起積極作用[36]。AC組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平的變化說明在單一的低溫脅迫過程中，對蝦受到冷應激，激活凋亡的關鍵執行者Caspase-3，并通過上調Bcl-2蛋白的表達抑制凋亡信號通路活化。AC組的凋亡指數（Bax/Bcl-2）并未明顯變化，可能是由于低溫誘導休眠階段的時間較短，并不足以徹底激活細胞凋亡信號通路。在WD組中，Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達水平及凋亡指數不斷升高，WD6h組達到峰值后有所下降，說明對蝦在無水保活期間由于低溫及空氣暴露等多種脅迫，細胞凋亡信號通路已被完全激活，WD9h組對蝦肝胰腺細胞凋亡現象的減弱可能源于機體的抗氧化及免疫防疫系統的充分激活。環境脅迫解除后Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達水平及Bax/Bcl-2均恢復到正常水平。與NC組相比，WD9h+R組Bcl-2蛋白的表達水平有所回升但未能恢復至正常水平，可能源于環境脅迫后Bcl-2與Bax之間的結合被解離，Bcl-2被迅速降解，顯著降低了Bcl-2蛋白的表達水平。

環境脅迫造成的氧化應激是觸發機體細胞凋亡的主要誘因，生物體在應激狀態下會積累過量的氧自由基，引起多不飽和脂肪酸等生物大分子發生過氧化，產生丙二醛（malondialdehyde，MDA），其含量通常用來評價機體的氧化損傷程度[37]。黎一鳴等[38]利用TUNEL法分析肝細胞的凋亡情況，發現肝細胞MDA含量與細胞凋亡率呈正相關。細胞凋亡水平除了可以側面反映生物體的

氧化應激水平，還能反映細胞結構損傷程度。團隊前期研究[11-12，15]發現，南美白對蝦在受到AC+WD脅迫時，肝胰腺組織中的MDA含量顯著升高，在保活3 h達到最高值后隨著保活時間的延長有所下降，且肝胰腺組織的病理性損傷程度呈時間依賴性增大，而在AC組中未發現明顯異常，在急性冷應激及無水脅迫的交互作用下，對蝦的氧化應激及肝胰腺組織病理性損傷程度隨保活時間的延長而加劇，該結果與本實驗細胞凋亡水平具有相似的變化趨勢，提示細胞凋亡與機體應激損傷及組織損傷密切相關。

3 結 論FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

對南美白對蝦肝胰腺蛋白提取方法進行優化后，得到最佳提取條件為RIPA裂解液、電動勻漿機勻漿、4%蛋白酶磷酸酶混合抑制劑、提取60 min，在此條件下提取得到的肝胰腺蛋白溶出率可達（74.83±1.67）%，經SDS-PAGE分離，蛋白條帶清晰、完整。蛋白免疫分析進一步表明，肝胰腺中凋亡通路相關蛋白的表達水平在短時間低溫脅迫誘導下顯著上調，復蘇后凋亡減輕，提示細胞凋亡信號通路介導了對蝦保活流通過程中環境脅迫誘導的機體傷殘或死亡。

參考文獻：

[1] 中國水產學會. 2020中國漁業統計年鑒[M]. 北京： 中國農業出版社， 2020： 26-28.

[2] 董麗君， 孟憲紅， 孔杰， 等. 基于轉錄組分析篩選凡納濱對蝦低溫脅迫下的差異表達基因[J]. 中國水產科學， 2019， 26（1）： 161-171. DOI：10.3724/SP.J.1118.2019.18061.

[3] 管維良. 南美白對蝦無水保活及其生化和肉質的應激響應[D].

杭州： 浙江大學， 2021： 1-7. DOI：10.27461/d.cnki.gzjdx.2021.001224.

[4] KOOLHAAS J M， BARTOLOMUCCI A， BUWALDA B， et al. Stress revisited： a critical evaluation of the stress concept[J]. Neuroscience and Biobehavioral Reviews， 2011， 35（5）： 1291-1301. DOI：10.1016/j.neubiorev.2011.02.003.

[5] SAMALI A， FULDA S， GORMAN A M， et al. Cell stress and cell death[J]. International Journal of Cell Biology， 2010， 2010： 245803. DOI：10.1155/2010/245803.

[6] CARNEIRO B A， EL-DEIRY W S. Targeting apoptosis in cancer therapy[J]. Nature Reviews Clinical Oncology， 2020， 17： 395-417. DOI：10.1038/s41571-020-0341-y.

[7] ZHANG Han， HUANG He， ZHENG Peng， et al. The alleviative effect of thyroid hormone on cold stress-induced apoptosis via HSP70 and mitochondrial apoptosis signal pathway in bovine Sertoli cells[J]. Cryobiology， 2022， 105： 63-70. DOI：10.1016/j.cryobiol.2021.11.181.

[8] JANEWANTHANAKUL S， SUPUNGUL P， TANG S， et al. Heat shock protein 70 from Litopenaeus vannamei （Lv HSP70） is involved in the innate immune response against white spot syndrome virus （WSSV） infection[J]. Developmental and Comparative Immunology， 2020， 102： 103476. DOI：10.1016/j.dci.2019.103476.

[9] LANA A， ZOLLA L. Apoptosis or autophagy， that is the question： two ways for muscle sacrifice towards meat[J]. Trends in Food Science and Technology， 2015， 46（2）： 231-241. DOI：10.1016/j.tifs.2015.10.001.

[10] MENG Xianliang， JAYASUNDARA N， Zhang Jingyan， et al. Integrated physiological， transcriptome and metabolome analyses of the hepatopancreas of the female swimming crab Portunus trituberculatus under ammonia exposure[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2021， 228： 113026. DOI：10.1016/j.ecoenv.2021.113026.

[11] XU Defeng， WU Jiaxin， SUN Lijun， et al. Combined stress of acute cold exposure and waterless duration at low temperature induces mortality of shrimp Litopenaeus vannamei through injuring antioxidative and immunological response in hepatopancreas tissue[J]. Journal of Thermal Biology， 2021， 100： 103080. DOI：10.1016/j.jtherbio.2021.103080.FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

[12] XU Defeng， WU Jiaxin， SUN Lijun， et al. Energy metabolism response of Litopenaeus vannamei to combined stress of acute cold exposure and waterless duration： implications for physiological regulation and waterless live transport[J]. Journal of Thermal Biology， 2022， 104： 103149. DOI：10.1016/j.jtherbio.2021.103149.

[13] 楊明， 孫盛明， 傅洪拓， 等. 低氧和復氧對日本沼蝦抗氧化酶活力及組織結構的影響[J]. 中國水產科學， 2019， 26（3）： 493-503. DOI：10.3724/SP.J.1118.2019.18285.

[14] HAN Siyin， WANG Mengqiang， LIU Mei， et al. Comparative sensitivity of the hepatopancreas and midgut in the white shrimp Litopenaeus vannamei to oxidative stress under cyclic serious/medium hypoxia[J]. Aquaculture， 2018， 490（1）： 44-52. DOI：10.1016/j.aquaculture.2018.02.021.

[15] XU Defeng， WU Jiaxin， SUN Lijun， et al. Antioxidative and immunological response of shrimp Litopenaeus vannamei to combined stress of acute cold exposure and waterless duration： implications for live transport[J]. Aquaculture Research， 2022， 53（3）： 1026-1039. DOI：10.1111/are.15644.

[16] 徐德峰， 吳嘉鑫， 孫力軍， 等. 急冷與空氣暴露聯合脅迫對凡納濱對蝦生理代謝影響[J]. 廣東海洋大學學報， 2022， 42（1）： 1-10. DOI：10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.004.

[17] SENPHAN T， BENJAKUL S. Use of the combined phase partitioning systems for recovery of proteases from hepatopancreas of Pacific white shrimp[J]. Separation and Purification Technology， 2014， 129： 57-63. DOI：10.1016/j.seppur.2014.03.025.

[18] SENPHAN T， BENJAKUL S. Compositions and yield of lipids extracted from hepatopancreas of Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei） as affected by prior autolysis[J]. Food Chemistry， 2012， 134（2）： 829-835. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.02.188.

[19] SRIKET C， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W. Characterisation of proteolytic enzymes from muscle and hepatopancreas of fresh water prawn （Macrobrachium rosenbergii）[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2011， 91（1）： 52-59. DOI：10.1002/jsfa.4145.

[20] MEUNPOL O， HALL M R， KAPOOR V. Partial characterization and distribution of kynurenine aminotransferase activity in the Black Tiger prawn （Penaeus monodon）[J]. Comparative Biochemistry and Physiology B， 1998， 120（1）： 139-143. DOI：10.1016/s0305-0491（98）10002-0.

[21] ZHAN Wenbin， WANG Xiaojie， CHEN Jing， et al. Elimination of shrimp endogenous alkaline phosphatase background and development of enzyme immunoassays for the detection of white spot syndrome virus （WSSV）[J]. Aquaculture， 2004， 239（1）： 15-21. DOI：10.1016/j.aquaculture.2004.05.042.FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

[22] 吳嘉敏， 姜新耀. 中華絨螯蟹血淋巴和肝胰腺的總蛋白含量與性早熟的關系[J]. 水產學報， 2000， 24（4）： 306-307. DOI：10.3321/j.issn：1000-0615.2000.04.003.

[23] 孟永海， 王欣慰， 史連宏， 等. 三種大鼠肌肉組織蛋白提取方法的比較研究[J]. 哈爾濱商業大學學報（自然科學版）， 2015， 31（6）： 661-670. DOI：10.19492/j.cnki.1672-0946.2015.06.006.

[24] LUO Zhizhan， HUANG Wen， WANG Guoxia， et al. Identification and characterization of p38 MAPK in response to acute cold stress in the gill of Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei）[J]. Aquaculture Reports， 2020， 17： 100365. DOI：10.1016/j.aqrep.2020.100365.

[25] 代佳和， 羅旋飛， 史崇穎， 等. 響應面法優化辣木葉中水溶性蛋白提取工藝研究[J]. 云南農業大學學報（自然科學）， 2020， 35（1）： 130-138. DOI：10.12101/j.issn.1004-390X（n）.201805050.

[26] 許倩倩， 滕夏虹， 郝彥利， 等. 不同提取方法對小鼠海馬AD相關蛋白電泳的影響[J]. 神經解剖學雜志， 2018， 34（4）： 491-496. DOI：10.16557/j.cnki.1000-7547.2018.04.013.

[27] 徐德峰， 王雅玲， 孫力軍， 等. 降溫及生態冰溫條件對凡納濱對蝦無水存活時間的影響[J]. 廣東海洋大學學報， 2019， 39（6）： 101-107. DOI：10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.013.

[28] 朱黎娜， 侯麗英， 張盈瑩， 等. 不同方法提取和處理中華絨螯蟹組織蛋白的過敏原組分分析[J]. 中國免疫學雜志， 2014， 30（12）： 1652-1657. DOI：10.3969/j.issn.1000-484X.2014.12.014.

[29] 秦兆宇， 劉師蓮， 宋春華， 等. 中國對蝦肝胰腺蛋白質組學雙向電泳技術體系的建立[J]. 生物醫學工程研究， 2007， 26（1）： 80-83. DOI：10.3969/j.issn.1672-6278.2007.01.020.

[30] 章躍陵， 卓奕明， 朱永飛， 等. 南美白對蝦人工感染細菌后肝胰臟中主要變化蛋白的研究[J]. 水產科學， 2005， 24（6）： 19-23. DOI：10.3969/j.issn.1003-1111.2005.06.007.

[31] FAN Lanfen， WANG Anli， MAO Yuntao， et al. Comparative proteomic identification of the hepatopancreas response to cold stress in white shrimp， Litopenaeus vannamei[J]. Aquaculture， 2015， 454： 27-34. DOI：10.1016/j.aquaculture.2015.10.016.

[32] 徐洲， 母昌考， 李榮華， 等. 交配與未交配三疣梭子蟹肝胰腺蛋白質組學的初步分析[J]. 寧波大學學報（理工版）， 2013， 26（4）： 1-6.

[33] 趙永強， 李娜， 李來好， 等. 尼羅羅非魚肌肉蛋白質雙向電泳體系的建立[J]. 水產學報， 2016， 40（10）： 1648-1656. DOI：10.11964/jfc.20151010109.

[34] 朱佳杰， 沈夏霜， 付強， 等. 吉富羅非魚肝臟蛋白質組雙向電泳技術的建立與優化[J]. 西南農業學報， 2013， 26（5）： 2122-2126. DOI：10.16213/j.cnki.scjas.2013.05.085.

[35] 銀鳳， 周愛梅， 張祥剛， 等. 南美白對蝦蝦頭主要自溶酶的分離純化及鑒定[J]. 食品與發酵工業， 2011， 37（3）： 23-26. DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2011.03.004.

[36] SINGH R， LETAI A， SAROSIEK K， et al. Regulation of apoptosis in health and disease： the balancing act of Bcl-2 family proteins[J]. Nature Reviews： Molecular Cell Biology， 2019， 20（3）： 175-193. DOI：10.1038/s41580-018-0089-8.

[37] 張玉晗， 謝晶. 低溫休眠預處理對花鱸無水保活效果的影響[J]. 食品科學， 2018， 39（23）： 221-226. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201823033.

[38] 黎一鳴， 徐心， 吉鴻， 等. 肝動脈缺血對肝細胞凋亡的影響及其機制初探[J]. 西安交通大學學報（醫學版）， 2002， 23（4）： 393-394. DOI：10.3969/j.issn.1671-8259.2002.04.021.

收稿日期：2022-03-15

基金項目：“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2019YFD0901601）;國家自然科學基金面上項目（31772048）;

廣東省現代農業產業技術創新團隊項目（2021KJ149）;廣東海洋大學研究生教育創新計劃資助項目（202261）

第一作者簡介：鄭曉嫻（1997—）（ORCID： 0000-0003-4748-8691），女，碩士研究生，研究方向為對蝦保活流通應激損傷

機制與調控。E-mail： zhengxiaoxianzzz@163.com

*通信作者簡介：徐德峰（1978—）（ORCID： 0000-0003-1218-5359），男，教授，博士，研究方向為水產品保鮮保活酶學

機制與海洋資源高值化利用。E-mail： 13827198525@163.comFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE