膽汁混合蒸制前后鉤吻成分差異及急性毒性研究

陳倪濟(jì)世，檀興慧，盧淑珍，王文義，李德森，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

鉤吻［Gelsemium elegans（Gardn.et Champ.）Benth.（GE）］，為馬錢科胡蔓藤屬植物，性溫，味辛、苦，有大毒，全草可入藥，具有祛風(fēng)散瘀、消腫止痛、攻毒殺蟲的功效。《神農(nóng)本草經(jīng)》謂之：“主金創(chuàng)乳痓，中惡風(fēng)，咳逆上氣，水腫，殺鬼疰蠱毒。”《吳普本草》稱其：“有毒，殺人。”生物堿既是活性成分，也是毒性成分，主要包括鉤吻素子、鉤吻素甲、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙、鉤吻素己等［1］。現(xiàn)代藥理、毒理學(xué)研究表明鉤吻具有良好的抗感染、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、散瞳、影響免疫功能等多種藥理功能，更是具有“止痛不成癮”的特點(diǎn)［2-5］。因鉤吻復(fù)雜的毒、效關(guān)系，近年來(lái)學(xué)者提出諸多減毒存效方案，主要包括砂炒減毒［6］、配伍玉葉金花減毒［7］、雙向固體發(fā)酵減毒［8］、“方證相關(guān)”減毒［9］。鉤吻減毒物質(zhì)基礎(chǔ)可能與鉤吻生物堿中的鉤吻素己的含量顯著被降低有關(guān)［10］。但目前鉤吻減毒方案尚未能確保鉤吻臨床應(yīng)用安全性和有效性。

膽汁炮制自古有之，發(fā)展至今可分為膽汁炙炒、膽汁扮曬、膽汁拌潤(rùn)發(fā)酵、膽汁混合蒸制法、膽汁混合發(fā)酵后蒸制法等，采用膽汁炮制的代表性藥物有天南星、黃連、化風(fēng)丹藥等［11-13］。現(xiàn)代膽汁炮制機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)膽汁炮制可轉(zhuǎn)變藥性、降低毒性，通過其中膽汁酸與中藥成分尤其是生物堿類成分發(fā)生相互作用，可發(fā)揮減毒增效作用［14］。鉤吻主要物質(zhì)為生物堿類成分，其性溫，膽汁性涼，溫涼互制，課題組前期研究表明動(dòng)物膽汁對(duì)鉤吻生物堿成分及毒性具有重要影響。

中藥指紋圖譜可從化學(xué)成分角度對(duì)不同批次藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別，可以較為全面地反映中藥質(zhì)量，被廣泛用于評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地/批次/炮制等多種樣品質(zhì)量及篩選差異標(biāo)志物［15-17］，為中醫(yī)藥多成分的復(fù)雜模式研究提供基礎(chǔ)。故本研究通過膽汁對(duì)鉤吻進(jìn)行混合蒸制得到鉤吻膽汁混合蒸制品（下稱膽鉤吻），建立HPLC 指紋圖譜結(jié)合多元化統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜差異，篩選二者成分差異，并進(jìn)一步通過小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察鉤吻生品與膽鉤吻的急性毒性死亡率差異，旨在提出鉤吻新的炮制減毒方案，闡明膽汁炮制鉤吻減毒內(nèi)在機(jī)制，為鉤吻臨床安全、合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 2695 型高效液相色譜儀、2996 型檢測(cè)器均購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；GT-2120QTS 型智能超聲波清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司）；EC21-21T01 型多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；TDL-40B 離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AR223CN 型千分之一電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；R-1001VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；ME204E 型萬(wàn)分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 藥材 鉤吻藥材分別采自福建永泰、福建晉安、福建泉州、福建廈門、福建漳州、廣西河池、廣東肇慶、云南文山，編號(hào)為S1～S7、S10，S1 老莖、嫩莖編號(hào)為S8、S9，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪教授鑒定為馬錢科胡蔓藤屬植物鉤吻［Gelsemium ele?gans（Gardn.et Champ.）Benth.］的根、莖；豬膽粉（批號(hào)：2021030）購(gòu)自福建省泉州市永春縣東平鎮(zhèn)。

1.3 試劑 鉤吻素甲對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15071312，純度≥98%）、鉤吻素子對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15062614，純度≥99%）、鉤吻素己對(duì)照品（批號(hào)：MUST-14100901，純度≥96%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；胡蔓藤堿丙對(duì)照品（批號(hào)：BBP02553，純度≥97.5%）、胡蔓藤堿乙對(duì)照品（批號(hào)：BBP02653，純度≥95%）均購(gòu)自云南西力生物技術(shù)股份有限公司；鉤吻綠堿對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P15A10S85857，純度≥95%）；常綠鉤吻堿對(duì)照品（武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：CFS201902，純度≥98%）；水為超純水，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.4 動(dòng)物 清潔級(jí)6～8 周齡ICR 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK（閩）2019-0007，（24±2）℃屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲食。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽鉤吻的制備 取S1～S10 共10 批鉤吻藥材，粉碎，過60 目篩，取粉末適量，參照吳真等報(bào)道［18］，采用混合蒸制法炮制工藝：加入4 倍量豬膽粉，加水充分潤(rùn)濕，拌勻，置于蒸鍋中隔水蒸制60 min，于烘箱60 ℃干燥，即得膽鉤吻，編號(hào)分別為PS1～PS10。鉤吻生品為棕黃色粉末，豬膽粉為灰黃色粉末，二者混合物為淡棕色。蒸制過程中，膽鉤吻顏色逐漸由淡棕色變?yōu)楹稚\褐色，烘干后顏色為棕褐色；炮制前豬膽粉有明顯腥味，蒸制后腥臭味變淡。鉤吻生品與膽鉤吻炮制前后性狀比較（以S10、PS10 為例），見圖1。

圖1 鉤吻生品與膽鉤吻性狀比較

2.2 鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Bonus-RP Analytical 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫，0～25 min，2%～10%A；25～40 min，10%～20%A；40～45 min，20%～32%A；45～55 min，32%～40%A；55～68 min，40%～20%A；68～70 min，20%～2%A；70～75 min，2%～2%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱定鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻素甲、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、胡蔓藤堿丙、常綠鉤吻堿對(duì)照品適量，分別置于10 mL 容量瓶，加甲醇定容，超聲輔助溶解，配置成質(zhì)量濃度分別為156.00、142.00、149.00、68.00、100.00、110.00、146.00 μg/mL，于4 ℃條件下保存，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定鉤吻生品（過60 目篩）0.200 g、膽鉤吻各樣品粉末適量（相當(dāng)于鉤吻生品0.200 g），置于具塞錐形瓶中，精密加入配制的含0.1%甲酸的50%甲醇溶液25 mL，密塞，稱重，超聲提取30 min，放冷；再次稱重，用含0.1%甲酸的50%甲醇溶液補(bǔ)足失量，充分搖勻，3 500 r/min離心10 min，0.22 μm 微孔 濾 膜 濾過，取續(xù)濾 液即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備鉤吻生品與膽鉤吻10 批藥材供試品，進(jìn)行液相檢測(cè)，建立鉤吻生品及膽鉤吻藥材HPLC 分析方法，并以S10、PS10 供試品溶液進(jìn)行方法學(xué)考察，以常綠鉤吻堿色譜峰為參照峰，計(jì)算主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性結(jié)果均表明鉤吻生品、膽鉤吻各成分峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 值均＜5.00%，表明建立的方法適用于鉤吻生品及膽鉤吻成分分析，鉤吻7 種生物堿成分混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 分析圖見圖2。

圖2 鉤吻7 種生物堿成分混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 分析圖

2.3 鉤吻生品與膽鉤吻共有峰的標(biāo)定 按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備10 個(gè)批次鉤吻生品與膽鉤吻供試品，進(jìn)行HPLC 分析，得到10 個(gè)批次鉤吻生品與膽鉤吻樣品HPLC 色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版）”進(jìn)行色譜峰匹配，樣品S10 和PS10 圖譜分別作為參照?qǐng)D譜，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，采用多點(diǎn)校正法建立指紋圖譜，得到鉤吻生品與膽鉤吻10 個(gè)批次藥材HPLC 指紋圖譜，其中R 為對(duì)照指紋圖譜，見圖3A、圖3B。鉤吻生品共標(biāo)定15 個(gè)共有峰，膽鉤吻共標(biāo)定17 個(gè)共有峰；膽鉤吻色譜峰6、7、8、9、10、11、16、17 面積降低（P均＜0.05），色峰峰2、13 面積均升高（P均＜0.05），色譜峰4、15 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S 樣品中色譜峰峰18、19、20 未被標(biāo)記為膽鉤吻共有峰，可能是因?yàn)槌煞趾枯^低無(wú)法識(shí)別。PS 樣品中色譜峰1、3、5、12、14 未能與S 樣品共有，可能是炮制后形成的新成分。通過對(duì)照品指認(rèn)，6、7、8、9、10、11、16 號(hào)色譜峰依次為胡蔓藤堿丙、鉤吻素甲、鉤吻素子、鉤吻素己、鉤吻綠堿、胡蔓藤堿乙、常綠鉤吻堿。根據(jù)指紋圖譜計(jì)算每批樣品指紋圖譜相似度，S1～S10 與其對(duì)照指紋圖譜相似度分別為0.931 、0.863 、0.858、0.979、0.787、0.854、0.826、0.975、0.744、0.894，PS1～PS10 與其對(duì)照指紋圖譜相似度分 別 為0.999、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999，表明不同批次鉤吻質(zhì)量存在一定差異，膽鉤吻質(zhì)量一致性較好。

圖3 10 批鉤吻生品與膽鉤吻HPLC 指紋圖譜

2.4 鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜多元化統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA） 將S1～S10 批次鉤吻生品與PS1～PS10批次膽鉤吻共有峰的峰面積數(shù)據(jù)輸入悟空平臺(tái)（https：//www.omicsolution.org/wkomics/main），進(jìn) 行HCA 分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見圖4。由圖4可見鉤吻生品與膽鉤吻可明顯聚為2類，其組成差異通過熱圖直觀體現(xiàn)，鉤吻生品中色譜峰6、7、8、9、10、11、16、17 峰面積明顯高于膽鉤吻，而色譜峰2、4、13、15峰面積在膽鉤吻中峰面積相對(duì)較高。

圖4 鉤吻生品與膽鉤吻樣品聚類圖

2.4.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將10 個(gè)批次鉤吻生品與膽鉤吻中共有峰的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，從12 個(gè)共有峰中提取出2 個(gè)貢獻(xiàn)率最大的主成分，對(duì)原始數(shù)據(jù)差異的貢獻(xiàn)率為68.9%，以此2 個(gè)主成分對(duì)樣品進(jìn)行分析，鉤吻生品與膽鉤吻明顯分為2 類，PCA 得分見圖5。

圖5 鉤吻生品與膽鉤吻PCA 得分圖

2.4.3 基于正交信號(hào)校正的偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 對(duì)鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析。建立OPLS-DA模型，該模型解釋和預(yù)測(cè)能力較好（模型參數(shù)：R2X＝0.924，R2Y＝0.991，Q2＝0.928），見圖6A、圖6B。通過圖6A OPLS-DA得分圖發(fā)現(xiàn)：鉤吻生品與膽鉤吻明顯分布在2 個(gè)象限，表明其化學(xué)成分具有顯著差異。進(jìn)一步以差異變量（variable influence on projection，VIP）＞1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出鉤吻生品與膽鉤吻主要差異色譜峰，見圖6B。圖6B 顯示：色譜峰2、8（鉤吻素子）、9（鉤吻素己）、11（胡蔓藤堿乙）為其主要指標(biāo)性差異成分，其中色譜峰8（鉤吻素子）、峰9（鉤吻素己）、色譜峰11（胡蔓藤堿乙）峰面積高于膽鉤吻，色譜峰2 峰面積低于膽鉤吻。

圖6 鉤吻生品與膽鉤吻OPLS-DA 及VIP 得分圖

2.5 鉤吻生品與膽鉤吻毒性比較

2.5.1 藥物制備 取鉤吻生品（S10）、蒸制鉤吻（不加膽汁混合蒸制）、蒸制豬膽粉（不加鉤吻混合蒸制）及與鉤吻生品等質(zhì)量膽鉤吻（PS10）粉末，加10 倍水浸泡30 min，煎煮60 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至濃度為0.2 g/mL，分別為鉤吻水煎液、蒸制鉤吻水煎液、蒸制豬膽粉水煎液、膽鉤吻水煎液，臨用前稀釋成要求的濃度。

2.5.2 鉤吻生品與膽鉤吻急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.5.2.1 鉤吻完全致死量篩選 取清潔級(jí)ICR 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，隨機(jī)分組。每組4只，給藥前禁食12～6 h，自由飲水后按照10 mL/kg體質(zhì)量分別灌服0.010 0、0.012 5、0.020 0、0.025 0、0.050 0、0.100 0、0.200 0 g/mL 鉤吻水煎液（對(duì)應(yīng)劑量分別為：0.100 0、0.125 0、0.200 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0 g/kg），觀察小鼠死亡率，結(jié)果見圖7。圖7 顯示：當(dāng)鉤吻水煎液劑量≥0.200 0 g/kg 時(shí)，小鼠死亡率為100%，存活時(shí)間多在0.4 h 內(nèi)，確定S10鉤吻水煎液的完全致死量為0.200 0 g/kg。

圖7 鉤吻生品不同劑量生存曲線

2.5.2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 取清潔級(jí)ICR 小鼠80 只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、鉤吻水煎液組、蒸制鉤吻水煎液組、蒸制豬膽粉水煎液組、膽鉤吻水煎液組，每組8 只，雌雄各半，給藥前禁食12～16 h，自由飲水。按0.01 mL/g 體質(zhì)量灌胃，觀察14 d 內(nèi)小鼠死亡情況，見表1。在同等劑量下，鉤吻水煎液組小鼠約在10～30 min 出現(xiàn)中毒癥狀繼而呼吸衰竭而亡，死亡率100%，膽鉤吻水煎液組14 d 內(nèi)死亡率為0%。膽鉤吻水煎液組劑量提高到4.00 g/kg（按鉤吻生藥量計(jì)）時(shí)，14 d 內(nèi)死亡率仍為0%，與鉤吻水煎液組比較，安全范圍約提高20 倍。

表1 鉤吻與膽鉤吻急性毒性比較

3 討 論

鉤吻具有抗腫瘤、抗感染等功效，但毒性亦備受爭(zhēng)議。前期研究指出高溫炮制過程鉤吻吲哚生物堿發(fā)生氧化降解或轉(zhuǎn)化，促使生物堿含量降低而達(dá)到減毒效果［16］。故本研究通過以豬膽汁對(duì)鉤吻進(jìn)行炮制，對(duì)比鉤吻生品，可明顯發(fā)現(xiàn)膽鉤吻外觀性狀發(fā)生顯著變化，其顏色由黃棕色變?yōu)楹诤稚詭任叮瑧?yīng)是加入膽汁炮制產(chǎn)生系列化學(xué)變化所致。

通過對(duì)10 批鉤吻生品及膽鉤吻的指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)：膽汁炮制前后，鉤吻生品及膽鉤吻保留有大部分共有峰，但亦有部分峰消失，或是新的峰出現(xiàn)，指紋圖譜可實(shí)現(xiàn)二者區(qū)分；膽汁炮制后識(shí)別的7 種鉤吻生物堿成分峰面積均大幅度降低，包括毒性最強(qiáng)的鉤吻素己，同時(shí)伴隨新的峰生成。這可能與膽汁中某種/類物質(zhì)與鉤吻生物堿相互作用發(fā)生物理、化學(xué)變化，促使二者發(fā)生結(jié)合/轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低生物堿含量。結(jié)合HCA、PCA、OPLS-DA 等多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)鉤吻素子、鉤吻素己、胡蔓藤堿乙3個(gè)成分可作為膽鉤吻炮制的差異標(biāo)志物。故本研究建立的指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜可作為后續(xù)鉤吻生品與膽鉤吻樣品區(qū)分及質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)的參照。且通過指紋圖譜與多元化統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法，篩選得到的鉤吻生品與膽鉤吻差異性標(biāo)志物可為膽鉤吻的炮制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

膽鉤吻急性毒性研究發(fā)現(xiàn)鉤吻水煎液毒性強(qiáng)烈，劑量在0.20 g/kg 時(shí)，受試小鼠全部死亡；而膽鉤吻水煎液組以鉤吻水煎液完全致死量（0.20 g/kg）及完全致死量的20 倍（4.00 g/kg）灌服時(shí)，均未見受試小鼠死亡。膽鉤吻水煎液組小鼠中毒后沒有出現(xiàn)明顯的痙攣、驚厥、跳躍等中毒表現(xiàn)，僅表現(xiàn)出安靜、瞇眼等反應(yīng)，這一現(xiàn)象或與鉤吻鎮(zhèn)靜催眠作用有關(guān)，提示膽汁混合蒸制能顯著降低鉤吻毒性，且可能保留有鉤吻良好的藥效。但本研究尚未深入進(jìn)行探討，后續(xù)將進(jìn)一步展開研究。

本研究結(jié)果表明鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜差異顯著，毒性生物堿成分含量降低，其毒性大大降低。本研究中膽汁用量為鉤吻4 倍，受限于研究技術(shù)，并未對(duì)膽汁成分進(jìn)行深入研究，這亦是目前膽汁炮制類中藥研究不足之處。但根據(jù)本研究所建立HPLC 方法對(duì)膽汁提取物進(jìn)行分析，色譜峰信息較少，對(duì)鉤吻成分不產(chǎn)生干擾。此外，本研究亦尚未對(duì)膽鉤吻其他方面的毒性及藥效進(jìn)行研究，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。本研究重點(diǎn)突出鉤吻生品與膽鉤吻指紋圖譜變化及毒性的變化，初步揭示膽汁混合蒸制使鉤吻成分發(fā)生變化/轉(zhuǎn)化是膽鉤吻減毒的作用機(jī)制，為探索鉤吻減毒存效策略提供新的方向，促進(jìn)鉤吻臨床安全應(yīng)用，也進(jìn)一步豐富中藥膽汁炮制理論內(nèi)容。