補腎活血顆粒對自然衰老大鼠骨骼肌組織的保護作用

訾 勇，張楚天，羅 燕，李茜羽，姚淑紅，陳小倩，蔡 晶*

（1.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350108；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122）

當今中國已經步入了老齡化階段，是全球老年人口最多的國家［1］。隨著老齡化趨勢不斷加快，給我國社會和經濟發展帶來了巨大挑戰［2-3］。衰老主要表現為骨骼肌肉量、肌肉力量和（或）功能逐漸喪失，即與年齡有關的肌少癥，是目前衰老機制研究熱點［4］。沉默信息調節因子2 相關酶（SIRT）是機體內重要的能量代謝感受器［5］，與細胞衰老等密切相關。SIRT1 是SIRT 家族重要成員之一，叉頭框轉錄因子O3（FoxO3）是SIRT1 底物之一，二者在抑制衰老和骨骼肌萎縮機制中具有重要作用。腎虛血瘀是老年疾病的重要發病機制［6］，蔡晶教授臨床經驗方補腎活血顆粒在老年衰弱的治療方面取得較好療效，故本研究探討補腎活血顆粒對衰老大鼠骨骼肌細胞保護作用。

1 實驗材料

1.1 藥物 補腎活血顆粒由肉蓯蓉、制黃精、丹參、淫羊藿組成，由福建中醫藥大學附屬第三人民醫院中藥房提供。

1.2 實驗動物 實驗選用8 周齡SD 大鼠（SPF 級）10 只，雌雄各半，雄性體質量（275±10）g，雌性體質量（202±3）g；雄性12 月齡SD 大鼠（SPF 級）10 只，體質量（845±125）g，雌性大鼠10 只，體質量（425±65）g。實驗動物由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2019-0002，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SKYX（閩）：2019-0007。本研究的動物實驗操作嚴格按照動物試驗相關規定進行，并經福建中醫藥大學附屬第三人民醫院動物倫理委員會審核批準。

1.3 主要試劑與儀器 病理切片機（德國Leica 公司，型號：RM2016）；正置光學顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：Nikon Eclipse E100）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，型號：G1005）；酶標儀（雷杜生物科技有限公司，型號：Rayto RT-6100）；圖像分析軟件（Adobe 圖像軟件設計公司，型號：Adobe PhotoShop）；ECL 顯影成像試劑盒、GAPDH抗體、HRP 標記山羊抗兔（武賽維爾生物有限科技公司，批號：G2014、GB12002、GB23301）；SIRT1 抗體（美國Affinity 公司，批號：DF6033）；FoxO3 抗體（美國Immunoway 公司，批號：YT1763）；大鼠去乙酰化酶（SIRT1）ELISA 試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，貨號：ml058817，批號：11/2020）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 將20 只12 月齡SD 大鼠隨機分為自然衰老組及補腎活血顆粒組各10 例，以10 只3 月齡大鼠作為青年對照組。自然衰老組大鼠進行自然衰老模型復制，參照文獻［7-8］，主要表現為抗應激能力、免疫功能以及學習記憶功能的減退等符合人類衰老指征時，說明造模成功。根據人-鼠體表面積比換算公式，計算出大鼠每日補腎活血顆粒服量為3.71 g/kg，將補腎活血顆粒用100 ℃純凈水配置成371 mg/mL含藥溶液，以10 mL/（kg·d）灌胃，每周連續6 d，停藥1 d，持續6 個月。青年對照組及自然衰老組未予任何干預。

2.2 大鼠腓腸肌組織形態學觀察 末次給藥后大鼠腹腔注射20%烏拉坦5～7 mL/kg 麻醉后，處死，快速取出腓腸肌組織，部分標本保存于-80 ℃冰箱以備檢測。剩余標本石蠟切片脫蠟至水，按序將切片置入二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ20 min，無水乙醇Ⅰ5 min，無水乙醇Ⅱ5 min，75%酒精5 min，自來水洗；再次蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍，水洗；繼以伊紅染色，切片按序酒精脫水，置入伊紅染液染色5 min。封片后在光學顯微鏡下觀察大鼠腓腸肌組織形態學。

2.3 Western blot 檢測大鼠腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白相對表達量 取冰箱中腓腸肌組織，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳，采用PVDF 轉膜，加入相應一抗GAPDH（1∶1000）、FoxO3（1∶500）、SIRT1（1∶500）后孵育過夜；后置于相應二抗中再次孵育，ECL 顯影成像，使用Alpha 軟件處理系統分析蛋白條帶的光密度值，內參為GAPDH，相對蛋白表達量水平為目標蛋白條帶灰度值/GAP?DH。

2.4 ELISA 法檢測大鼠腓腸肌SIRT1 去乙酰化酶活性 稱取大鼠腓腸肌組織按體質量（mg）∶體積（μL）＝1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，在冰水浴條件下，機械勻漿，制備成10%勻漿液，以2 500~3 000 r/min 離心10 min，按照SIRT1 去乙酰化酶活性試劑盒說明書進行操作。

2.5 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，2 組比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Game's Howell 檢驗。

3 結 果

3.1 3 組大鼠腓腸肌組織形態學比較 青年對照組大鼠肌纖維呈紅色，肌纖維外膜清晰，肌纖維間細胞外基質較少，細胞核偏小但規則，多分布在肌纖維周圍，細胞外纖維成分及其他細胞成分含量較少；自然衰老組大鼠肌纖維變性數目明顯增多，細胞呈現淡染，肌纖維間質中淡紅色膠原纖維成分顯著增加，肌纖維間結締組織成分明顯增多，血管管腔顯著變??；補腎活血顆粒組大鼠肌纖維外膜為皺縮狀態，部分肌細胞細胞核表現出腫脹，分布在細胞中央，細胞外纖維成分稍增加，而且見少量深染色、體積小炎性細胞。見圖1。

圖1 3 組大鼠腓腸肌組織形態學HE 染色圖（×400）

3.2 3 組大鼠腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白相對表達量比較 見圖2。

圖2 3 組大鼠Western Blot 檢測腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白表達

3.3 3 組大鼠腓腸肌SIRT1 去乙?；富钚运奖容^ 見表1。

表1 3 組大鼠腓腸肌SIRT1去乙?；富钚运奖容^（±s）

表1 3 組大鼠腓腸肌SIRT1去乙?；富钚运奖容^（±s）

注：與青年對照組比較，1）P＜0.05；與自然衰老組比較，2）P＜0.05。

組別青年對照組自然衰老組補腎活血顆粒組n 10 10 10 SIRT1去乙酰化酶活性/（ng/mL）14.140±1.099 11.300±0.7591）16.067±0.3461）2）

4 討 論

當前隨著我國人口老齡化的不斷加劇，肌少癥將是我國老年病學及神經病學等學科面臨的重大健康問題與挑戰［9-10］。近年來的研究表明：SIRT1 直接參與低級及高級哺乳動物壽命與衰老的調節，而且發揮非常重要作用。衰老是機體內各部分器官系統的功能逐漸衰退的自然現象，伴隨著細胞數目不斷地減少，細胞功能也在不斷地衰減。

本研究結果表明：補腎活血顆?？梢哉{節大鼠腓腸肌組織SIRT1、FoxO3 蛋白表達及SIRT1 去乙?；富钚浴IRT1 是SIRT 家族中抗衰老作用的重要成員之一，是重要的長壽基因［11］，SIRT1 廣泛參與老年骨骼肌功能與質量衰減的調節［12］，SIRT1 通過去乙?；图せ頕oxO 途徑從而保護細胞免受氧化應激介導的損傷［13］。臨床與實驗研究均表明SIRT1 可以發生去乙酰化從而被激活［9］。SIRT1 能夠與FoxO 相互作用，通過去乙酰化FoxO3調節其活性，從而在神經細胞氧化應激等病理生理過程中發揮重要作用［14-15］，直接或間接地去乙?；疐oxO。目前觀點認為SIRT1 對FoxO 有雙刃劍效應：首先可以抑制FoxO 所介導的細胞凋亡，這些作用均可使細胞存活率上升，延緩衰老進程從而延長機體壽命；其次可促進FoxO 介導的DNA 損傷修復及應激抗性，導致細胞周期停滯，允許細胞有足夠的時間來修復損傷的DNA 以及抵抗氧化應激，從而增加存活機會。因此，SIRT1 通過抗凋亡、穩定氧化還原狀態、增強損傷后修復等，抑制不良因素對細胞的損傷，促進細胞的存活［16］。

目前有研究也證實：衰老證候除氣、血、陰、陽等虛證外，常常兼挾氣滯、痰濕瘀血等證，其中腎虛和瘀血是人體衰老的主要病機［17］。腎藏精，精生髓，骨髓充盈，骨骼強壯，運動靈活。若腎氣衰憊，則骨弱無力，行動緩慢。正如《難經正義·十四難》曰：“五損損于骨，骨痿不能起于床”。人體的生長、發育、壯盛以至衰老的過程，亦是氣血由弱到強、由盛到衰的過程。氣血虛可致血瘀，氣滯亦可致血瘀。補腎活血顆粒方中君藥為肉蓯蓉，臣藥為淫羊藿［18］，黃精、丹參佐之，功能補腎填髓、活血化瘀。本研究結果證實了補腎活血顆粒通過刺激SIRT1去乙?；富钚浴oxO3 相關蛋白表達從而發揮其對骨骼肌組織保護和修復作用，提示SIRT1 可能參與了自然衰老大鼠骨骼肌衰減的過程，這也為中醫藥抗衰老研究提供理論依據。