熊去氧膽酸促進肝癌HepG2細胞凋亡研究

彭 嬌，林久茂，2，3，嚴月華，王雪皎，林明和，張金鳳，趙錦燕，2，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.中西醫結合基礎福建省高校重點實驗室，福建 福州 350122；4.復旦大學附屬浦東醫院，上海 200120）

中醫藥低毒、高效、多靶點的優勢在腫瘤治療中的作用越來越受到國內外學者的關注，尤其是許多中草藥提取物或有效成分均已證實有抗腫瘤功效。熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是名貴中藥熊膽粉的主要成分，是治療原發性膽汁性肝硬化的一線用藥，研究證實UDCA 具有保護肝細胞作用［1-2］。同時也有研究發現UDCA 具有抗肝癌的作用，且在一定劑量范圍內對正常細胞沒有明顯的細胞毒性［3］。UDCA 抗肝癌的作用及機制研究能夠為臨床肝癌用藥提供依據，因此，本研究觀察UD?CA 對肝癌HepG2 細胞（以下簡稱HepG2 細胞）凋亡的影響，探討UDCA 治療肝癌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 UDCA（大連美侖生物技術有限公司，批號：J0324AS，純度＞98%）；胎牛血清（批號：2282182P）、胰酶（批號：2323527）和RPMI-1640 培養液（批號：8122243）均購自美國Life 公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT，德國BIOFROXX 公司，批號：E24567C114）；HepG2 細胞（南京凱基生物技術有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0220-Nov-19G）；JC-1 線粒體膜電位熒光探針（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20210119）；Bcl-2 抗體（美國Protein Tech 公司，批號：00093692）。

1.2 實驗方法

1.2.1 UDCA 藥液的制備 UDCA 經超純水溶解后制備成1 mmol/L 母液，儲存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 HepG2 細胞培養 HepG2 細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養基中，置37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養，細胞匯合度約80%～90%時，用0.25%胰酶消化、傳代培養。收集對數生長期HepG2細胞，分為0 μmol/L 組（對照組）和5 μmol/L 組、10 μmol/L 組（藥物組）。

1.2.3 MTT 法檢測細胞活力 取各組細胞，按照1×104個/孔細胞接種于96 孔板中，每組設8 個復孔；用0、5、10 μmol/L UDCA 藥液干預24 h，吸棄培養基，加入0.5 mg/mL MTT 溶液100 μL，置37 ℃培養箱中繼續孵育4 h；吸棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），于全自動酶標儀570 nm 處檢測每孔吸光度值（A 值），并計算細胞增殖抑制率。

1.2.4 細胞數量、形態觀察 取各組細胞，按照2×105個/mL 細胞接種于6 孔板中，分別用0、5、10 μmol/L UDCA 藥液干預24 h，干預后在倒置光學顯微鏡下觀察細胞數量、形態。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取各組細胞，以2×105個/mL接種于6孔板，置37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養過夜；分別用0、5、10 μmol/L UDCA干預24 h 后，0.25%胰酶（不含EDTA）消化，收集細胞，以1 000 r/min離心5 min，重懸制備單細胞懸液；用1×binding buffer 調整細胞數為1×106個/mL，取100 μL 細胞至5 mL 流式管中，每管加5 μL FITC AnnexinⅤ和5 μL 碘化丙錠溶液（PI），充分混勻后于室溫（25 ℃）避光孵育15 min；然后每管加400 μL 1×binding buffer，1 h 內于流式細胞儀（FL1 和FL2通道）檢測。流式細胞儀檢測結果：左下象限為正常細胞百分比，右下象限是早期凋亡細胞百分比，右上象限是晚期凋亡細胞百分比，左上象限是細胞碎片百分比。

1.2.6 JC-1 染色法檢測細胞線粒體下降的體膜電位 取各組細胞，分別用0、5、10 μmol/L UDCA 干預HepG2 細胞24 h 后，收集細胞，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入JC-1 染色液500 μL（終濃度10 μg/mL）重懸細胞，于37 ℃避光孵育30 min；以1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 反復洗細胞2 次，加入500 μL PBS 重懸細胞，用流式細胞儀檢測線粒體下降的膜電位。儀器參數：激發波長為488 nm，檢測發射波長為590 nm（紅光）和525 nm（綠光）。正常細胞線粒體膜電位用FL2 通道檢測，下降的線粒體膜電位用FL1 通道檢測，用綠色熒光與紅色熒光的比值來表示。

1.2.7 RT-PCR法檢測Bcl-2 mRNA相對表達量 取各組細胞，分別用0、5、10 μmol/L UDCA 干預HepG2細胞24 h 后，Trizol 法提取HepG2 細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，得到cDNA；以管家基因GAPDH 為對照，引物序列利用Primer 5.0 軟件進行設計，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果用Bio-Rad 凝膠成像分析系統進行電泳條帶分析，引物序列及擴增產物片段長度為：Bcl-2（268 bp）F：5′-GGTGGTGGAGGAACTCTTCA-3′；R：5′-GAG CAGCGTCTTCAGAGACA-3′。

1.2.8 Western blot檢測Bcl-2蛋白相對表達水平 取各組細胞，分別用0、5、10 μmol/L UDCA 干預HepG2細胞24 h 后，收集細胞，加入500 μL 含有PMSF 的裂解液裂解細胞，以10 000 r/min 高速離心10 min，收集上清后采用BCA 法進行蛋白定量。各組樣本取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳，條件：濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V。電泳完成后進行轉膜：100 V 條件下45 min將蛋白轉移至PVDF膜上。常溫封閉120 min后，一抗4 ℃孵育過夜。然后將PVDF膜用TBS-T 漂洗3 次×10 min，常溫二抗孵育1 h，再次用TBS-T 漂洗3 次×10 min。使用BeyoECL Plus 化學發光試劑處理PVDF 膜，于化學發光成像系統ChemiDocXRS+下成像。用Image Lab 軟件對蛋白灰度值進行數據分析，以Bcl-2 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值得出Bcl-2 蛋白相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。計量資料服從正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 3 組細胞增殖抑制率比較 與0 μmol/L 組比較，5 μmol/L 組和10 μmol/L 組UDCA 對HepG2 細胞增殖抑制率均顯著升高（P均＜0.05），且UDCA藥物濃度越高抑制率越強。見表1。

表1 3 組細胞增殖抑制率比較（±s）

表1 3 組細胞增殖抑制率比較（±s）

注：與0 μmol/L 組比較，1）P＜0.05。

組別0 μmol/L組5 μmol/L組10 μmol/L組n8 8 8細胞增殖抑制率/%0 44.8±0.031）61.2±0.021）

2.2 3 組細胞數量、形態比較 倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態發現：0 μmol/L 組HepG2 細胞貼壁牢固，細胞邊界清晰，密度較大，懸浮細胞較少；5 μmol/L 組和10 μmol/L 組細胞密度顯著減少，細胞脫落變圓，懸浮細胞相對增加。這說明UDCA 可抑制肝癌細胞生長，促進HepG2細胞死亡。見圖1。

圖1 3 組細胞數量、形態比較（×200）

2.3 3 組細胞凋亡率比較 5 μmol/L組和10 μmol/L組細胞凋亡率分別是（32.67±4.16）%、（60.49±5.60）%，均 明 顯 高 于0 μmol/L 組 細 胞 凋 亡 率（11.59±1.35）%，差異均具有統計學意義（P均＜0.05），且UDCA 藥物濃度越高，細胞凋亡率越大。見圖2。

圖2 3 組細胞凋亡率比較

2.4 3 組線粒體下降的膜電位比較 5 μmol/L 組和10 μmol/L 組線粒體下降的膜電位分別為（29.64±4.16）和（60.49±5.60），均大于0 μmol/L 組線粒體下降的膜電位（18.71±1.35），差異均具有統計學意義（P均＜0.05），且UDCA 藥物濃度越高，線粒體下降的膜電位越大。見圖3。

圖3 3 組線粒體下降的膜電位比較

2.5 3 組細胞Bcl-2 mRNA 相對表達量比較 與0 μmol/L 組比較，5 μmol/L 組和10 μmol/L 組細胞Bcl-2 mRNA 相對表達量均降低（P均＜0.05），且UDCA 藥物濃度越高，細胞Bcl-2 mRNA 相對表達量下降越明顯。見圖4。

圖4 3 組細胞Bcl-2 mRNA 相對表達量比較

2.6 3 組細胞Bcl-2 蛋白相對表達水平比較 與0 μmol/L 組比較，5 μmol/L 組和10 μmol/L 組細胞Bcl-2 蛋白相對表達水平均降低（P均＜0.05），且UDCA 藥物濃度越高，細胞Bcl-2 蛋白相對表達水平下降越明顯。見圖5。

圖5 3 組細胞Bcl-2 蛋白相對表達水平比較

3 討 論

我國因肝癌死亡人數約占全世界肝癌死亡人數45%，是病死率最高的腫瘤之一［4-5］。由于肝癌對放療的敏感性差，而常規化療藥物（如阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑、α 干擾素等）均有其不同的適應證和毒副作用，也不能有效緩解癥狀或延長生命，因此，作為經濟、有效、不良反應輕的中草藥及其提取物的應用備受關注。

UDCA 是最早從黑熊膽汁中分離的膽汁酸，研究發現UDCA 能護肝細胞，對膽管炎、潰瘍性結腸炎、膽汁淤積癥和病毒性肝炎等均有療效［6-9］。細胞凋亡異常是腫瘤發生的重要原因［10-12］。本研究結果顯示UDCA 可促進HepG2 線粒體膜電位下降，促進肝癌細胞凋亡。Bcl-2 家族是與細胞凋亡密切相關的基因，其中Bcl-2 是最早發現的參與細胞凋亡的一種癌基因，在惡性腫瘤的發生、發展中起重要作用，其表達產物Bcl-2 蛋白具有抗凋亡作用［13-14］。本研究結果顯示UDCA能下調Bcl-2 mRNA相對表達量和蛋白相對表達水平，證實UDCA 能抑制Bcl-2 表達，促進肝癌細胞凋亡，且藥物濃度越高，UDCA 促進肝癌細胞凋亡作用越強。

綜上所述，UDCA 能夠抑制HepG2 細胞Bcl-2表達，通過誘導線粒體膜電位下降，促進細胞凋亡，這可能是其抑制HepG2 細胞生長的重要機制。