新型細胞外基質源性神經修復材料的制備與評價

韓 鋒，魏 帥，張 健，張宇軒，李超超，孟繁琪，管延軍，劉修志，許文靜，彭 江

1 河北北方學院，河北張家口 075000；2 解放軍總醫院 骨科研究所，北京 100853；3 天津大學天津醫院，天津 300211；4 解放軍醫學院，北京 100853；5 北京大學人民醫院 脊柱外科，北京 100044

周圍神經損傷及缺損在臨床上十分常見，而長段缺損的治療效果未達到令人滿意的程度。不同于中樞神經系統，周圍神經系統具有一定的再生能力。當神經缺損長度小于5 mm時，可通過一期端端吻合修復[1]。對于長段周圍神經缺損，自體神經移植是缺損修復的最佳治療方法[1]。但自體神經移植存在以下問題：1)可供移植的神經來源有限；2)供區造成二次損傷和功能缺失，近端可能形成痛性神經瘤；3)手術時間較長[2-3]。因此，尋找合適的自體神經替代移植物成為目前的研究重點。人工合成材料由于仿生程度不高，實際效果不如去細胞生物材料[3]。單純的同種異體去細胞神經移植修復材料投入臨床使用存在很多問題，受到材料來源困難、倫理等因素影響，不易實現標準化和產業化[3]。由于易于獲取、低免疫原性等優點，異種去細胞神經基質被認為是替代自體神經移植的一種選擇[4]。異種移植的免疫反應主要取決于髓鞘、軸突和脂肪的存在[5]，從而抑制移植物再生。傳統異種去細胞神經基質修復材料的制備方法：1)反復凍融等；2)化學洗滌 ；3)核酸酶降解[6-8]。然而，傳統制備方法對神經移植物內部脂肪的去除并不理想，導致移植物再生受抑制。近年來，脂肪提取方法[微波、超聲、酶和超臨界二氧化碳(supercritical carbon dioxide，scCO2)]在食品、農業和環境污染領域得到了廣泛應用[9-14]。相比其他去脂方法，scCO2萃取更高效、更安全環保。scCO2萃取使用處于臨界壓力和臨界溫度以上的二氧化碳流體作為萃取劑，從動植物組織中提取脂肪成分，再通過減壓、升溫等方式，達到分離提純的目的。本實驗在傳統制備方法的基礎上，增加scCO2萃取脂肪反應，從而減弱脂肪造成的免疫反應，促進移植物再生。實驗選用新鮮豬坐骨神經作為原材料，通過調整反復凍融次數及低毒性十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)去除神經中的髓鞘、軸突，通過scCO2去除神經內部的脂肪，從而更好地兼顧去除免疫原性和保存基底膜管結構完整性。通過物理性能測定(外觀和規格尺寸)、組織學觀察(HE染色、Laminin/DAPI免疫熒光染色和油紅O脂肪染色)、DNA含量測定和掃描電鏡觀察等方法評價制備效果。我們期望證明這種新型細胞外基質源性神經修復材料能夠去除免疫原性，替代自體神經移植物修復周圍神經缺損，并在不久的將來作為異種異體神經移植物重建人類缺損的周圍神經。

材料與方法

1 實驗試劑與設備 十二烷基硫酸鈉、Pig Laminin Antibody(Sigma公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、Goat Anti-Mouse IgG/SAlexa Fluor 594、HE試劑盒、改良油紅O染色液、封閉山羊血清(Solarbio公司)，QIAamp DNA純化mini試劑盒(Qiagen公司)，DAPI染色液(博士德生物公司)，定軌搖床(MO-10，Labsun公司)，Pannoramic Confocal 3DHISTEC全景共聚焦掃描系統(濟南丹吉爾電子有限公司)，Nikon ECLIPSE NI科研級正置熒光顯微鏡(Nikon公司)，CM1900冷凍切片機(Leica公司)，NanoPhotometer-NP80 Mobile超微量分光光度計(Implen公司)，真空冷凍干燥機(河南兄弟儀器設備有限公司)，雷磁PHB-4便攜式pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，HITACHI Regulus 8100掃描電鏡(武漢賽維爾生物科技有限公司)，HSFC-35-1-MC-EDU超臨界二氧化碳萃取裝置(大連卓爾高科技有限公司)。

2 神經修復材料的制備與分組 無菌條件下截取新鮮豬坐骨神經，直徑(4 ± 1) mm，長度5 cm。立即在顯微鏡下仔細剔除神經外脂肪、血管等結締組織或先放入-80℃冰箱中凍存，需要時再仔細剔除神經外脂肪、血管等結締組織，PBS液沖洗3 ～ 5遍，每遍10 min，隨機分入以下3組，每組30根。新鮮組：將剝除神經外脂肪、血管等結締組織的新鮮神經置于-20℃預冷5 h，然后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，作為對照組。0.5% SDS 48 h組：1)將剝離并剔除神經周圍的脂肪、血管等結締組織于-80℃條件下冷凍3 h，恢復室溫1 h，反復凍融3次；2)稱重SDS 3 g，溶于600 mL去離子純水中，配制成0.5% SDS溶液，濾紙過濾，高溫高壓消毒；3)取出坐骨神經置于50 mL離心管中，加入之前配制好的30 mL 0.5% SDS溶液，在室溫下利用定軌搖床震蕩48 h；4)將神經在4℃條件下于超聲儀中間歇處理3次，每次3 min，頻率為50 000 Hz；5)取出坐骨神經置于離心管中，在0.01 mol/L PBS中再次漂洗20次，每次4 ～ 6 h；6)將獲取的神經于-20℃預冷5 h，然后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h。0.5% SDS 48 h + scCO2組：1)重復0.5%SDS 48 h組制備的1 ～ 6步；2) 將獲取的神經在超臨界二氧化碳萃取儀中于30℃和5.5 MPa下進行脂肪萃取處理5 h。

3 神經修復材料的組織學觀察 將各組神經修復材料分別冰凍切片后行HE染色、Laminin/DAPI免疫熒光染色和油紅O脂肪染色，鏡下觀察照相。

4 神經修復材料的DNA含量測定 每組選取20根不同來源的凍干神經，充分剪碎混勻。每組稱取25 mg，按QIAamp DNA純化mini試劑盒步驟操作。吸取1 μL待測神經修復材料的DNA溶液置于分光光度計中，在260 nm波長下測定各組DNA溶液吸光度，根據公式換算為DNA濃度(ng/mg)。各組神經修復材料DNA含量測定實驗獨立重復3次。

5 神經修復材料的掃描電鏡觀察 將各組神經修復材料橫向切斷，分別固定于掃描電鏡的標本金屬底座上，置于離子濺射儀中對修復材料噴金，后對神經修復材料內部超微結構進行觀察并記錄拍照。

結 果

1 神經修復材料的大體觀察 新鮮豬坐骨神經為棕黃色，長5 cm，質地較致密。處理后的各組神經長度縮短至約4.5 cm，直徑稍增大，顏色呈乳白色半透明狀，神經大體輪廓仍完整，質地較新鮮神經疏松，神經外膜白色條紋結構消失；在空氣中無塌陷，較易黏著。0.5% SDS 48 h組與0.5% SDS 48 h + scCO2組間肉眼觀察未見明顯區別。見圖1。

圖1 三組神經修復材料的大體觀察Fig.1 General observation of nerve repair material in the three groups

2 神經修復材料的組織學觀察 1)神經修復材料的HE染色：新鮮組神經可觀察到藍色細胞核，神經束和周圍脂肪組織結構完整；0.5% SDS 48 h組未見藍色細胞核，神經束周圍脂肪組織結構稍破壞，神經束膜結構完整；0.5% SDS 48 h + scCO2組未見藍色細胞核，神經束周圍脂肪組織結構明顯破壞，神經束膜結構稍破壞(圖2)。2)神經修復材料的Laminin/DAPI染色：新鮮組可見完整的神經內膜管狀結構(紅色)及大量細胞核(藍色)；0.5% SDS 48 h組未見藍色細胞核，神經內膜管狀結構較完整；0.5% SDS 48 h + scCO2組未見藍色細胞核，神經內膜管狀結構稍破壞(圖3)。3)神經修復材料的油紅O脂肪染色：新鮮組神經束間脂肪(紅色)結構完整存在；0.5% SDS 48 h組神經束間脂肪(紅色)結構破壞，未見明顯減少；0.5%SDS 48 h + scCO2組神經束間脂肪(紅色)結構破壞，且明顯減少(圖4)。

圖2 三組神經修復材料的HE染色Fig.2 HE staining of nerve repair material in the three groups

圖3 神經修復材料的Laminin(紅色)/DAPI(藍色)染色Fig.3 Laminin (red) / DAPI (blue) staining of nerve repair material

圖4 三組神經修復材料的油紅O脂肪染色Fig.4 Oil red O staining images of nerve repair material in the three groups

3 神經修復材料的DNA含量測定 0.5% SDS處理新鮮豬坐骨神經48 h后，DNA含量下降(706.7 ng/mg降至59.6 ng/mg，P＜0.01)，scCO2萃取后DNA含量下降(59.6 ng/mg降至49.2 ng/mg，P＜0.05)。見圖5。

圖5 0.5% SDS及scCO2處理后移植物的DNA含量比較(aP ＜0.05；bP ＜ 0.01)Fig.5 Comparison of DNA content levels of the grafts after treatment between 0.5% SDS group and scCO2 group(aP ＜ 0.05; bP ＜ 0.01)

4 新型細胞外基質源性神經修復材料的掃描電鏡觀察 對各組神經修復材料內部分別行掃描電鏡觀察，可見新鮮組完整的神經內膜管狀結構及其包繞的髓鞘和軸突；0.5% SDS 48 h組和0.5% SDS 48 h + scCO2組均未見髓鞘和軸突，均有完整的神經內膜管狀結構。0.5% SDS 48 h組與0.5% SDS 48 h + scCO2組間掃描電鏡觀察未見明顯區別。見圖6。

圖6 掃描電鏡觀察三組神經修復材料的內部結構Fig.6 The internal structure of nerves in the three groups was observed by scanning electron microscope

討 論

周圍神經損傷及缺損是臨床常見病、多發病。目前長段周圍神經缺損的最佳治療方法是自體神經移植[1]。異種去細胞神經基質以其易獲取、低免疫原性等優點，成為替代自體神經移植的一

種選擇[4]。異種移植免疫反應主要取決于髓鞘、軸突和脂肪的存在，從而抑制移植物再生[5]。

傳統異種去細胞神經基質修復材料的制備方法如下。1)反復凍融：生物組織極易在反復降溫、復溫過程中受損傷(溶液凍結、融化及溶液滲透壓力變化等因素造成)，這種低溫損傷主要發生在0℃ ～ - 60℃范圍內，因此可以使生物組織反復通過該溫度范圍，破壞組織中的相容性抗原成分，從而降低其抗原性；2)化學洗滌：利用化學試劑去除生物組織中的細胞、可溶性糖胺和可溶性蛋白質等抗原物質，從而減弱其抗原性；3)核酸酶降解(如DNase和RNase)：通過水解磷酸二酯鍵分割核酸序列，使DNA和RNA被特異性降解，有利于從組織中清除[6-8]。但反復凍融會破壞細胞結構而不是實際去除細胞，同時會在一定程度上破壞神經基底膜管結構；去細胞化學試劑具有一定的化學毒性；核酸酶難以從組織中徹底清除，可能引起免疫反應[15]。除了上述問題，傳統制備方法對神經移植物內部脂肪的去除并不理想，從而抑制移植物再生。

近幾年，scCO2萃取脂肪以其高效、安全和環保等優點，開始逐步應用于動植物組織且效果顯著[16-17]。scCO2萃取使用處于臨界壓力和臨界溫度以上的二氧化碳流體作為萃取劑，從動植物組織中提取脂肪成分，再通過減壓、升溫等方式，達到分離提純的目的。與傳統化學萃取法相比，scCO2萃取有以下顯著優點。1)更高效：當飽含溶解物的二氧化碳流體流經分離器時，由于壓力下降使CO2與萃取物迅速產生氣液分離，萃取效率更高；2)更安全環保：CO2是惰性氣體，萃取過程不發生化學反應，且屬于不燃性氣體，無味、無臭、無毒；相對傳統萃取方式，scCO2萃取后不含殘留酶，不含殘留的有害溶劑，更安全更環保[18]。

本實驗將傳統神經修復材料制備方法與scCO2萃取結合，制備新型神經修復材料。大體觀察，本實驗處理后的各組神經，直徑稍增大、長度稍縮短(圖1)；HE染色、Laminin/DAPI染色和掃描電鏡顯示，既清除了髓鞘和軸突，又保留了層粘連蛋白和神經內膜管狀結構等有效成分和結構(圖2、圖3、圖6)，為移植物再生提供了必要的物質和結構基礎。此外，本實驗制備的神經修復材料有以下兩方面特點：1)油紅O脂肪染色顯示，scCO2萃取有效破壞神經束間的脂肪結構，去脂效果明顯(圖4)；scCO2萃取脂肪，進一步減輕免疫反應；2)去脂的同時，scCO2對去細胞有一定效果，經scCO2萃取DNA含量從59.6 ng/mg降至49.2 ng/mg(P＜0.05)(圖5)，達到安全標準(＜50 ng/mg)[12]。

本修復材料需進一步力學檢測、生物安全性及體內體外評價，以確認達到產品臨床標準，為下一步進入臨床應用提供安全性指標。

綜上所述，新型細胞外基質源性神經修復材料的制備方法相比傳統方法，去脂更徹底、更安全、更環保，進一步減弱免疫反應，從而更有效促進移植物再生。

2魯長風. 創傷性神經瘤組織微粒構建的組織工程神經移植物原位修復神經缺損的研究［D］. 北京：解放軍醫學院，2018.

4孫遜. 馬尾神經細胞外基質修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究［D］. 天津：南開大學，2015.