輻照聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑對(duì)中心體調(diào)節(jié)激酶(Aurora-A)高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系增殖的影響

張 英，張樂(lè)天，李素君，王 競(jìng)

1 北京科技大學(xué)醫(yī)院 內(nèi)科，北京 100083；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 放療科，北京 100853

Aurora-A作為中心體調(diào)節(jié)激酶，在肺癌中高表達(dá)并與預(yù)后不良相關(guān)，是放療抗拒性基因[1-2]。靶向治療對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)等特定基因突變的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者非常有效，這些突變基因可以預(yù)測(cè)分子靶向治療療效，又被稱為敏感基因突變[3]。Meta分析表明，對(duì)于EGFR敏感基因突變驅(qū)動(dòng)的NSCLC患者，應(yīng)用小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)如吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼和阿法替尼相比化療受益更大，主要表現(xiàn)為顯著改善患者的無(wú)進(jìn)展生存，降低41% ～ 69%患者的腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)[4]。臨床隨機(jī)對(duì)照研究也顯示，與化療相比，埃克替尼(Iconitib)一線治療EGFR突變的NSCLC患者可降低39%的腫瘤進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，中位生存期為11.2個(gè)月(P=0.006)[5]。對(duì)于敏感基因突變的NSCLC采用針對(duì)性的分子靶向治療，盡管可以明顯改善患者的生存，但仍然有60%患者在1年左右出現(xiàn)靶向耐藥和腫瘤進(jìn)展[3,6]。對(duì)于無(wú)敏感基因突變驅(qū)動(dòng)的NSCLC，放療是一個(gè)有效的局部治療手段。但對(duì)于靶向治療耐藥和放療抗拒的NSCLC，尚缺乏有效的治療手段。本研究探索輻照聯(lián)合小分子EGFR-TKI對(duì)Aurora-A高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞系的抑制作用，觀察Aurora-A與EGFR下游信號(hào)通路的相關(guān)性，為克服靶向治療耐藥及逆轉(zhuǎn)放射抗拒提供新的研究思路。

材料與方法

1 藥物、細(xì)胞、試劑和儀器 Iconitib由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司提供， Gefitinib購(gòu)自英國(guó)AstraZeneca公司；人類NSCLC細(xì)胞株(A549，GLC82)、人類支氣管肺正常上皮細(xì)胞株(16HBE)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PCR擴(kuò)增引物購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司，Aurora-A Oligo siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司；一抗除EGFR磷酸化兔單抗及β-actin鼠單抗外均為兔抗人多克隆抗體，其中抗Aurora-A(ab1287，1∶4 000)、抗p-Aurora-A(Thr288) (ab18318，1∶500)、抗EGFR(ab2430，1∶200)、抗Akt(ab106693，1:500)、抗Stat1(ab2415，1∶200)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗p-EGFR(Thr669) (8 808，1∶1 000)、抗p-Akt(Ser473) (9 271，1∶1 000)、抗p-Stat1(Ser727) (9 177，1∶1 000)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，抗β-actin(8 432，1∶2000)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。二抗羊抗兔IgG及二步法顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀微孔板閱讀器購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，PCR擴(kuò)增儀ABI PRISM7700實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，M5型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，細(xì)胞株輻照源Synergy 6MV-X線為瑞典Elekta公司生產(chǎn)(劑量率400 MU/min)。

2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和藥物篩選 A549和GLC82細(xì)胞株培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640，16HBE細(xì)胞株培養(yǎng)液為含1.5 g/L碳酸氫鈉、2.7 g/L葡萄糖、2.0 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/非必需氨基酸、5μg/L胰島素、10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、1 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、500 ng/mL氫化可的松和4%FBS的Ham’s F12培養(yǎng)液。細(xì)胞株置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，細(xì)胞穩(wěn)定呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。在A549、GLC82和16HBE細(xì)胞株中，通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法(Western blot)分別檢測(cè)Aurora-A基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，篩選出Aurora-A高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞株用于試驗(yàn)。采用MTT法測(cè)定EGFR-TKI(Icotinib和Gefitinib)的細(xì)胞毒性，在490 nm處采用酶標(biāo)儀微孔板閱讀器測(cè)定吸光度并計(jì)算確定半數(shù)抑瘤濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行3次，每次3個(gè)樣本。采用實(shí)驗(yàn)所得的IC50作用于Aurora-A高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞24 h后，收集處理細(xì)胞檢測(cè)EGFR、Aurora-A、Akt和Stat1相關(guān)基因的蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)，比較并篩選出明顯抑制EGFR蛋白表達(dá)的靶向藥物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 RT-PCR檢測(cè)Aurora-A基因的mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法分別提取A549、GLC82和16HBE細(xì)胞總RNA，采用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒獲取cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR引物根據(jù)GenBank設(shè)計(jì)，Aurora-A正向(5'-3')：TGGAATAT GCACCACTTGGA，反向(5'-3')：ACTGACCACCC AAAATCTGC；GAPDH正向(5'-3') ：CAGGAGGC ATTGCTGATGAT，反向(5'-3')：GAAGGCTGGGG CTCATTT。獲取的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證后在ABI PRISM7700實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，以3個(gè)平行管所得Ct值的均值計(jì)算。ΔCt=Ct(Aurora-A)-Ct(GAPDH)，采用法計(jì)算獲得Aurora-A mRNA的表達(dá)水平。

4 Western blot法檢測(cè)EGFR和Aurora-A相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平 采用RIPA裂解液處理上述輻照后的細(xì)胞提取總蛋白，將30 μg蛋白上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳后將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。按步驟先后加入相關(guān)基因的一抗孵育4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白條帶的顯影。

5 藥物及輻照干預(yù) 采用上述篩選的靶向藥物(IC50)作用于Aurora-A高表達(dá)細(xì)胞株24 h后輻照，細(xì)胞株接受輻照單次劑量分別為0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy、15 Gy、20 Gy。分別于輻照后2 h收集處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)EGFR和Aurora-A相關(guān)基因蛋白表達(dá)，并于輻照后24 h采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相分布。

6 siRNA轉(zhuǎn)染Aurora-A高表達(dá)NSCLC細(xì)胞株 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成針對(duì)人Aurora-A基因的Oligo siRNA。Aurora-A siRNA 序列正向(5'-3')：AUGCCCUGUCUUACUGUC，反向(5'-3')：UGACAGUAAGACAGGGCAUTT；陰性對(duì)照正向(5'-3')：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向(5'-3')：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，72 h后常規(guī)收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將Aurora-A高表達(dá)的NSCLC細(xì)胞、Aurora-A siRNA轉(zhuǎn)染的NSCLC細(xì)胞分別加靶向藥物(IC50)和不加靶向藥物作用24 h，并于每組再設(shè)0 Gy、2 Gy、10 Gy輻照組。將輻照后的細(xì)胞放培養(yǎng)箱孵育48 h后，胰酶消化、離心并分別收集不同劑量組中貼壁生長(zhǎng)和懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)分別行Annexin V FITC/碘化丙啶(PI)冰上染色至少30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

8 輻照細(xì)胞克隆形成分析 指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整稀釋濃度備用。按不同劑量點(diǎn)(0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy)對(duì)應(yīng)不同數(shù)量(500、2 000、5 000、10 000、20 000、50 000)細(xì)胞分別接種至培養(yǎng)瓶中。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)瓶，并分為輻照聯(lián)合靶向藥物組和單純輻照組。靶向藥物的給藥濃度為該藥的IC50。將培養(yǎng)瓶加靶向藥孵育箱培養(yǎng)24 h后給予不同劑量X線輻照后繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用無(wú)水甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色30 min，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆。細(xì)胞數(shù) ≥ 50定義為一個(gè)克隆。克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) × 100%。以0 Gy組克隆形成率作為對(duì)照組，計(jì)算出各劑量組的細(xì)胞存活率。每一劑量點(diǎn)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)定義為某劑量組與對(duì)照組克隆形成率的比值。

9 放射生物學(xué)分析 根據(jù)細(xì)胞克隆形成按照放射生物學(xué)單擊多靶模型擬合繪制細(xì)胞存活曲線，并計(jì)算終斜率平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、外推數(shù)值(N)、2 Gy輻照細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)以及放射增敏比(SER)。SER=D0(輻照組)/ D0(輻照聯(lián)合靶向藥物組)。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉ ±s表示。兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 篩選Aurora-A高表達(dá)細(xì)胞系與靶向藥物 Aurora-A mRNA在A549和GLC82肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平分別是0.525 ± 0.053和2.545 ± 0.822(P＜ 0.05)(圖1A)，相應(yīng)的蛋白及磷酸化水平顯示Aurora-A在GLC82肺癌細(xì)胞系高表達(dá)(圖1B)，靶向藥物Icotinib和Gefitinib在GLC82細(xì)胞系的IC50分別為2.92 μmol/L(圖1C)和0.14 μmol/L(圖1D)。肺癌細(xì)胞系GLC82分別接受Icotinib(2.92 μmol/L)和Gefitinib(0.14 μmol/L)干預(yù)后，與未加藥的GLC82細(xì)胞對(duì)照相比，Icotinib組p-EGFR/EGFR水平明顯下降，p-Akt/Akt和p-Stat1/Stat1發(fā)生顯著變化(P＜0.05)，而p-Aurora-A/Aurora-A無(wú)明顯影響(P＞0.05)(圖2A、圖2B)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用GLC82細(xì)胞株和Icotinib進(jìn)行。

圖1 Aurora-A在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549，GLC82)和人支氣管肺正常上皮細(xì)胞株(16HBE)中的表達(dá)及EGFR-TKI在GLC82細(xì)胞系中抑瘤情況(aP＜0.05) A：RT-PCR檢測(cè)Aurora-A mRNA在16HBE、A549和CLC82細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量；B：Western blot檢測(cè)Aurora-A及其磷酸化蛋白在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)；C：MTT法檢測(cè)GLC82細(xì)胞在不同濃度Icotinib中的生存比例；D：MTT法檢測(cè)GLC82細(xì)胞在不同濃度Gefitinib中的生存比例Fig.1 Aurora-A mRNA and EGFR-TKIs in 16HBE, A549 and GLC82 cell lines (aP＜0.05) A: Comparison of Aurora-A mRNA relative expression in 16HBE, A549 and GLC82 cell lines cells by RT- PCR; B: Western blot analysis of Aurora-A and p-Aurora-A in cell lines cells; C: Survival of GLC82 cells with different concentration of Icotinib by MTT; D: Survival of GLC82 cells with different concentration of Gefitinib by MTT

圖2 Icotinib(2.92 μmol/L)或Gefitinib(0.14 μmol/L)處理后EGFR及下游信號(hào)通路激酶在GLC82細(xì)胞系中的表達(dá)A：Western blot檢測(cè)EGFR、Aurora-A、Akt和Stat1蛋白在GLC82細(xì)胞系中的表達(dá)水平；B：采用Image J 1.35a軟件分析Western blot蛋白電泳條帶密度定量比較GLC82細(xì)胞系中EGFR、Aurora-A、Akt和Stat1蛋白及其磷酸化水平(aP ＜ 0.05，bP ＞ 0.05)Fig.2 EGFR and its downstream signaling kinases following Icotinib (2.92 μmol/L) or Gefitinib (0.14 μmol/L) in GLC82 cell linesA: Western blot analysis of EGFR, Aurora-A, Akt, Stat1 in GLC82 cell lines; B: Quantitative comparison of Western blot was performed using Image J 1.53a (aP ＜ 0.05, bP ＞ 0.05)

2 EGFR、Aurora-A、Akt和Stat1蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá) Icotinib聯(lián)合輻照(2 Gy、10 Gy)與單純Icotinib相比，p-EGFR/EGFR水平無(wú)明顯變化(P＞0.05)；Icotinib聯(lián)合輻照2 Gy與單純Icotinib相比，p-Aurora-A/Aurora-A、p-Akt/Akt和p-Stat1/Stat1變化均不明顯(P＞0.05)；Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy時(shí)p-Aurora-A/Aurora-A及p-Akt/Akt明顯下降，p-Stat1/Stat1也呈顯著改變(P＜ 0.05)。見(jiàn)圖3A、圖3B。

圖3 Icotinib聯(lián)合輻照(I+R)后EGFR和下游激酶在GLC82細(xì)胞中的表達(dá) A：Western blot法分析GLC82細(xì)胞經(jīng)Icotinib(2.92 μmol/L)在輻照前預(yù)處理24 h，輻照2 h后收集細(xì)胞采用抗體進(jìn)行分析；B：采用Image J 1.53a軟件測(cè)定蛋白電泳條帶密度(aP＜0.05，bP＞0.05)Fig.3 Expression of EGFR and its downstream kinases in GLC82 cells treated with Icotinib combined radiation (I+R) A: GLC82 cells were pretreated with Icotinib (2.92 μmol/L) for 24 h before receiving radiation. Cells were harvested at 2 h later and analyzed by western blot analysis using antibodies; B: The protein electrophoresis band density was determined by Image J 1.53a software (aP＜0.05,bP＞0.05)

3 細(xì)胞周期分布 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示輻照聯(lián)合Icotinib隨著放射劑量遞增，G0/G1期及S期細(xì)胞比例遞減，G2/M期比例遞增，細(xì)胞周期分布呈線性變化。見(jiàn)圖4。

圖4 GLC82細(xì)胞接受Icotinib (2.92 μmol/L)聯(lián)合輻照后的細(xì)胞周期分布Fig.4 Distribution of cell cycle in GLC82 cells treated with combination of radiation and Icotinib (2.92 μmol/L)

4 細(xì)胞凋亡率比較 GLC82細(xì)胞接受Aurora-A siRNA、Icotinib(2.92 μmol/L)、輻照(2 Gy、10 Gy)和Icotinib聯(lián)合輻照后的凋亡情況見(jiàn)圖5、圖6和表1。在GLC82細(xì)胞系中，與對(duì)照(未加Icotinib)相比，2 Gy單純輻照未增加細(xì)胞的凋亡率(P＞0.05)，而Icotinib、單純大劑量輻照(10 Gy)、Icotinib聯(lián)合輻照(2 Gy、10 Gy)對(duì)于GLC82均有明顯的凋亡作用(P＜0.05)(圖6A)。在接受Aurora-A siRNA干預(yù)后，除了Icotinib聯(lián)合輻照2 Gy導(dǎo)致GLC82細(xì)胞凋亡作用相似外(P＞0.05)(圖6B、表1)，Icotinib、輻照(2 Gy、10 Gy)以及Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy均產(chǎn)生明顯的促進(jìn)GLC82細(xì)胞凋亡作用(P＜0.05)(圖6B)。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同干預(yù)后GLC82細(xì)胞的凋亡率A：GLC82細(xì)胞接受Icotinib (2.92 μmol/L)、輻照(2 Gy、10 Gy)、輻照聯(lián)合Icotinib后細(xì)胞凋亡率比較；B：Aurora-A siRNA、Icotinib (2.92 μmol/L)、輻照(2 Gy、10 Gy)、輻照聯(lián)合Icotinib后GLC82細(xì)胞凋亡率的比較(aP ＜ 0.05，bP ＞ 0.05)Fig.6 Comparison of apoptosis of GLC82 cells after treatment A: Apoptosis of GLC82 cells treated with Icotinib (2.92μmol/L), radiation (2 Gy, 10 Gy) and combination of radiation and Icotinib; B: Comparison of apoptosis of GLC82 cells treated with Aurora-A siRNA, Icotinib (2.92 μmol/L),radiation (2 Gy, 10 Gy) and combination of radiation and Icotinib (aP ＜ 0.05, bP ＞ 0.05)

表1 GLC82細(xì)胞接受Aurora-A siRNA、Icotinib、輻照及輻照聯(lián)合Icotinib后的細(xì)胞凋亡率比較Tab. 1 Apoptosis of GLC82 cells treated with Aurora-A siRNA, Icotinib, radiation and combination of Icotinib and radiation

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GLC82細(xì)胞接受Aurora-A siRNA、Icotinib (2.92 μmol/L)及Icotinib聯(lián)合輻照(2 Gy、10 Gy)干預(yù)后的凋亡情況Fig.5 Apoptosis of GLC82 cells treated with Aurora-siRNA, Icotinib (2.92 μmol/L) and combination of Icotinib and radiation (2 Gy, 10 Gy)by flow cytometry

5 放射生物學(xué)評(píng)價(jià) 根據(jù)放射生物學(xué)單擊多靶模型擬合GLC82細(xì)胞存活曲線，輻照聯(lián)合Icotinib較單純輻照細(xì)胞生存比例明顯下降 (圖7)，輻照聯(lián)合Icotinib的平均致死劑量(D0值)、2 Gy細(xì)胞存活比例(SF2)均較單純輻照明顯下降(表2)，表明輻照聯(lián)合Icotinib可以增強(qiáng)GLC82細(xì)胞的放射敏感度(SER=1.60)。

圖7 GLC82細(xì)胞接受輻照聯(lián)合Icotinib (2.92 μmol/L)的劑量生存曲線Fig.7 Dose-survival curves in GLC82 cells treated with radiation combined Icotinib (2.92 μmol/L)

表2 GLC82細(xì)胞接受輻照及輻照聯(lián)合Ictoinib的劑量生存曲線放射生物學(xué)指標(biāo)Tab. 2 Radiobiological parameters of dose-survival curves of GLC82 cells

討 論

輻照聯(lián)合小分子EGFR-TKI可以增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的放射敏感度[7]，但對(duì)于放射抗拒的細(xì)胞，輻照聯(lián)合EGFR-TKI的作用尚未確定。本研究首先在兩種NSCLC細(xì)胞系中篩選出Aurora-A相對(duì)高表達(dá)的GLC82細(xì)胞系，由于在GLC82細(xì)胞中Icotinib較Gefitinib對(duì)EGFR磷酸化的抑制作用更強(qiáng)，我們選擇了Icotinib作為聯(lián)合輻照的靶向藥物。GLC82細(xì)胞接受Icotinib、Icotinib聯(lián)合輻照2 Gy干預(yù)時(shí)，p-Aurora-A/Aurora-A無(wú)明顯變化(P＞0.05)，表明p-Aurora-A/Aurora-A的表達(dá)可能對(duì)Icotinib、Icotinib聯(lián)合輻照2 Gy抗拒。Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy時(shí)，p-Aurora-A/Aurora-A及p-Akt/Akt明顯下降，p-Stat1/Stat1也呈顯著改變(P＜0.05)，表明p-Aurora-A/Aurora-A的表達(dá)可以被Icotinib聯(lián)合大劑量輻照(10 Gy)所逆轉(zhuǎn)，而且p-Aurora-A/Aurora-A的表達(dá)并不依賴于p-EGFR/EGFR的表達(dá)。細(xì)胞周期分布上顯示Icotinib聯(lián)合放療后GLC82細(xì)胞周期呈線性改變，腫瘤細(xì)胞明顯阻滯于G2/M期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示單純常規(guī)輻照(2 Gy)并不能增加GLC82細(xì)胞的凋亡，而Icotinib、大劑量輻照(10 Gy)及Icotinib聯(lián)合輻照(2 Gy、10 Gy)均可導(dǎo)致GLC82細(xì)胞顯著凋亡。Aurora-A siRNA干預(yù)GLC82細(xì)胞后能明顯增加Icotinib、輻照(2 Gy、10 Gy)和Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy的放療敏感度，促進(jìn)GLC82細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，Aurora-A可能是GLC82細(xì)胞的放射抗拒性基因。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，輻照聯(lián)合Icotinib可以增強(qiáng)Aurora-A相對(duì)高表達(dá)的GLC82細(xì)胞凋亡，表明輻照聯(lián)合靶向藥物可以逆轉(zhuǎn)GLC82中Aurora-A引起的放射抗拒。

Aurora-A是EGFR下游信號(hào)通路激酶，不僅參與腫瘤的增殖、遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移，而且介導(dǎo)化療耐藥、放射抗拒和腫瘤的免疫治療[8]。Aurora-A通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂底物在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并通過(guò)非有絲分裂途徑影響其他分子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。在許多腫瘤中觀察到Aurora-A和EGFR異常表達(dá)，并且這種異常表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[9-11]。目前認(rèn)為EGFR-Aurora-A通路的異常激活與腫瘤的形成和發(fā)展相關(guān)[12]。在肺腺癌H1299和A549細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，Aurora-A抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡可能與下調(diào)EGFR相關(guān)[9]。近年有報(bào)道EGFR激酶通過(guò)激活USP8去泛素化酶抑制了纖毛形成[13]。通過(guò)敲降EGFR可以下調(diào)USP8 - 毛細(xì)血管擴(kuò)張素 - Aurora-A信號(hào)通路，導(dǎo)致纖毛形成。EGFR - USP8 - 毛細(xì)血管擴(kuò)張素 - Aurora-A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)限制分裂細(xì)胞中纖毛的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。最近對(duì)口腔鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR的激活可以通過(guò)Aurora-A磷酸化導(dǎo)致明顯的纖毛吸收[14]。Aurora-A沉默可顯著恢復(fù)纖毛的表達(dá)，明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。Aurora-A介導(dǎo)的磷酸化促進(jìn)NSCLC的生長(zhǎng)和遷移[15]。Aurora-A在很多腫瘤中的過(guò)表達(dá)還導(dǎo)致對(duì)放化療的抗拒[8,16]。Akt活化的腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡抗拒，Aurora-A功能可能通過(guò)Akt活化介導(dǎo)[16-18]。我們?cè)贏urora-A相對(duì)高表達(dá)的GLC82細(xì)胞中觀察到Icotinib、Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy可明顯降低GLC82細(xì)胞p-Aurora-A/Aurora-A和p-Akt/Akt的表達(dá)(P＜0.05)。

電離輻射對(duì)Stat家族成員有不同影響，有時(shí)是非特異性的[19]。EGFR-TKI(如拉帕替尼)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞相關(guān)的Stat1磷酸化可以刺激和延長(zhǎng)抗腫瘤效應(yīng)[20]。本研究觀察到Icotinib聯(lián)合輻照10 Gy后GLC82細(xì)胞的p-Stat1/Stat1顯著改變(P＜0.05)。另外，在EGFR非依賴性的耐藥機(jī)制中，受體酪

氨酸激酶的下調(diào)或EGFR下游激酶的異常活化可通過(guò)激發(fā)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致EGFRTKI耐藥[21]。在肺癌中第3代EGFR-TKI的耐藥與Aurora-A相關(guān)[22]。我們的研究中觀察到Icotinib聯(lián)合大劑量輻照(10 Gy)可以明顯降低p-Akt/Akt和p-Aurora-A/Aurora-A，可能有助于阻斷EGFR非依賴性耐藥。

綜上所述，輻照聯(lián)合Icotinib對(duì)于Aurora-A相對(duì)高表達(dá)的GLC82細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)Aurora-A放射抗拒、增強(qiáng)GLC82細(xì)胞凋亡的作用，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。