探討半夏-薏苡仁對PCPA失眠模型大鼠海馬食欲素及其受體和血清細胞因子的調控作用

王 亮，王學林，王 鵬，李 晨，諶盈帆，陳 旸，張 印，李紹旦，楊明會

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第六醫學中心 中醫醫學部，北京 100089

失眠癥以無法入睡、睡眠不足和睡眠質量差為特征，至20世紀初全球有9% ～ 15%的成人有失眠癥狀[1-2]。目前，失眠癥的發病機制尚不明確，鎮靜催眠藥物存在頭暈、乏力、戒斷反應、宿醉等局限性[3-5]。中醫治療失眠癥歷史悠久，且部分方劑的鎮靜催眠作用已被循證醫學所證實[6]。半夏秫米湯被稱為治療失眠癥“第一方”，其中半夏通過燥濕化痰、通陰運陽來治療失眠癥，秫米可用薏苡仁替代，通過健脾祛濕、調和陰陽來調節睡眠[7]。藥理學研究發現半夏和薏苡仁主要化合物包括黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇等[8]。研究表明半夏秫米湯(包括半夏、秫米)加減可有效改善失眠癥患者的睡眠質量，具有良好的安神助眠作用[9-10]。另有研究顯示海馬CA1神經元損傷與睡眠障礙等疾病相關[11]。食欲素(Orexin)可通過調節其受體來影響海馬神經元細胞凋亡[12-13]。半夏-薏苡仁治療失眠癥的作用機制鮮有報道。本研究旨在基于海馬Orexin介導的神經元細胞凋亡途徑，探討半夏-薏苡仁(BX-YYR)治療失眠癥的具體作用機制。

材料與方法

1 實驗動物 5周齡SPF級Wistar雄性大鼠90只，體質量(160±10) g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[動物合格證：SCXK(京)2019-0010]。實驗過程中，大鼠接受標準實驗室食物，適應環境溫度(25±2)℃、相對濕度50%±5%，12 h/12 h明暗循環，持續1周。本實驗經解放軍總醫院動物倫理委員會批準(2020-X16-102)。

2 主要儀器和試劑 地西泮片(北京益民藥業有限公司，批號：H11020898)；半夏(安徽普仁藥業有限公司，批號2107158)和薏苡仁(北京綠野藥業公司，批號20082401)由解放軍總醫院第一醫學中心中藥房提供并鑒定；PCPA (美國Sigma公司，批號1003164450)；戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)；4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA buffer總蛋白提取液、SG高純總RNA提取試劑盒、白細胞介素-6(interleukin-1，IL-6)酶聯免疫試劑盒(SG3066-96T)、IL-1β酶聯免疫試劑盒(SG2923-96T)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫試劑盒(SG3056-96T)、IL-2酶聯免疫試劑盒(SG3068-96T)和Orexin酶聯免疫試劑盒(SG3178-96T)由北京信諾金達生物科技有限公司提供；Orexin Receptor 1 Polyclonal Antibody(美 國ProteinTech公 司)；Rabbit Anti-Orexin Receptor 2 antibody (中 國Bioss公 司)；OX1R、OX2R引物和探針(美國Sangon公司)；電泳槽JY-SPFT、電泳儀JY300C、凝膠成像系統JY04S-3C(北京君意東方電泳設備有限公司)；分光光度計 (德國Eppendorf公司)；定量PCR檢測儀StepOnePLUS (美國Applied Biosystems公司)。

3 失眠大鼠造模和分組處理 75只造模大鼠根據文獻采用PCPA誘導失眠大鼠模型，腹腔注射PCPA(300 mg/kg)，1次/d，持續2 d[14]。在第2次腹腔注射PCPA 28 h后，觀察到失眠大鼠模型出現晝夜節律消失，白天持續活動不斷，興奮性和攻擊性增加，食欲下降，毛發暗淡和蓬亂。造模成功后將模型大鼠按隨機數字表法分為5組，每組15只，分別為模型組(M組)、地西泮組(D組)和BX-YYR低劑量組(ZL組)、中劑量組(ZM組)、高劑量組(ZH組)。正常組(N組)和M組均按10 mL/kg給予0.9%氯化鈉注射液灌胃。D組配置成0.83 mg/10 mL地西泮水溶液。半夏-薏苡仁(1∶2)按照常規方法代煎，分別濃縮至1.575 g/kg(ZL組)、3.15 g/kg(ZM組)和6.3 g/kg(ZH組)生藥濃度。各組均按10 mL/kg進行灌胃，共7 d。

4 實驗取材 取材前大鼠禁食12 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，3 h內離心并分離出血清。冰上解剖大鼠腦組織，立即在液氮中冷凍，-80℃下保存待測；另一部分用4%多聚甲醛固定腦組織，4℃避光保存待測。

5 行為學測試 戊巴比妥鈉翻正實驗：造模組隨機選15只大鼠和正常組15只大鼠以35 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，統計睡眠潛伏期與睡眠持續時間[15]。曠場實驗：第7天灌胃結束12 h后采用行為學軟件分析各組大鼠5 min內的總活動距離、進入中央格距離和修飾次數。整個行為學實驗過程中保持安靜，并及時清理曠場箱。

6 腦組織HE染色 腦冠狀位切片厚度3 μm，烘烤，脫蠟，蒸餾水沖洗1 min。入蘇木素染色液中浸染5 min，蒸餾水稍洗，鹽酸乙醇分色，水洗，蒸餾水返藍，入梯度乙醇脫水，二甲苯透明，加蓋玻片，中性樹膠封片。

7 免疫組化觀察海馬Bcl-2表達 腦組織石蠟切片脫蠟水化，嚴格按照DBA試劑盒說明書操作。具體步驟：3% H2O2封閉10 min，5% BSA封閉30 min。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DBA顯色。光學顯微鏡觀察海馬病理變化，Image J 6.0軟件對海馬進行半定量分析(100×)。

8 ELISA法檢測血清細胞因子和海馬Orexin 取血清和海馬組織勻漿，液氮研磨后，加PBS，離心，取上清備用。按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-2和Orexin水平，酶標儀測定各孔在450 nm處測吸光度值。

9 RT-PCR法檢測海馬OX1R和OX2R mRNA表達 在95℃下進行6 min變性，40個循環變性(95℃下30 s)、退火(50℃ ～ 55℃下1.5 min)和延伸(72℃下90 s)。所有實驗重復三次。以ACTB為內參基因，用2-△△Ct方法計算基因相對mRNA表達。見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab. 1 List of RT-PCR primers

10 Western blot法檢測海馬OX1R和OX2R蛋白表達 取約20 mg海馬組織，加入200 μL RIPA buffer，提取總蛋白。SDS-PAGE濃縮膠4%，分離膠12%，電泳，轉膜2 h。在常溫下封閉2 h，加入一抗室溫1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。二抗孵育1 h，TBST洗滌2次，最后TBS洗1次，每次10 min，然后暗室曝光檢測，采用Image J 6.0軟件分析條帶灰度。

11 統計學分析 采用SPSS22.0和Graphpad Prism 8.0.2軟件進行數據分析，統計結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 造模情況 與N組比較，造模組大鼠睡眠潛伏期顯著延長(P＜0.01)，造模組大鼠睡眠持續時間顯著縮短(P＜0.01)，證明PCPA失眠大鼠造模成功。見表2。

表2 戊巴比妥鈉翻正實驗(n=15)Tab. 2 Pentobarbital sodium correction test (n=15)

2 行為學比較 與N組比較，M組和ZL組大鼠活動總距離顯著降低(P均＜0.01)；與M組比較，ZM組和ZH組的總活動距離顯著增加(P均＜0.01)；與D組比較，ZM組活動總距離顯著增加(P＜0.01)。與N組比較，M組、D組、ZL組和ZM組大鼠活動進入中央格距離顯著增加(P均＜0.01)；與M組比較，D組、ZL組、ZM組和ZH組大鼠活動進入中央格距離顯著增加(P均＜0.01)；與D組比較，ZH組大鼠活動進入中央格距離減少(P＜0.05)。與N組比較，M組大鼠修飾次數顯著增加(P＜0.01)；與M組比較，D組、ZL組、ZM組和ZH組大鼠修飾次數顯著減少(P均＜0.05)。見表3、圖1。

圖1 每組大鼠運動軌跡平面圖Fig.1 Plane diagram of the rat movement track in each group

表3 各組大鼠曠場實驗行為學比較(n=15)Tab. 3 Behavioral comparison of rat open field experiment in each group (n=15)

3 各組大鼠海馬CA1區神經元病理變化 M組：海馬CA1區神經元形態與結構損傷比較嚴重，細胞層次變少，排列比較紊亂，分布不均勻，細胞間隙增大，存活細胞數目減少，細胞體皺縮變小，胞核固縮而深染，形狀不規則。D組：與M組相比，海馬CA1區神經元形態和結構損害相對減輕，細胞排列稍紊亂，層次增多，存活細胞數目增多，有少量細胞皺縮。ZL、ZM和ZH組：與M組相比，海馬CA1區神經元形態和結構損害相對減輕，細胞排列較規整，存活細胞數目增多，細胞體皺縮變小，細胞形狀規則。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區神經元病理變化Fig.2 Neuronal pathological changes of the rats hippocampus CA1 region in each group

4 免疫組化觀察各組大鼠腦組織海馬CA1區Bcl-2陽性信號面積 與N組比較，M組和ZL組大鼠海馬Bcl-2陽性信號面積占比顯著降低(P均＜0.05)。與M組比較，ZH組大鼠海馬Bcl-2陽性信號面積占比升高(P＜0.01)。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區Bcl-2陽性信號面積(免疫組化，100×)Fig.3 Hippocampal CA1 Bcl-2 positive signal area in each group(immunohistochemical map, 100×)

表4 各組大鼠海馬CA1區Bcl-2陽性信號面積占比比較(n=15)Tab. 4 Comparison of hippocampal CA1 Bcl-2 positive signal area in each group (n=15)

5 血清L-6、TNF-α、IL-1β、IL-2表達 ELISA檢測顯示，與N組比較，M組大鼠血清TNF-α水平顯著升高(P＜0.01)，ZM組大鼠血清TNF-α水平降低(P＜0.05)。與M組比較，D組和ZL、ZM、ZH組大鼠血清TNF-α顯著降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL組大鼠血清TNF-α水平顯著升高(P＜0.01)。與N組比較，M組IL-1β水平顯著升高(P＜0.01)，ZH組大鼠血清IL-1β水平降低(P＜0.05)。與M組比較，D組和ZL、ZM、ZH組大鼠血清IL-1β水平顯著降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL、ZM、ZH組大鼠血清IL-1β水平降低(P均＜0.05)。與N組比較，M組和ZL組大鼠血清IL-2水平顯著升高(P均＜0.01)。與M組比較，D組和ZL、ZM、ZH組大鼠血清IL-2水平顯著降低(P均＜0.05)。與D組比較，ZL組大鼠血清IL-2水平升高(P＜0.01)，與ZM、ZH組大鼠血清IL-2水平降低(P均＜0.05)。與N組比較，D組和ZL組大鼠血清IL-6水平顯著升高(P均＜0.01)。與M組比較，D組和ZL、ZM、ZH組大鼠血清IL-6水平顯著降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL組大鼠血清IL-6水平升高(P＜0.01)。見圖4。

圖4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-2、L-6水平(aP＜0.05, bP＜0.01, vs 正常組; cP＜0.05, dP＜0.01, vs 模型組; eP＜0.05, fP＜0.01, vs 地西泮組)Fig.4 The sera levels of TNF-α, IL-1β, IL-2 and L-6 in each group (aP＜0.05, bP＜0.01, vs N group; cP＜0.05, dP＜0.01, vs M group; eP＜0.05,fP＜0.01, vs D group)

6 血清和海馬Orexin表達 ELISA檢測顯示，與N組比較，M組、ZL組大鼠血清Orexin水平顯著升高(P均＜0.01)。與M組比較，D組和ZM、ZH組大鼠血清Orexin水平顯著降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL組大鼠血清Orexin水平顯著升高(P＜0.01)。與N組比較，M組、D組和ZL組大鼠海馬Orexin含量顯著升高(P均＜0.01)，ZH組大鼠海馬Orexin含量顯著降低(P＜0.01)。與M組比較，D組和ZL、ZM、ZH組大鼠海馬Orexin含量顯著降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL組大鼠海馬Orexin含量顯著升高(P＜0.01)，ZM、ZH組大鼠海馬Orexin含量降低(P均＜0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠血清和海馬Orexin水平(bP＜0.01, vs 正常組;dP＜0.01, vs 模型組; eP＜0.05, fP＜0.01, vs 地西泮組)Fig.5 The Orexin levels in serum and hippocampus of each group(bP＜0.01, vs N group; dP＜0.01, vs M group; eP＜0.05,fP＜0.01, vs D group)

7 海馬OX1R和OX2R mRNA表達 RT-PCR檢測顯示，與N組比較，M組海馬OX1R mRNA表達升高(P＜0.01)。與M組比較，D組、ZL、ZM、ZH組大鼠海馬OX1R mRNA表達降低(P均＜0.05)。與M組比較，ZL、ZM、ZH組大鼠海馬OX2R mRNA表達降低(P均＜0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠海馬OX1R和OX2R mRNA表達(bP＜0.01, vs 正常組; cP＜0.05, dP＜0.01, vs 模型組)Fig.6 The mRNA expression level of hippocampus OX1R and OX2R in each group (bP＜0.01, vs N group; cP＜0.05,dP＜0.01, vs M group)

8 海馬OX1R和OX2R蛋白表達 與N組比較，D組大鼠海馬OX1R表達升高(P＜0.01)，ZM組

和ZH組大鼠海馬OX1R表達明顯降低(P均＜0.01)。與M組比較，ZL、ZM和ZH組大鼠海馬OX1R表達降低(P均＜0.01)。與D組比較，ZL、ZM和ZH組大鼠海馬OX1R表達降低(P均＜0.01)。與N組比較，M組和ZM、ZH組大鼠海馬OX2R表達降低(P均＜0.05)。與M組比較，D組和ZL組大鼠海馬OX2R表達升高(P均＜0.05)。與D組比較，ZL、ZM、ZH組大鼠海馬OX2R表達降低(P均＜0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠海馬OX1R和OX2R蛋白表達情況(aP＜0.05,bP＜0.01, vs 正常組; cP＜0.05, dP＜0.01, vs 模型組; eP＜0.05,fP＜0.01, vs 地西泮組)Fig.7 The protein expression level of hippocampus OX1R and OX2R in each group (aP＜0.05, bP＜0.01, vs N group;cP＜0.05, dP＜0.01, vs M group; eP＜0.05, fP＜0.01, vs D group)

討 論

本研究選用半夏和薏苡仁治療失眠癥的思路源自中醫經典古籍。《溫病條辨》記載半夏秫米方中秫米可用薏苡仁替代，而半夏逐痰飲而和胃，薏苡仁能補陽明燥金之不及而滲其飲，飲退則胃和，寐可立至[16]。半夏與薏苡仁配伍體現一溫一寒、滋脾和胃，兩者合用治療失眠癥起到上下陰陽調和的作用[17]。現代藥理學研究發現，半夏主要成分包括黃酮類、脂肪酸、甘油脂類、有機酸類等，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁及鎮靜催眠作用[18-19]。薏苡仁含有大量三酰甘油類，其鎮靜安神作用與劑量呈正相關[20]。

本研究結果顯示，戊巴比妥鈉翻正實驗中失眠模型組大鼠睡眠潛伏期顯著延長，睡眠持續時間顯著縮短；曠場實驗中模型組大鼠5 min內總活動距離減少，進入中央格距離和修飾次數增加，說明模型大鼠對新環境的探究行為、焦慮和緊張度較高，半夏-薏苡仁在一定程度上緩解了這種情況。海馬CA1區神經元病理變化顯示造模組海馬CA1區神經元形態與結構損傷比較嚴重，而BXYYR各劑量組能改善海馬CA1區神經元結構。免疫組化顯示，與M組比較，ZH組大鼠海馬Bcl-2陽性信號面積占比升高。Bcl-2 是一種定位于線粒體膜的抑制細胞凋亡因子。研究發現硫化氫能通過減少凋亡細胞數量，激活Caspase-3、下調Bax表達、上調Bcl-2表達，起到預防睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)引起海馬損傷的作用[21]。研究表明刺激淋巴細胞褪黑激素受體會導致淋巴細胞產生IL-2[22]。

ELISA結果顯示，與M組相比，BX-YYR各劑量組可降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6等細胞因子水平。有研究表明IL-2具有多種免疫調節功能和生物學特性，可能與調節睡眠-覺醒、記憶功能、運動和神經內分泌軸有關[23]。研究發現，TNF-α、IL-2、IL-6和IL-1β等其他細胞因子的晝夜變化與睡眠關系密切[24-25]。睡眠減少能增加IL-6和TNF-α的分泌，且在睡眠、飲食等自主生命活動中TNF-α發揮著重要作用[26]。報道發現，IL-6和TNF-α會增加非快速眼動睡眠[27-28]。IL-1β是一種具有廣泛生物活性的炎癥因子，可間接反映睡眠狀態[29]。

本實驗結果顯示，BX-YYR可降低海馬Orexin及其受體OX1R的表達，升高受體OX2R表達。海馬體是學習記憶的主要功能區，炎癥反應會影響其功能。Orexin神經元廣泛分布于中樞神經系統，Orexin及其受體參與了重要的生理過程，如睡眠-覺醒、學習和記憶等過程[30-32]。阻斷Orexin信號通路會使睡眠-覺醒紊亂，且對哺乳動物的進食行為、神經內分泌功能、睡眠/喚醒周期和能量代謝等生理過程有重要影響[33-34]。2014年蘇沃雷生(Suvorexant)作為一種Orexin受體拮抗劑，首次被FDA批準用于治療失眠癥[35]。多項Meta分析和臨床試驗支持Suvorexant治療失眠癥的療效[36]。研究發現，Orexin通過與OX1R、OX2R結合激活下游信號通路，參與保護神經元[37]。Orexin神經元通過血清素受體5HT1A在調節睡眠/覺醒狀態中發揮著至關重要的作用[38]。另有研究發現SD大鼠的海馬體積縮小，結構受損，海馬Orexin、OX1R和OX2R表達增加，低劑量Orexin能提高神經元活力，而高劑量Orexin則減弱神經元活力[39]。

綜上所述，本研究發現BX-YYR能夠改善PCPA失眠模型大鼠的睡眠情況，同時調控血清TNF-α、IL-1β、IL-2、L-6水平，其作用機制可能與調控海馬Orexin及其受體OX1R、OX2R表達，上調Bcl-2表達，抑制海馬神經元細胞凋亡有關。本研究存在一定的局限性，Orexin如何通過其受體引起細胞凋亡還不明確，還需要進一步的實驗研究。