大麻二酚對膿毒癥模型小鼠生存率和炎癥反應的影響

付 澤，李 浩，趙鵬躍，胡時棟，杜曉輝，徐迎新

1 解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 普通外科 ，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 普外研究所，北京 100853

膿毒癥被定義為由感染引起的宿主反應，并可能導致危及生命的器官功能障礙。由膿毒癥引起的循環(huán)和細胞/代謝異常的高死亡率狀態(tài)稱為膿毒癥休克[1]。嚴重感染導致免疫反應的改變，通常以促炎因子級聯(lián)反應為特征，被稱為全身炎癥反應綜合征[2]。由于免疫細胞功能的紊亂導致細胞因子分泌障礙，造成膿毒癥期間出現(xiàn)全身性免疫紊亂[3]。盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and puncture，CLP)模型是40多年前發(fā)展起來的一種成熟的研究膿毒癥潛在機制的實驗模型。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是一種來源于大麻的非精神活性大麻素，具有神經(jīng)保護和免疫調(diào)節(jié)等功能[4-5]。在Matsuda等提出的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)理論中，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由受體、內(nèi)源性大麻素(一類內(nèi)源性花生四烯酸衍生物)和相關調(diào)節(jié)酶組成[6]。 以一種特定的內(nèi)源性大麻素——N-花生四烯酰多巴胺為例，一項膿毒癥模型小鼠的實驗中N-花生四烯酰多巴胺通過與G蛋白偶聯(lián)的大麻素受體結合發(fā)揮功能，抑制炎癥進展并改善了小鼠生存率[7]。近年來有越來越多關于CBD的研究證明CBD在抗炎、抑菌和調(diào)節(jié)免疫功能等方面發(fā)揮作用[8-11]?；谏鲜隹紤]，課題組開展了此項研究，即探討CBD是否可以通過改善小鼠免疫炎癥反應狀態(tài)、避免過度免疫反應對機體的損害而起到對膿毒癥小鼠的保護作用。

材料與方法

1 試劑和儀器 大麻二酚購自黑龍江哈工智慧漢麻科技有限公司。無水乙醇(100092183)，購自國藥集團化學試劑有限公司；二甲苯(1330-20-7)，購自上海凌峰化學試劑有限公司；EDTA (pH 8.0)抗原修復液(G1206)、EDTA(pH 9.0)抗原修復液(G1203)、檸檬酸(pH 6.0)抗原修復液(G1202)、PBS緩沖液(G0002)、自發(fā)熒光淬滅劑(G1221)，蘇木精染色液(G1004)、BSA (G5001)、Anti-CD4 Mouse mAb (GB13064-1)、Anti-CD8 beta Rabbit pAb(GB111742)，購自Servicebio公司。Klrb1c/CD161c Rabbit mAb (LS-C37687) 購自USBiological公司。ELISA試劑盒購自江萊生物科技公司。脫水機，購自意大利DIAPATH公司；包埋機，購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機，購自上海徠卡儀器有限公司；渦旋混合器、掌上離心機，購自武漢Servicebio公司；數(shù)字切片掃描儀，購自匈牙利3D HISTECH公司；正置熒光顯微鏡-成像系統(tǒng)，購自日本尼康公司；酶標儀，購自德國Biotek公司；KHB ST-36ET洗板機，購自上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

2 實驗動物 6 ～ 8周齡的C57BL/6J雄性小鼠72只購自解放軍總醫(yī)院動物實驗中心。小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)在恒溫空調(diào)設施中，12 h/12 h光暗循環(huán)，正常進食和飲水。小鼠在適應性喂養(yǎng)5 d后用于實驗。動物實驗由解放軍總醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(倫理審批編號：2020-X16-106)。

3 盲腸結扎穿孔模型建立 制備1%戊巴比妥鈉溶液，通過腹腔注射0.1 mL的1%戊巴比妥鈉溶液對小鼠進行麻醉。剃毛后消毒腹部，皮膚中線切口，暴露盲腸，用3.0絲線在指定位置結扎盲腸。用21號針頭穿刺1次，然后輕輕擠壓盲腸，從穿孔部位擠出少量糞便，將盲腸放置回腹腔，用4.0絲線縫合腹部切口。CLP術后立即皮下注射0.9%氯化鈉注射液使動物復蘇。

4 小鼠分組及處理 本試驗分為兩部分，第一部分為生存率觀察實驗，第二部分為標本采集實驗。實驗一：選取36只小鼠隨機分為3組，每組12只進行CLP手術。模型對照組，CLP術后即刻腹腔注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液；大麻二酚溶劑對照組，CLP術后即刻腹腔注射1 mL溶劑(無水乙醇、吐溫80、0.9%氯化鈉注射液按1∶1∶18比例混合)；大麻二酚實驗組，在CLP術后立即腹腔注射1 mL劑量為20 mg/kg的大麻二酚溶液。上述三組中的小鼠在CLP術后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h向腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉注射液、大麻二酚溶劑或20 mg/kg劑量CBD溶液(CBD劑量和注射間隔以文獻[12-13]作為參考)。連續(xù)觀察各組小鼠在12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h時間點的存活數(shù)量并制作生存率折線圖。實驗二：將剩余36只小鼠分為模型對照組、大麻二酚溶劑對照組和大麻二酚實驗組，分別在CLP術后12 h、24 h、36 h向小鼠腹腔注射1 mL的0.9%氯化鈉注射液、溶劑或20 mg/kg劑量的CBD溶液。在CLP術后48 h處死小鼠獲取組織標本。

5 血清炎癥細胞因子檢測 于CLP術后48 h通過腹腔注射1 mL的1%戊巴比妥鈉溶液麻醉實驗二中的各組小鼠。保持小鼠仰臥固定，剪去胸前區(qū)被毛，皮膚消毒后，針呈45°角斜向前刺入心臟搏動最強處，注射器吸取血液1 mL。獲取血液后靜置2 h，4℃條件下靜置分離(3 500 r/min，10 min)。根據(jù)ELISA 試劑盒方法，檢測血液中炎癥因子白細胞介素-1b(interleukin-1，IL-1b)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6含量。

6 肺組織病理檢測 處死小鼠后獲取肺組織，將肺組織放入10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理改變。

7 肝組織免疫細胞熒光觀察 取得小鼠肝組織經(jīng)固定，石蠟包埋、切片。將制備好的肝組織病理切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH 8.0)的修復盒中，于微波爐內(nèi)進行抗原修復；涂勻PBS待干，后滴加BSA，封閉30 min；按順序加一抗、二抗；DAPI復染細胞核后加入自發(fā)熒光淬滅劑；封片后鏡檢拍照。

8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件為SPSS22.0，計量數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。小鼠生存情況以Kaplan-Meier生存曲線表述。

結 果

1 CBD對膿毒癥小鼠一般情況及72 h生存率的影響 模型對照組和大麻二酚溶劑對照組小鼠隨造模時間延長出現(xiàn)以下癥狀：進食量減少、呼吸頻率顯著降低；毛發(fā)光澤度差，背部毛發(fā)脫毛；身體戰(zhàn)栗；精神萎靡，活動度差，對觸碰反應差，推倒后不可翻身；眼睛閉合有顯著分泌物。大麻二酚實驗組小鼠的生存狀態(tài)相比于模型對照組和大麻二酚溶劑對照組小鼠，背部毛發(fā)豎立，活動遲緩仍可行走，觸碰立即逃走；眼睛不閉合，幾乎無分泌物。模型對照組、大麻二酚溶劑對照組和大麻二酚實驗組CLP術后72 h的生存率分別為16.7%、25%和58.3%，相較于模型對照組和大麻二酚溶劑對照組，大麻二酚實驗組小鼠在CLP術后生存狀況得到改善且72 h生存率高于其他組別。根據(jù)各組小鼠存活情況變化趨勢繪制小鼠生存率折線圖。見圖1。

圖1 膿毒癥模型小鼠的生存率折線圖(aP＜0.05, vs 72 h時的模型對照組和大麻二酚溶劑對照組)Fig.1 Line chart of survival rate of sepsis model mice (aP＜0.05, vs model group and solvent group at 72 h)

2 CBD對膿毒癥小鼠肺組織病理形態(tài)的改變 HE肺病理染色顯示，模型對照組和大麻二酚溶劑

對照組的肺組織結構紊亂、間隔增厚，部分肺泡結構受損，支氣管黏膜和管周可見大量的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤。大麻二酚實驗組小鼠的肺HE染色可見肺泡間隔稍增厚，炎性細胞浸潤，纖維組織增生減少，病變肺泡結構破壞減輕，肺泡間隔斷裂情況稍好轉(zhuǎn)。見圖2。

圖2 膿毒癥模型小鼠肺部組織病理學改變(HE染色，20 × )Fig.2 Lung histopathological changes in mice of sepsis model (HE staining, 20 × )

3 CBD對膿毒癥小鼠血清炎癥因子水平的影響 在CLP模型建立48 h后處死實驗二各組小鼠獲取血清，檢測IL-1b、IFN-γ、TNF-α和IL-6，模型對照組與大麻二酚溶劑對照組間IL-1b、TNF-α和IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，IFN-γ水平有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；大麻二酚實驗組與模型對照組、大麻二酚溶劑對照組的IL-1b、IFN-γ、TNF-α和IL-6水平差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見圖3。

圖3 三組小鼠血清炎癥因子水平比較(bP＜0.05, aP＜0.01)Fig.3 Comparison of serum inflammatory factor levels in mice of sepsis model (bP＜0.05, aP＜0.01)

4 CBD對膿毒癥小鼠肝組織免疫細胞浸潤的改變 免疫熒光結果顯示，各組小鼠的肝組織中存在由細菌/病毒感染誘導病灶周圍形成的以CD8+T細胞浸潤為主的炎性細胞，伴隨CD4+T細胞和自然殺傷細胞的浸潤，共同構成了膿毒癥小鼠肝的免疫微環(huán)境。CD4+、CD8+T細胞的免疫熒光標記顯示，大麻二酚實驗組相比模型對照組和大麻二酚溶劑對照組，紅色熒光標記的CD4+、CD8+T細胞在肝組織中聚集更少，其中以CD8+T細胞更為明顯；大麻二酚實驗組小鼠肝中綠色熒光標記的NK細胞數(shù)量相比于兩對照組減少。見圖4。

圖 4 三組小鼠肝免疫細胞熒光圖像A：CD4+ T 細胞用紅色熒光染色標記，DAPI 用藍色熒光染色；B：CD8+ T 細胞用紅色熒光染色標記，DAPI 用藍色熒光染色；C：NK 細胞用綠色熒光染色標記，DAPI 用藍色熒光染色(比例尺：50 μm)Fig.4 Fluorescence images of liver immune cells in sepsis miceA: CD4+ T cells were labeled with red fluorescent staining, and DAPI was stained with blue fluorescent staining; B: CD8+ T cells were labeled with red fluorescent staining, and DAPI was stained with blue fluorescent staining; C: NK cells were labeled with green fluorescent staining, and DAPI was stained with blue fluorescent staining (Scale bar: 50 μm)

討 論

膿毒癥是宿主對感染性病原體的多方面反應，也可能會被內(nèi)源性因素放大。過去認為膿毒癥的發(fā)展過程可分為早期的全身炎癥反應期和后期的代償性抗炎反應期，以開始的高炎癥期為特征并在幾天內(nèi)演變?yōu)殚L時間的免疫抑制期，兩種時相序貫發(fā)生。而近期研究表明，促炎和抗炎反應在膿毒癥的早期同時發(fā)生，甚至出現(xiàn)混合性拮抗反應綜合征，區(qū)別在于全身炎癥反應期與代償性抗炎反應期分別在早期和晚期占據(jù)主導地位[14]。感染和急性損傷作為膿毒癥免疫過程的誘導因素，涉及急性期反應物的釋放，這些反應物是引起廣泛自主神經(jīng)、內(nèi)分泌、血液和免疫改變的直接介質(zhì)。盡管目的是出于對機體的保護，但失調(diào)的細胞因子分泌會導致大規(guī)模的炎癥級聯(lián)反應，導致可逆或不可逆的終末器官功能障礙甚至死亡[15]。過度的免疫反應可引起大量炎癥細胞壞死、凋亡或焦亡、中性粒細胞胞外陷阱形成等，可進一步使炎癥反應復雜化[16]。隨著膿毒癥進展機體促炎與抗炎的相互作用導致免疫功能紊亂，最終可能出現(xiàn)免疫麻痹，固有免疫功能麻痹表現(xiàn)為免疫細胞數(shù)量減少(樹突狀細胞、單核細胞、未成熟巨噬細胞、自然殺傷細胞廣泛凋亡)和免疫細胞功能下降(巨噬細胞失活、抗原遞呈能力低下等)[17]；特異性免疫功能依靠CD4+輔助性T淋巴細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞發(fā)揮作用，當CD4+T細胞處于大量促炎細胞因子的內(nèi)環(huán)境時，會向抗炎性的Th2細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化并分泌抑炎因子，導致Th1/Th2細胞比例失衡，類似的Th17/Tregs之間也可能出現(xiàn)比例失衡，從而引發(fā)免疫功能受損[18]。調(diào)節(jié)膿毒癥早期細胞因子的暴發(fā)式增長，盡可能早地抑制促炎因子的釋放(如IL-1b、 IFN-γ、TNF-α和IL-6)，使免疫過程相對平穩(wěn)，或許對于機體內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定具有重要意義。

本研究目的在于觀察CBD對膿毒癥小鼠生存情況和部分免疫功能的影響。過去有研究通過激活下丘腦視前區(qū)分布的內(nèi)源性大麻素Ⅰ型受體(CB1R)改善膿毒癥低血壓休克，并使用內(nèi)源性大麻素Ⅱ型受體(CB2R)激動劑HU308，顯著降低了IL-1b的釋放和可溶性黏附分子的水平，改善膿毒大鼠的免疫狀態(tài)[19]。而本研究重點關注的CBD

不同于CB1RCB2R的激動劑，除了可結合于內(nèi)源性大麻素受體，還可能存在對神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能的調(diào)節(jié)作用。本研究中膿毒癥小鼠生存率得到了改善，CBD組小鼠的一般狀態(tài)和生存率均優(yōu)于對照組；根據(jù)HE病理切片結果，CBD組小鼠的肺部病理損傷情況也得到了緩解；并且在檢測各組膿毒癥模型小鼠血清促炎細胞因子水平后發(fā)現(xiàn)，相比于模型對照組和大麻二酚溶劑對照組，CBD治療干預條件下的炎癥因子水平有統(tǒng)計學差異；此外CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷細胞在治療組的肝中熒光標記點也少于兩對照組。為后續(xù)研究使用CBD對膿毒癥的免疫失衡狀態(tài)進行干預治療提供有效依據(jù)。雖然有研究證明CBD對于慢性炎癥的抑制作用，但局限性在于CBD具體作用影響的機制十分復雜且具體作用途徑尚不明確，有待后續(xù)進一步研究。

本研究創(chuàng)新性在于采用高位盲腸結扎穿孔的重度動物模型，連續(xù)觀測小鼠生存狀態(tài)及相關數(shù)據(jù)，證實膿毒癥早期使用CBD對膿毒癥小鼠模型的治療效果。膿毒癥早期藥物干預的重點在于調(diào)節(jié)促炎和抗炎因子的平衡，防止過度炎癥反應可能導致的炎癥細胞焦亡、中性粒細胞外陷阱形成和大量細胞壞死。在CBD實驗組中，我們維持膿毒癥小鼠的血清炎癥因子處于較低水平，防止免疫細胞在肝組織中的過度激活和消耗，從而避免可能的免疫麻痹結局并維持穩(wěn)定的免疫狀態(tài)，驗證了CBD具有調(diào)控細菌或病毒感染所致的膿毒癥和全身炎癥反應綜合征的潛在應用價值。

綜上所述，膿毒癥病情嚴重與其免疫紊亂聯(lián)系密切，而目前對膿毒癥的治療仍有一定局限性，從規(guī)避免疫紊亂的角度出發(fā)盡早干預免疫功能或許能改善患者的預后和生存率，但目前缺乏合適的免疫監(jiān)測方法、具有整體性的免疫評價標準和效果顯著的免疫治療方案，還有需要更多、更深入的研究進一步指導臨床診療工作。